Caracterización genómica de la leucemia mieloblástica aguda: utilidad clínical del perfil molecular en el diagnóstico, pronóstico y monitorización terapéutica

[ES]Las alteraciones genéticas que afectan a los mecanismos normales de crecimiento, proliferación y diferenciación celular. Los hallazgos citogenéticos y moleculares han servido como marcadores diagnósticos para diversos subtipos de LMA dentro de la clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS), así como para establecer grupos de bajo, intermedio y alto riesgo (European LeukemiaNet), con claras diferencias a nivel de tasas de remisión completa, riesgo de recaída y supervivencia libre de enfermedad y global. Sin embargo, a pesar de cumplir los criterios recomendados para la categorización y el tratamiento de la LMA, los pacientes de un mismo subgrupo pueden tener una evolución clínica diferente. Este es el caso de la LMA de riesgo favorable, en la que no todos los pacientes presentan realmente un buen pronóstico. De hecho, hasta un 40% de los pacientes con LMA‐CBF termina recayendo, la mitad de los pacientes con mutaciones en NPM1 sufren recaída durante los 4 primeros años y las mutaciones bialélicas en CEBPα no evitan una tasa de recaída del 44%. En cuanto a las LPA, pese a las notables mejorías gracias a su tratamiento dirigido, aún aparecen casos que presentan resistencia o recaídas y, aunque se han encontrado mutaciones en los genes implicados en la fusión (PML y RARα) en casos de progresión, el perfil de aberraciones genéticas asociado a los tres subgrupos de LPA con distinto riesgo (score basado en cifras de plaquetas y leucocitos) aún no ha sido definido. Hoy en día, existe un creciente interés en detectar en un único test de secuenciación masiva (NGS) toda la variedad de alteraciones con valor diagnóstico y pronóstico en las LMA (mutaciones, traslocaciones/inversiones y variaciones en el número de copias). Sin embargo, son pocos los trabajos que estudian además de mutaciones génicas, el resto de alteraciones de las LMA, ya que todavía existen limitaciones técnicas para la detección de reordenamientos, por lo que los métodos convencionales continúan siendo imprescindibles. Para poder aplicar la técnica de NGS al estudio de estas alteraciones cromosómicas es necesario mejorar el diseño de los paneles y sobre todo simplificar el análisis informático de modo que pueda incorporarse a la práctica rutinaria del laboratorio clínico. Por otra parte, las mutaciones encontradas en las LMA no son solo adquiridas o somáticas, sino que también pueden presentarse en la línea germinal, dando lugar a casos de LMA familiares. Gracias al uso creciente de las nuevas tecnologías de NGS, se van descubriendo cada vez más hemopatías malignas heredables y genes responsables de ello, habiéndose descrito varios síndromes de predisposición familiar. De hecho, estos hallazgos clínico‐genéticos se recogen ya en la última clasificación de la OMS (2016), donde se ha incorporado una nueva categoría diagnóstica provisional que engloba los tumores mieloides hereditarios. No obstante, la investigación sobre LMA familiar a nivel molecular sigue siendo limitada. Aunque se han descrito casos con mutaciones en CEBPα o GATA2 y casos de trastorno plaquetario familiar con predisposición a LMA con mutaciones en RUNX1, es difícil una caracterización molecular completa con las técnicas convencionales, así como la monitorización correcta de los familiares sanos. Por último, la detección de enfermedad mínima residual (EMR) constituye uno de los factores pronósticos post‐tratamiento más importantes a la hora de tomar decisiones terapéuticas, ya que la ausencia de EMR aún no se ha traducido en la predicción inequívoca de curación de la enfermedad. Hay que destacar que solo el 40‐60% de los pacientes con LMA tienen un marcador de EMR robusto cuantificable por PCR, por lo que existe un número importante de pacientes en los cuales es imposible la monitorización molecular de la enfermedad. En este contexto, nos proponemos confirmar las siguientes hipótesis: 1. La variabilidad en la evolución de la LMA de bajo riesgo genético se debe a las características biológicas del clon tumoral: presencia de mutaciones o expresión anómala de diferentes genes. Un estudio genómico y de expresión génica de la LMA de bajo riesgo, permitirá esclarecer las posibles alteraciones responsables del comportamiento más agresivo de la enfermedad en dicho subgrupo. 2. El análisis genómico para la detección simultánea de reordenamientos cromosómicos y mutaciones somáticas de las LMA mediante un único panel de secuenciación masiva, permitirá demostrar sus ventajas sobre las técnicas citogenéticas y moleculares convencionales. Su implementación en el laboratorio clínico constituirá una estrategia innovadora para mejorar el manejo de los pacientes. 3. El empleo de paneles de NGS dirigidos es útil para analizar las mutaciones en genes relacionados con predisposición genética en los casos de LMA familiar, permitiendo la identificación de miembros en riesgo o afectados dentro de una familia. Además, se podrá determinar el origen germinal de la enfermedad y así plantear una estrategia terapéutica adaptada en la que se elimine la opción de trasplante alogénico emparentado. 