Identification of gene mutations and fusion genes in patients with Sézary Syndrome

Sézary syndrome is a leukemic form of cutaneous T-cell lymphoma with an aggressive clinical course. The genetic etiology of the disease is poorly understood, with chromosomal abnormalities and mutations in some genes being involved in the disease. The goal of our study was to understand the genetic basis of the disease by looking for driver gene mutations and fusion genes in 15 erythrodermic patients with circulating Sézary cells, 14 of them fulfilling the diagnostic criteria of Sézary syndrome. We have discovered genes that could be involved in the pathogenesis of Sézary syndrome. Some of the genes that are affected by somatic point mutations include ITPR1, ITPR2, DSC1, RIPK2, IL6, and RAG2, with some of them mutated in more than one patient. We observed several somatic copy number variations shared between patients, including deletions and duplications of large segments of chromosome 17. Genes with potential function in the T-cell receptor signaling pathway and tumorigenesis were disrupted in Sézary syndrome patients, for example, CBLB, RASA2, BCL7C, RAMP3, TBRG4, and DAD1. Furthermore, we discovered several fusion events of interest involving RASA2, NFKB2, BCR, FASN, ZEB1, TYK2, and SGMS1. Our work has implications for the development of potential therapeutic approaches for this aggressive disease

Combinació de tècniques citogenètiques en la leucèmia limfàtica crònica: estudi de l'heterogeneïtat dels pacients i aplicabilitat a la pràctica clínica

Un dels factors pronòstics més importants en la leucèmia limfàtica crònica (LLC) són les categories de risc citogenètic, basades en la detecció de del(13q), trisomia 12, del(11q) i del(17p) per hibridació in situ fluorescent (FISH). Aquests grups són alhora heterogenis, i s'han descrit altres alteracions recurrents de valor pronòstic incert no incloses als panells de FISH utilitzats. L'objectiu global de la tesi doctoral és realitzar la caracterització citogenètica dels pacients amb LLC i correlacionar les dades obtingudes amb el pronòstic d'aquests. Els primers treballs estudien la variabilitat entre els pacients amb LLC i deleció de 13q. El treball 1 compara les característiques dels pacients amb del(13q) monoal•èlica (13qx1) i bial•èlica (13qx2), o amb coexistència d'ambdós clons (13qM) d'una cohort de 627 pacients amb LLC i del(13q) aïllada per FISH. Es va demostrar que, malgrat no presentar diferències significatives al curs clínic, la mediana de nuclis alterats per FISH era superior als pacients amb 13qx2 i 13qM respecte al grup 13qx1, i que les pèrdues bial•èliques podien sorgir com a evolució clonal de les monoal•èliques. D'altra banda, el percentatge de del(13q) per FISH tenia un impacte significatiu al pronòstic. Es va concloure que el pronòstic associat a la del(13q) aïllada es pot estratificar segons el percentatge d'alteració per FISH, i que la pèrdua del segon al•lel de 13q no és suficient per aportar un pitjor pronòstic. El treball 2 s'ha centrat en l'impacte de la detecció d'alteracions de 13q per citogenètica convencional (CC). Es van comparar les característiques dels pacients amb alteracions de 13q14 al cariotip, 25 pacients amb translocacions [t(13q)] i 62 amb delecions intersticials [i-del(13q)], amb un grup de 295 pacients amb del(13q) únicament detectada per FISH [F-del(13q)]. Es van estudiar les alteracions incloses al panell de FISH rutina en LLC i les delecions de RB1. En total es van identificar 25 t(13q) diferents; totes mostraven deleció de D13S319, però només un 32% també presentava pèrdua de RB1. Les medianes de nuclis amb del(13q) dels grup t(13q) i i-del(13q), eren significativament superiors que la del F-del(13q). A més, els pacients amb t(13q) mostraven una incidència major de del(13q) bial•èliques i del(17p) concomitant. La taxa de pèrdua de RB1 era significativament superior al grup