Etude de mécanismes moléculaires et de lois physiques qui régissent l'auto-organisation des microtubules en réseaux ordonnés et complexes in vitro

Le cytosquelette de microtubule (MT) est essentiel dans de nombreux processus cellulaire. Il est notamment impliqué dans le trafic intracellulaire, la division cellulaire, la modification et le maintien de la forme de la cellule. En fonction du type cellulaire ou de son état de différenciation, les réseaux de MTs vont adopter des architectures différentes. Ces organisations sont définies par des contraintes géométriques intracellulaires et l'activité moléculaire de nombreuses protéines associées aux MTs (MAPs). Parmi ces protéines, des membres de la famille des MAP65s ont été identifiés. In vitro, elles forment des ponts entre les MTs pour les organiser en faisceaux. Le but de mon travail de thèse a été d'étudier in vitro le rôle de MAP65s dans l'auto-organisation d'un réseau de faisceaux de MTs. Dans un premier temps, j'ai mis au point un système biomimétique utilisant la technique de micro-patterning qui imposent une géométrie d'assemblage pour les MTs dans des limites qui se rapprochent de celles observées dans les cellules. Cette méthode permet de contrôler précisément l'assemblage des MTs à partir de zones dont les formes, la taille et la distribution des unes par rapport aux autres sont définies. Pour valider cette technique, j'ai reconstitué des réseaux qui miment des architectures cellulaires (i.e modules du fuseau mitotique). Dans un deuxième temps j'ai étudié le rôle de MAP65s dans l'auto-organisation de réseaux de faisceaux de MTs, et plus particulièrement l'étape de co-alignement entre MTs dynamiques et dispersés. J'ai montré que MAP65-1 de plante et son orthologue chez la levure, Ase1, diminuent fortement la longueur de persistance de MTs isolés ou organisés en faisceaux. Cet assouplissement leur permet de se déformer et donc de se co-aligner pour former des faisceaux lorsqu'ils se rencontrent à des angles de rencontre élevés. L'augmentation de flexibilité est du à l'interaction du domaine de liaison de MAP65-1/Ase1 avec la lattice des MTs. Ces résultats suggèrent que la diminution de la rigidité des MTs contrôle dans les cellules l'issue des évènements des rencontres entre MTs. De façon plus générale, la modulation des propriétés mécaniques des MTs par des MAPs représente un nouveau mécanisme pour réguler la plasticité des réseaux de MTs dans les cellules eucaryotes.The microtubule (MT) cytoskeleton is essential for many cell processes, such as the intracellular trafficking, the cell division, and the cell morphogenesis. Depending on the cell type or on its differentiation state, the MT networks will adopt different architectures. These organizations are defined by intracellular geometric constraints and the regulation of the acticity of many MT associated proteins (MAPs). Among these proteins, we get a particular interest in MAP65s family that crosslink MTs to organize them into bundles. The aim of my thesis was to study in vitro the role of MAP65s in the self-organization of MT bundles in particular networks. As a first step, I developed a biomimetic system using the micro-patterning procedure which imposes a MT assembly geometry within limits close to those observed in cells. This method allows to precisely control the MT assembly from micro-patterns with define shape, size and spatial distribution. In order to validate this technic, I reconstituted MT networks which mimic cellular architecture (i.e mitotic spindle modules). In a second time, I studied the role of major MT cross-linkers that are members of the MAP65 family in the formation of MT bundles, particularly the step of MT co-aligment after encountering of dynamic growing MTs. I found that plant MAP65-1 and its yeast ortholog, Ase1, lower the global rigidity of single MTs and MT bundles. This increase in MT flexibility is directly caused by interactions between the MAP65 MT-binding domain and the MT lattice. These data suggest that MT softening by MAP65 controls the issue of MT encounters, so that self-organized ordered MT bundles are formed in living cells. In a more general way, the modulation of MT mechanical propreties by MAPs represent a new mecanism to regulate MT networks plasticity in eukaryote cells.SAVOIE-SCD - Bib.électronique (730659901) / SudocGRENOBLE1/INP-Bib.électronique (384210012) / SudocGRENOBLE2/3-Bib.électronique (384219901) / SudocSudocFranceF