4. El estudio de la sobreexpresión de los genes WT1, PRAME y BAALC en la monitorización de EMR resultará útil en los pacientes en los que no se dispone de un marcador fiable para seguimiento. Las conclusiones derivadas de los resultados obtenidos fueron las siguientes: PRIMER TRABAJO — En relación con la caracterización molecular de las LMA de bajo riesgo genético (LPA, LMA‐CBF, LMA‐NPM1 y LMA‐biCEBPΑ): 1. El estudio de expresión génica mediante tarjetas microfluídicas es útil para identificar pacientes con alteraciones citogenéticas/moleculares de bajo riesgo, permitiendo discriminar los distintos subgrupos con gran precisión. 2. El análisis mediante secuenciación masiva dirigida permitió determinar que las categorías funcionales de genes y su frecuencia de mutación difieren entre los subgrupos de LMA de bajo riesgo, lo que refleja procesos leucemogénicos distintos. Cabe destacar la alta incidencia de mutaciones en los genes implicados en metilación del ADN en las LMA‐NPM1, encontrándose mutados en el 80% de los pacientes. 3. La presencia de ciertas alteraciones moleculares puede explicar la evolución más agresiva de algunos pacientes de bajo riesgo, como la sobreexpresión de CD34 y las mutaciones en los genes de splicing en las LMA‐NPM1, así como las mutaciones en los genes de las cohesinas en las LMACBF. Sin embargo, el factor pronóstico con mayor valor es el número de mutaciones génicas al diagnóstico, independientemente de los genes implicados. 4. En nuestra serie, las mutaciones de sobreactivación de genes de la vía RAS al diagnóstico tienen una influencia negativa en la supervivencia libre de recaída de los pacientes con LMA‐CBF y LPA de bajo riesgo. De confirmarse estos datos, se podrían plantear nuevos enfoques en el tratamiento y monitorización terapéutica de estas LMA. 5. El perfil mutacional de las LPA difiere entre los tres grupos con distinto riesgo, clasificados según las cifras de leucocitos y plaquetas, observándose una mayor incidencia de FLT3‐ITD en el grupo de alto riesgo. SEGUNDO TRABAJO — En relación con la nueva estrategia de secuenciación masiva para la detección de reordenamientos y mutaciones en LMA: 1. La estrategia de NGS basada en captura desarrollada y validada en el presente trabajo permite analizar en un solo test tanto las mutaciones puntuales como los reordenamientos (traslocaciones e inversiones) que afectan recurrentemente a las células leucémicas, lo que supone un avance en el diagnóstico de precisión de estas enfermedades. 2. La metodología de NGS basada en captura se postula como futura técnica de elección para una caracterización completa de la enfermedad al diagnóstico, ya que además de presentar alta concordancia con las técnicas convencionales, identifica otras alteraciones no detectadas por las mismas, como las traslocaciones t(1;17)‐IRF2BP2/RARA y la t (3;21)‐RUNX1/LRRC34, no descritas hasta la fecha. 3. El algoritmo de libre acceso Lumpy resulta el más adecuado y fiable para la identificación de traslocaciones e inversiones en datos de NGS. Sin embargo, es necesario implementar herramientas bioinformáticas de análisis más eficaces y sencillas para el laboratorio clínico de rutina. TERCER TRABAJO — En relación con el análisis genético de la LMA familiar: 1. La incorporación de la NGS en la práctica clínica constituye una herramienta muy valiosa para mejorar el diagnóstico molecular en los casos de LMA familiar. 2. Las alteraciones germinales en el gen RUNX1 son un factor de predisposición a LMA, sin embargo, no son suficientes para la leucemogénesis, siendo necesarias mutaciones en genes adicionales, como TP53, para desarrollar el proceso maligno. 3. Existen casos de LMA familiar con mutaciones en RUNX1 sin antecedentes de trombopenia, en los que el estudio genético resulta de especial interés para asegurar un diagnóstico preciso y evitar la opción de trasplante alogénico emparentado. CUARTO TRABAJO — En relación con la sobreexpresión de WT1, PRAME y BAALC como marcadores de enfermedad mínima residual (EMR) en pacientes con LMA no promielocítica: 1. La cuantificación de la expresión de WT1, PRAME o BAALC tras el tratamiento de inducción en pacientes en remisión completa permite identificar pacientes con un riesgo de recaída significativamente mayor, lo que sugiere la necesidad de una monitorización más estrecha de los casos positivos. 2. En los pacientes sometidos a trasplante de progenitores hematopoyéticos, el estudio de PRAME en muestras previas y el de WT1 en muestras posteriores al trasplante (día +100), permite seleccionar un grupo de pacientes con un riesgo de recaída significativamente más alto. 3. La cuantificación de los niveles de WT1, PRAME y BAALC, además de los marcadores estándar (NPM1 mutado o tránscrito de fusión), permitieron la detección precoz de más del 90% de las recaídas analizadas, siendo WT1 el marcador con mayor tasa de falsos negativos. 4. La sobreexpresión de WT1, PRAME y BAALC es estable entre el diagnóstico y la recaída y su evolución es comparable con la de otros marcadores estándar, por lo que pueden emplearse para la detección de EMR en pacientes que no disponen de un marcador robust