i-del(13q). Respecte a l’evolució clínica, el temps fins requerir tractament dels t(13q) i i-del(13q) era significativament més curt que als F-del(13q). En conclusió, l’anàlisi per CC als pacients amb del(13q) permet identificar un subgrup de pacients amb un curs clínic més agressiu. La segona part de la tesi, recollida al treball 3, pretén definir l’aplicabilitat a la pràctica clínica dels microarrays genòmics en la rutina diagnòstica de la LLC. Es van analitzar 70 pacients per microarrays, i es van comparar els resultats amb els obtinguts amb les tècniques utilitzades a la rutina diagnòstica, CC i FISH. La tècnica amb una major taxa de detecció d’alteracions van ser els microarrays. No obstant, els microarrays oferien una menor sensibilitat i no van detectar del(11q) o del(17) identificades per FISH en quatre pacients. A més, la significança clínica de les altres anomalies identificades microarrays no va poder ser demostrada. Es va concloure que l’anàlisi per microarrays és una tècnica vàlida per a l’estudi citogenètic en LLC, però que la completa substitució de la CC i el FISH a la pràctica clínica podia afectar negativament al maneig d’alguns pacients. Globalment, els resultats d’aquesta tesi demostren que l’aplicació combinada de diferents tècniques d’anàlisi citogenètic en LLC permet la identificació d’un ampli ventall d’anomalies, així com una millor caracterització de les alteracions incloses al panell de FISH de la LLC, que poden ser útils per a una millor estratificació pronòstica dels pacients amb LLC.One of the most important prognostic factors in chronic lymphocytic leukemia (CLL) are cytogenetic risk categories based on the detection of del(13q), trisomy 12, del(11q) and del(17p) by fluorescent in situ hybridization (FISH). However, they are heterogeneous and other alterations have been described. The aim was to perform a cytogenetic characterization of CLL patients and correlate the data with the prognosis. Two of the papers included in the thesis were focused on del(13q). The first analyzes 627 patients with isolated del(13q) by FISH, and compares those who carried monoallelic, biallelic or mosaicism of both 13q deletions. While no significant differences in the outcome was observed, the percentage of del(13q) by FISH had a significant impact on prognosis. In conclusion, del(13q) prognosis can be stratified according to the percentage by FISH, and the loss of the second 13q allele is not enough to trigger a worse outcome. In the second, we compared 25 patients with translocations [t(13q)] and 62 with interstitial deletions [i-del (13q)], with 295 patients with del(13q) only detected by FISH [F-del (13q)]. All the t(13q) showed deletion of the locus D135319, but only 32% also lost RB1. Significant differences in cytogenetic features were observed among groups, this could contribute to the significant shorter time to first treatment observed in t(13q) and i-del(13q) patients. In conclusion, a subgroup of 13q-patients with a poorer outcome can be identified by conventional cytoge n et ics (CC). The third paper compares CC, FISH and microarrays results from 70 patients. Microarray analysis obtained the highest abnormalities detection rate, but showed lower sensitivity and failed to detect some abnormalities identified by FISH. Moreover, clinical significance of other anomalies detected by microarrays could not be demonstrated. In conclusion, microarrays are valid for cytogenetic characterization in CLL. However, the complete replacement of the CC and FISH by microarrays in routine laboratories could negatively affect the management of some patients. Overall, the results show that the combined application of cytogenetic techniques in LLC allow the identification of a wide range of abnormalities, and a better characterization of alterations included in the CLL FISH panel, that may be useful for better prognostic stratification of CLL patients