Microtubule sliding activity of a kinesin-8 promotes spindle assembly and spindle length control

Molecular motors play critical roles in the formation of mitotic spindles, either through controlling the stability of individual microtubules, or by cross-linking and sliding microtubule arrays. Kinesin-8 motors are best known for their regulatory roles in controlling microtubule dynamics. They contain microtubule-destabilizing activities, and restrict spindle length in a wide variety of cell types and organisms. Here, we report for the first time on an anti-parallel microtubule-sliding activity of the budding yeast kinesin-8, Kip3. The in vivo importance of this sliding activity was established through the identification of complementary Kip3 mutants that separate the sliding activity and microtubule destabilizing activity. In conjunction with kinesin-5/Cin8, the sliding activity of Kip3 promotes bipolar spindle assembly and the maintenance of genome stability. We propose a “slide-disassemble” model where Kip3’s sliding and destabilizing activity balance during pre-anaphase. This facilitates normal spindle assembly. However, Kip3’s destabilizing activity dominates in late anaphase, inhibiting spindle elongation and ultimately promoting spindle disassembly

Nurses' perceptions of aids and obstacles to the provision of optimal end of life care in ICU

Contains fulltext : 172380.pdf (publisher's version ) (Open Access

Dynamic assembly of microtubules and molecular mecanisms involved in the microtubule network during cellular morphogenesis

Le cytosquelette de microtubule (MT) est essentiel dans de nombreux processus cellulaire. Il est notamment impliqué dans le trafic intracellulaire, la division cellulaire, la modification et le maintien de la forme de la cellule. En fonction du type cellulaire ou de son état de différenciation, les réseaux de MTs vont adopter des architectures différentes. Ces organisations sont définies par des contraintes géométriques intracellulaires et l'activité moléculaire de nombreuses protéines associées aux MTs (MAPs). Parmi ces protéines, des membres de la famille des MAP65s ont été identifiés. In vitro, elles forment des ponts entre les MTs pour les organiser en faisceaux. Le but de mon travail de thèse a été d'étudier in vitro le rôle de MAP65s dans l'auto-organisation d'un réseau de faisceaux de MTs. Dans un premier temps, j'ai mis au point un système biomimétique utilisant la technique de « micro-patterning » qui imposent une géométrie d'assemblage pour les MTs dans des limites qui se rapprochent de celles observées dans les cellules. Cette méthode permet de contrôler précisément l'assemblage des MTs à partir de zones dont les formes, la taille et la distribution des unes par rapport aux autres sont définies. Pour valider cette technique, j'ai reconstitué des réseaux qui miment des architectures cellulaires (i.e modules du fuseau mitotique). Dans un deuxième temps j'ai étudié le rôle de MAP65s dans l'auto-organisation de réseaux de faisceaux de MTs, et plus particulièrement l'étape de co-alignement entre MTs dynamiques et dispersés. J'ai montré que MAP65-1 de plante et son orthologue chez la levure, Ase1, diminuent fortement la longueur de persistance de MTs isolés ou organisés en faisceaux. Cet assouplissement leur permet de se déformer et donc de se co-aligner pour former des faisceaux lorsqu'ils se rencontrent à des angles de rencontre élevés. L'augmentation de flexibilité est du à l'interaction du domaine de liaison de MAP65-1/Ase1 avec la lattice des MTs. Ces résultats suggèrent que la diminution de la rigidité des MTs contrôle dans les cellules l'issue des évènements des rencontres entre MTs. De façon plus générale, la modulation des propriétés mécaniques des MTs par des MAPs représente un nouveau mécanisme pour réguler la plasticité des réseaux de MTs dans les cellules eucaryotes.The microtubule (MT) cytoskeleton is essential for many cell processes, such as the intracellular trafficking, the cell division, and the cell morphogenesis. Depending on the cell type or on its differentiation state, the MT networks will adopt different architectures. These organizations are defined by intracellular geometric constraints and the regulation of the acticity of many MT associated proteins (MAPs). Among these proteins, we get a particular interest in MAP65s family that crosslink MTs to organize them into bundles. The aim of my thesis was to study in vitro the role of MAP65s in the self-organization of MT bundles in particular networks. As a first step, I developed a biomimetic system using the micro-patterning procedure which imposes a MT assembly geometry within limits close to those observed in cells. This method allows to precisely control the MT assembly from micro-patterns with define shape, size and spatial distribution. In order to validate this technic, I reconstituted MT networks which mimic cellular architecture (i.e mitotic spindle modules). In a second time, I studied the role of major MT cross-linkers that are members of the MAP65 family in the formation of MT bundles, particularly the step of MT co-aligment after encountering of dynamic growing MTs. I found that plant MAP65-1 and its yeast ortholog, Ase1, lower the global rigidity of single MTs and MT bundles. This increase in MT flexibility is directly caused by interactions between the MAP65 MT-binding domain and the MT lattice. These data suggest that MT softening by MAP65 controls the issue of MT encounters, so that self-organized ordered MT bundles are formed in living cells. In a more general way, the modulation of MT mechanical propreties by MAPs represent a new mecanism to regulate MT networks plasticity in eukaryote cells