Focal adhesion genes refine the intermediate-risk cytogenetic classification of acute myeloid leukemia

© 2018 by the authors.In recent years, several attempts have been made to identify novel prognostic markers in patients with intermediate-risk acute myeloid leukemia (IR-AML), to implement risk-adapted strategies. The non-receptor tyrosine kinases are proteins involved in regulation of cell growth, adhesion, migration and apoptosis. They associate with metastatic dissemination in solid tumors and poor prognosis. However, their role in haematological malignancies has been scarcely studied. We hypothesized that PTK2/FAK, PTK2B/PYK2, LYN or SRC could be new prognostic markers in IR-AML. We assessed PTK2, PTK2B, LYN and SRC gene expression in a cohort of 324 patients, adults up to the age of 70, classified in the IR-AML cytogenetic group. Univariate and multivariate analyses showed that PTK2B, LYN and PTK2 gene expression are independent prognostic factors in IR-AML patients. PTK2B and LYN identify a patient subgroup with good prognosis within the cohort with non-favorable FLT3/NPM1 combined mutations. In contrast, PTK2 identifies a patient subgroup with poor prognosis within the worst prognosis cohort who display non-favorable FLT3/NPM1 combined mutations and underexpression of PTK2B or LYN. The combined use of these markers can refine the highly heterogeneous intermediate-risk subgroup of AML patients, and allow the development of risk-adapted post-remission chemotherapy protocols to improve their response to treatment.Pallarès, VictorThis work was supported by Instituto de Salud Carlos III (Co-funding from FEDER) [CD13/00074 to V.P., PI15/00378 and PIE15/00028 to R.M., FIS PI17/01246, RD12/0036/0071 and FIS PI14/00450 to J.S., RD12/0036/0069 to M.G.., ISCIII-PS13/1640 and PI16/0665 to E.B., and RD12/0036/0014 and PIE13/00046 to M.A.S.] CIBERONC [CB16/12/00284 to M.A.S.]; CIBER-BBN [CBV6/01/1031 and Nanomets3 to R.M.]; AGAUR [2017 FI_B 00680 to A.F.; 2017-SGR-865 and 2014PROD0005 to R.M. and 2014-SGR-1281 to J.S.]; Fundació La Marató TV3 [416/C/2013-2030 to R.M., 100830/31/32 to J.S., M.G.. and M.A.S.]; Josep Carreras Leukemia Research Institute [P/AG 2017 to R.M.]; Spanish Health Research Program [PI12/02321 to M.G..]; Spanish Association Against Cancer (AECC) [to M.C.C.]; a grant from the Cellex Foundation, Barcelona [to J.S.]; a grant from La Generalitat de Catalunya (PERIS) [SLT002/16/00433 to J.S.]; and a grant from Fundación Española de Hematología y Hemoterapia (FEHH) [to V.P.]