Combinació de tècniques citogenètiques en la leucèmia limfàtica crònica: estudi de l'heterogeneïtat dels pacients i aplicabilitat a la pràctica clínica

[cat] Un dels factors pronòstics més importants en la leucèmia limfàtica crònica (LLC) són les categories de risc citogenètic, basades en la detecció de del(13q), trisomia 12, del(11q) i del(17p) per hibridació in situ fluorescent (FISH). Aquests grups són alhora heterogenis, i s'han descrit altres alteracions recurrents de valor pronòstic incert no incloses als panells de FISH utilitzats. L'objectiu global de la tesi doctoral és realitzar la caracterització citogenètica dels pacients amb LLC i correlacionar les dades obtingudes amb el pronòstic d'aquests. Els primers treballs estudien la variabilitat entre els pacients amb LLC i deleció de 13q. El treball 1 compara les característiques dels pacients amb del(13q) monoal•èlica (13qx1) i bial•èlica (13qx2), o amb coexistència d'ambdós clons (13qM) d'una cohort de 627 pacients amb LLC i del(13q) aïllada per FISH. Es va demostrar que, malgrat no presentar diferències significatives al curs clínic, la mediana de nuclis alterats per FISH era superior als pacients amb 13qx2 i 13qM respecte al grup 13qx1, i que les pèrdues bial•èliques podien sorgir com a evolució clonal de les monoal•èliques. D'altra banda, el percentatge de del(13q) per FISH tenia un impacte significatiu al pronòstic. Es va concloure que el pronòstic associat a la del(13q) aïllada es pot estratificar segons el percentatge d'alteració per FISH, i que la pèrdua del segon al•lel de 13q no és suficient per aportar un pitjor pronòstic. El treball 2 s'ha centrat en l'impacte de la detecció d'alteracions de 13q per citogenètica convencional (CC). Es van comparar les característiques dels pacients amb alteracions de 13q14 al cariotip, 25 pacients amb translocacions [t(13q)] i 62 amb delecions intersticials [i-del(13q)], amb un grup de 295 pacients amb del(13q) únicament detectada per FISH [F-del(13q)]. Es van estudiar les alteracions incloses al panell de FISH rutina en LLC i les delecions de RB1. En total es van identificar 25 t(13q) diferents; totes mostraven deleció de D13S319, però només un 32% també presentava pèrdua de RB1. Les medianes de nuclis amb del(13q) dels grup t(13q) i i-del(13q), eren significativament superiors que la del F-del(13q). A més, els pacients amb t(13q) mostraven una incidència major de del(13q) bial•èliques i del(17p) concomitant. La taxa de pèrdua de RB1 era significativament superior al grup i-del(13q). Respecte a l’evolució clínica, el temps fins requerir tractament dels t(13q) i i-del(13q) era significativament més curt que als F-del(13q). En conclusió, l’anàlisi per CC als pacients amb del(13q) permet identificar un subgrup de pacients amb un curs clínic més agressiu. La segona part de la tesi, recollida al treball 3, pretén definir l’aplicabilitat a la pràctica clínica dels microarrays genòmics en la rutina diagnòstica de la LLC. Es van analitzar 70 pacients per microarrays, i es van comparar els resultats amb els obtinguts amb les tècniques utilitzades a la rutina diagnòstica, CC i FISH. La tècnica amb una major taxa de detecció d’alteracions van ser els microarrays. No obstant, els microarrays oferien una menor sensibilitat i no van detectar del(11q) o del(17) identificades per FISH en quatre pacients. A més, la significança clínica de les altres anomalies identificades microarrays no va poder ser demostrada. Es va concloure que l’anàlisi per microarrays és una tècnica vàlida per a l’estudi citogenètic en LLC, però que la completa substitució de la CC i el FISH a la pràctica clínica podia afectar negativament al maneig d’alguns pacients. Globalment, els resultats d’aquesta tesi demostren que l’aplicació combinada de diferents tècniques d’anàlisi citogenètic en LLC permet la identificació d’un ampli ventall d’anomalies, així com una millor caracterització de les alteracions incloses al panell de FISH de la LLC, que poden ser útils per a una millor estratificació pronòstica dels pacients amb LLC.[eng] One of the most important prognostic factors in chronic lymphocytic leukemia (CLL) are cytogenetic risk categories based on the detection of del(13q), trisomy 12, del(11q) and del(17p) by fluorescent in situ hybridization (FISH). However, they are heterogeneous and other alterations have been described. The aim was to perform a cytogenetic characterization of CLL patients and correlate the data with the prognosis. Two of the papers included in the thesis were focused on del(13q). The first analyzes 627 patients with isolated del(13q) by FISH, and compares those who carried monoallelic, biallelic or mosaicism of both 13q deletions. While no significant differences in the outcome was observed, the percentage of del(13q) by FISH had a significant impact on prognosis. In conclusion, del(13q) prognosis can be stratified according to the percentage by FISH, and the loss of the second 13q allele is not enough to trigger a worse outcome. In the second, we compared 25 patients with translocations [t(13q)] and 62 with interstitial deletions [i-del (13q)], with 295 patients with del(13q) only detected by FISH [F-del (13q)]. All the t(13q) showed deletion of the locus D135319, but only 32% also lost RB1. Significant differences in cytogenetic features were observed among groups, this could contribute to the significant shorter time to first treatment observed in t(13q) and i-del(13q) patients. In conclusion, a subgroup of 13q-patients with a poorer outcome can be identified by conventional cytoge n et ics (CC). The third paper compares CC, FISH and microarrays results from 70 patients. Microarray analysis obtained the highest abnormalities detection rate, but showed lower sensitivity and failed to detect some abnormalities identified by FISH. Moreover, clinical significance of other anomalies detected by microarrays could not be demonstrated. In conclusion, microarrays are valid for cytogenetic characterization in CLL. However, the complete replacement of the CC and FISH by microarrays in routine laboratories could negatively affect the management of some patients. Overall, the results show that the combined application of cytogenetic techniques in LLC allow the identification of a wide range of abnormalities, and a better characterization of alterations included in the CLL FISH panel, that may be useful for better prognostic stratification of CLL patients

Leukemic involvement is a common feature in waldenström macroglobulinemia at diagnosis