Interlaboratory analytical validation of a Next-generation sequencing strategy for clonotypic assessment and minimal residual disease monitoring in multiple myeloma

[Context]: Minimal residual disease (MRD) is a major prognostic factor in multiple myeloma, although validated technologies are limited. [Objective]: To standardize the performance of the LymphoTrack next-generation sequencing (NGS) assays (Invivoscribe), targeting clonal immunoglobulin rearrangements, in order to reproduce the detection of tumor clonotypes and MRD quantitation in myeloma. [Design]: The quantification ability of the assay was evaluated through serial dilution experiments. Paired samples from 101 patients were tested by LymphoTrack, using Sanger sequencing and EuroFlow's next-generation flow (NGF) assay as validated references for diagnostic and follow-up evaluation, respectively. MRD studies using LymphoTrack were performed in parallel at 2 laboratories to evaluate reproducibility. [Results]: Sensitivity was set as 1.3 tumor cells per total number of input cells. Clonality was confirmed in 99% and 100% of cases with Sanger and NGS, respectively, showing great concordance (97.9%), although several samples had minor discordances in the nucleotide sequence of rearrangements. Parallel NGS was performed in 82 follow-up cases, achieving a median sensitivity of 0.001%, while for NGF, median sensitivity was 0.0002%. Reproducibility of LymphoTrack-based MRD studies (85.4%) and correlation with NGF (R2 > 0.800) were high. Bland-Altman tests showed highly significant levels of agreement between flow and sequencing. [Conclusions]: Taken together, we have shown that LymphoTrack is a suitable strategy for clonality detection and MRD evaluation, with results comparable to gold standard procedures. Multiple myeloma (MM) is a plasma-cell dyscrasia characterized by the accumulation of plasma cells in the bone marrow that produces an excess of clonal immunoglobulins (M-protein or monoclonal component).1 New treatment approaches have increased the number of patients achieving complete response (CR),2–5 progressively improving progression-free and overall survival rates in the last 10 years.6–11 Nonetheless, the presence of low levels of drug-resistant cells (known as minimal residual disease, MRD)12–14 that remain undetected by conventional serologic and morphologic methods explains frequent relapses with this disease, which is still considered an incurable illness.Minimal residual disease is currently considered one of the most informative prognostic parameters, since those patients with undetectable disease have shown prolonged survival rates as compared with MRD-positive patients,15–17 and this difference is still significant even when patients achieving only stringent complete response (sCR) are taken into account.18 The International Myeloma Working Group (IMWG) defined MRD positivity as the persistence of clonal malignant plasma cells assessed with a sensitivity of at least 10−5 (1 malignant cell per hundred thousand normal cells)19 ; therefore, MRD should be monitored with only highly sensitive methods. To date, 3 different approaches have been tested for MRD monitoring in hematologic malignancies: immunophenotypic (multiparametric flow cytometry [MFC]),20 molecular (quantitative polymerase chain reaction [PCR], next-generation sequencing [NGS], digital PCR),21–23 and imaging tools (positron emission tomography–computed tomography; magnetic resonance imaging).24,25 However, in MM standardization has been achieved only for MFC26 and NGS.27,28 As a result, the IMWG recommended the use of highly sensitive, standardized flow and sequencing approaches,19 including EuroFlow's next-generation flow (NGF)29 and Adaptive Biotechnologies' ClonoSEQ solutions (Adaptive Biotechnologies, Seattle, Washington). NGF is a 2-tube, 8-color flow assay that allows the simultaneous analysis of 10 million cells, providing a sensitivity of around 2·10−6.This work was partially supported by the Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Spanish Ministry of Economy and Competitiveness PI15/01956, CIBERONC-CB16/12/00233, and “Una manera de hacer Europa” (Innocampus; CEI-2010-1-0010). García-Álvarez, Prieto-Conde, and Jiménez were supported by the Fundación Española de Hematología y Hemoterapia (FEHH, cofunded by Fundación Cris in the latter case), Medina by the European Social Fund through the University of Salamanca and the ISCIII (FI19/00320), and Sarasquete by the ISCIII (CPII18/00028). All Spanish funding is cosponsored by the European Union FEDER program