Waldenström Macroglobulinemia (WM) is a lymphoplasmacytic lymphoma with bone marrow (BM) involvement and IgM monoclonal gammopathy. To date, no studies have focused specifically on peripheral blood (PB) involvement. In this study, 100 patients diagnosed with WM according to the World Health Organization (WHO) criteria were included based on the demonstration of MYD88mut in BM and the availability of PB multiparametric flow cytometry (MFC) analysis. Leukemic involvement by MFC was detected in 50/100 patients. A low percentage of mature small lymphocytes in PB smears was observed in only 15 cases. MYD88mut by AS-qPCR was detected in PB in 65/100 cases. In cases with leukemic expression by MFC, MYD88mut was detected in all cases, and IGH was rearranged in 44/49 cases. In 21/50 patients without PB involvement by MFC, molecular data were consistent with circulating disease (MYD88mut by AS-qPCR 3/50, IGH rearranged 6/50, both 12/50). Therefore, PB involvement by standard techniques was detected in 71/100 patients. MYD88mut was detected in PB by dPCR in 9/29 triple negative cases. Overall, 80% of the patients presented PB involvement by any technique. Our findings support the role of PB MFC in the evaluation of patients with IgM monoclonal gammopathy and provide reliable information on correlation with molecular features. The development of a feasible MFC assay may stand as an objective tool in the classification of mature B cell neoplasms presenting with IgM monoclonal gammopathy

Outcomes and molecular profile of oligomonocytic CMML support its consideration as the first stage in the CMML continuum

atients with oligomonocytic chronic myelomonocytic leukemia (OM-CMML) are currently classified according to the 2017 World Health Organization myelodysplastic syndromes classification. However, recent data support considering OM-CMML as a specific subtype of chronic myelomonocytic leukemia (CMML), given their similar clinical, genomic, and immunophenotypic profiles. The main purpose of our study was to provide survival outcome data of a well-annotated series of 42 patients with OM-CMML and to compare them to 162 patients with CMML, 120 with dysplastic type (D-CMML), and 42 with proliferative type (P-CMML). OM-CMML had significantly longer overall survival (OS) and acute myeloid leukemia-free survival than did patients with CMML, considered as a whole group, and when compared with D-CMML and P-CMML. Moreover, gene mutations associated with increased proliferation (ie, ASXL1 and RAS-pathway mutations) were identified as independent adverse prognostic factors for OS in our series. We found that at a median follow-up of 53.47 months, 29.3% of our patients with OM-CMML progressed to D-CMML, and at a median follow-up of 46.03 months, 28.6% of our D-CMML group progressed to P-CMML. These data support the existence of an evolutionary continuum of OM-CMML, D-CMML, and P-CMML. In this context, we observed that harboring more than 3 mutated genes, carrying ASXL1 mutations, and a peripheral blood monocyte percentage >20% significantly predicted a shorter time of progression of OM-CMML into overt CMML. These variables were also detected as independent adverse prognostic factors for OS in OM-CMML. These data support the consideration of OM-CMML as the first evolutionary stage within the proliferative continuum of CMML

Reduced expansion of CD94/NKG2C + NK cells in chronic lymphocytic leukemia and CLL-like monoclonal B-cell lymphocytosis is not related to increased human cytomegalovirus seronegativity or NKG2C deletions

Data de publicació electrònica: 22-02-2021Introduction: Dysregulated NK cell-mediated immune responses contribute to tumor evasion in chronic lymphocytic leukemia (CLL), although the NK cell compartment in CLL-like monoclonal B-cell lymphocytosis (MBL) is poorly understood. In healthy individuals, human cytomegalovirus (HCMV) induces the expansion of NK cells expressing high levels of CD94/NKG2C NK cell receptor (NKR) specific for HLA-E. Methods: We analyzed the expression of NKG2A, NKG2C, ILT2, KIR, CD161, and CD57 in 24 MBL and 37 CLL. NKG2C was genotyped in these patients and in 81 additional MBL/CLL, while NKG2C gene expression was assessed in 26 cases. In 8 CLL patients with increased lymphocytosis (≥20 × 109 /L), tumor HLA-E and HLA-G expression was evaluated. Results: NKR distribution did not significantly differ between MBL and CLL patients, although they exhibited reduced NKG2C+ NK cells compared with a non-CLL group (4.6% vs 12.2%, P = .012). HCMV+ patients showed increased percentages of NKG2C+ NK cells compared with HCMV- (7.3% vs 2.9%, P = .176). Frequencies of NKG2C deletions in MBL/CLL were similar to those of the general population. Low/undetectable NKG2C expression was found among NKG2C+/- (45%) and NKG2C+/+ (12%) patients. CLL cases with increased lymphocytosis displayed especially reduced NKG2C expression (1.8% vs 8.1%, P = .029) and tumor cells with high HLA-E (>98%) and variable HLA-G expression (12.4%, range: 0.5-56.4). CLL patients with low NKG2C expression (<7%) showed shorter time to first treatment (P = .037). Conclusion: Reduced percentages of CD94/NKG2C+ NK cells were observed in CLL and MBL patients independently of HCMV serostatus and NKG2C zygosity, particularly in CLL patients with increased lymphocytosis, which could potentially be related to the exposure to tumor cells