Molecular profiling of immunoglobulin heavy-chain gene rearrangements unveils new potential prognostic markers for multiple myeloma patients

Multiple myeloma is a heterogeneous disease whose pathogenesis has not been completely elucidated. Although B-cell receptors play a crucial role in myeloma pathogenesis, the impact of clonal immunoglobulin heavy-chain features in the outcome has not been extensively explored. Here we present the characterization of complete heavy-chain gene rearrangements in 413 myeloma patients treated in Spanish trials, including 113 patients characterized by next-generation sequencing. Compared to the normal B-cell repertoire, gene selection was biased in myeloma, with significant overrepresentation of IGHV3, IGHD2 and IGHD3, as well as IGHJ4 gene groups. Hypermutation was high in our patients (median: 8.8%). Interestingly, regarding patients who are not candidates for transplantation, a high hypermutation rate (≥7%) and the use of IGHD2 and IGHD3 groups were associated with improved prognostic features and longer survival rates in the univariate analyses. Multivariate analysis revealed prolonged progression-free survival rates for patients using IGHD2/IGHD3 groups (HR: 0.552, 95% CI: 0.361−0.845, p = 0.006), as well as prolonged overall survival rates for patients with hypermutation ≥7% (HR: 0.291, 95% CI: 0.137−0.618, p = 0.001). Our results provide new insights into the molecular characterization of multiple myeloma, highlighting the need to evaluate some of these clonal rearrangement characteristics as new potential prognostic markers

Comprehensive analysis and insights gained from long-term experience of the Spanish DILI Registry

Background & aims: Prospective drug-induced liver injury (DILI) registries are important sources of information on idiosyncratic DILI. We aimed to present a comprehensive analysis of 843 patients with DILI enrolled into the Spanish DILI Registry over a 20-year time period. Methods: Cases were identified, diagnosed and followed prospectively. Clinical features, drug information and outcome data were collected. Results: A total of 843 patients, with a mean age of 54 years (48% females), were enrolled up to 2018. Hepatocellular injury was associated with younger age (adjusted odds ratio [aOR] per year 0.983; 95% CI 0.974-0.991) and lower platelet count (aOR per unit 0.996; 95% CI 0.994-0.998). Anti-infectives were the most common causative drug class (40%). Liver-related mortality was more frequent in patients with hepatocellular damage aged ≥65 years (p = 0.0083) and in patients with underlying liver disease (p = 0.0221). Independent predictors of liver-related death/transplantation included nR-based hepatocellular injury, female sex, higher onset aspartate aminotransferase (AST) and bilirubin values. nR-based hepatocellular injury was not associated with 6-month overall mortality, for which comorbidity burden played a more important role. The prognostic capacity of Hy's law varied between causative agents. Empirical therapy (corticosteroids, ursodeoxycholic acid and MARS) was prescribed to 20% of patients. Drug-induced autoimmune hepatitis patients (26 cases) were mainly females (62%) with hepatocellular damage (92%), who more frequently received immunosuppressive therapy (58%).The present study has been supported by grants of Instituto de Salud Carlos III cofounded by Fondo Europeo de Desarrollo Regional – FEDER (contract numbers: PI19/00883, PI16/01748, PI18/00901, PI18/01804, PI-0285-2016, PI-0274-2016, PI-0310- 2018, PT17/0017/0020) and Agencia Española del Medicamento. CIBERehd and Plataforma ISCIII Ensayos Clinicos are funded by Instituto de Salud Carlos III. MRD holds a Joan Rodes (JR16/ 00015)/Acción B clinicos investigadores (B-0002-2019) and JSC a Rio Hortega (CM17/00243) research contract from ISCIII and Consejería de Salud de Andalucía. The funding sources had no involvement in the study design; in the collection, analysis, and interpretation of data; in the writing of the report or in the de- cision to submit the manuscript for publication

Prediction of peripheral neuropathy in multiple myeloma patients receiving bortezomib and thalidomide: a genetic study based on a single nucleotide polymorphism array

GEM (Grupo Español de MM)/PETHEMA (Programa para el Estudio de la Terapéutica en Hemopatías Malignas) cooperative study group.Bortezomib- and thalidomide-based therapies have significantly contributed to improved survival of multiple myeloma (MM) patients. However, treatment-induced peripheral neuropathy (TiPN) is a common adverse event associated with them. Risk factors for TiPN in MM patients include advanced age, prior neuropathy, and other drugs, but there are conflicting results about the role of genetics in predicting the risk of TiPN. Thus, we carried out a genome-wide association study based on more than 300 000 exome single nucleotide polymorphisms in 172 MM patients receiving therapy involving bortezomib and thalidomide. We compared patients developing and not developing TiPN under similar treatment conditions (GEM05MAS65, NCT00443235). The highest-ranking single nucleotide polymorphism was rs45443101, located in the PLCG2 gene, but no significant differences were found after multiple comparison correction (adjusted P =.1708). Prediction analyses, cytoband enrichment, and pathway analyses were also performed, but none yielded any significant findings. A copy number approach was also explored, but this gave no significant results either. In summary, our study did not find a consistent genetic component associated with TiPN under bortezomib and thalidomide therapies that could be used for prediction, which makes clinical judgment essential in the practical management of MM treatment.This work has been partially supported by grants of the Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (CP13/00080), ISCIII (PI12/02311), Red Temática de Investigación Cooperativa en Cáncer (RD12/0036/0069) (RD12/0036/0061), Ministerio de Economía y Competitividad/ Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) “Una manera de hacer Europa” (Innocampus; CEI‐2010‐1‐0010), Asociación Española Contra el Cancer (GCB120981SAN), and Joan Rodes (JR 14/00016). M.E.S. is supported by the Miguel Servet program (CP13/00080) of the ISCIII (Ministerio de Economía y Competitividad).Peer Reviewe

Assessment of the clinical utility of four NGS panels in myeloid malignancies. Suggestions for NGS panel choice or design

The diagnosis of myeloid neoplasms (MN) has significantly evolved through the last few decades. Next Generation Sequencing (NGS) is gradually becoming an essential tool to help clinicians with disease management. To this end, most specialized genetic laboratories have implemented NGS panels targeting a number of different genes relevant to MN. The aim of the present study is to evaluate the performance of four different targeted NGS gene panels based on their technical features and clinical utility. A total of 32 patient bone marrow samples were accrued and sequenced with 3 commercially available panels and 1 custom panel. Variants were classified by two geneticists based on their clinical relevance in MN. There was a difference in panel¿s depth of coverage. We found 11 discordant clinically relevant variants between panels, with a trend to miss long insertions. Our data show that there is a high risk of finding different mutations depending on the panel of choice, due both to the panel design and the data analysis method. Of note, CEBPA, CALR and FLT3 genes, remains challenging the use of NGS for diagnosis of MN in compliance with current guidelines. Therefore, conventional molecular testing might need to be kept in place for the correct diagnosis of MN for now

Genetic complexity impacts the clinical outcome of follicular lymphoma patients

© The Author(s) 2021.Follicular lymphoma (FL) is the second most common non-Hodgkin lymphoma (NHL, 20–30%) after diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). Despite the introduction of rituximab and the high response rate to first-line treatment, approximately 20% of the FL patients relapse or progress within 2 years of receiving first-line therapy. Therefore, the major challenge is finding biomarkers that identify high-risk patients at diagnosis.This work was partially supported by the Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Spanish Ministry of Economy and Competitiveness PI15/01393, PI18/00410, CIBERONC-CB16/12/00233, and “Una manera de hacer Europa” (Innocampus; CEI-2010-1-0010)”, the Education Council or Health Council of the Junta de Castilla y León (CAS102P17, GRS 1180/A/15), Spanish Association Against Cancer (AECC; PROYE18020BEA), and Gilead Sciences (GLD17/00334). CJ, MES, and AMe are supported by the ISCII (CD19/00030, CPII18/00028, and FI19/00320). MGA, IPC, and CJ were supported by the Spanish Society of Hematology Foundation (FEHH). All Spanish funding is co-sponsored by the European Union FEDER program