Etude de mécanismes moléculaires et de lois physiques qui régissent l'auto-organisation des microtubules en réseaux ordonnés et complexes in vitro

The microtubule (MT) cytoskeleton is essential for many cell processes, such as the intracellular trafficking, the cell division, and the cell morphogenesis. Depending on the cell type or on its differentiation state, the MT networks will adopt different architectures. These organizations are defined by intracellular geometric constraints and the regulation of the acticity of many MT associated proteins (MAPs). Among these proteins, we get a particular interest in MAP65s family that crosslink MTs to organize them into bundles. The aim of my thesis was to study in vitro the role of MAP65s in the self-organization of MT bundles in particular networks. As a first step, I developed a biomimetic system using the micro-patterning procedure which imposes a MT assembly geometry within limits close to those observed in cells. This method allows to precisely control the MT assembly from micro-patterns with define shape, size and spatial distribution. In order to validate this technic, I reconstituted MT networks which mimic cellular architecture (i.e mitotic spindle modules). In a second time, I studied the role of major MT cross-linkers that are members of the MAP65 family in the formation of MT bundles, particularly the step of MT co-aligment after encountering of dynamic growing MTs. I found that plant MAP65-1 and its yeast ortholog, Ase1, lower the global rigidity of single MTs and MT bundles. This increase in MT flexibility is directly caused by interactions between the MAP65 MT-binding domain and the MT lattice. These data suggest that MT softening by MAP65 controls the issue of MT encounters, so that self-organized ordered MT bundles are formed in living cells. In a more general way, the modulation of MT mechanical propreties by MAPs represent a new mecanism to regulate MT networks plasticity in eukaryote cells.Le cytosquelette de microtubule (MT) est essentiel dans de nombreux processus cellulaire. Il est notamment impliqué dans le trafic intracellulaire, la division cellulaire, la modification et le maintien de la forme de la cellule. En fonction du type cellulaire ou de son état de différenciation, les réseaux de MTs vont adopter des architectures différentes. Ces organisations sont définies par des contraintes géométriques intracellulaires et l'activité moléculaire de nombreuses protéines associées aux MTs (MAPs). Parmi ces protéines, des membres de la famille des MAP65s ont été identifiés. In vitro, elles forment des ponts entre les MTs pour les organiser en faisceaux. Le but de mon travail de thèse a été d'étudier in vitro le rôle de MAP65s dans l'auto-organisation d'un réseau de faisceaux de MTs. Dans un premier temps, j'ai mis au point un système biomimétique utilisant la technique de « micro-patterning » qui imposent une géométrie d'assemblage pour les MTs dans des limites qui se rapprochent de celles observées dans les cellules. Cette méthode permet de contrôler précisément l'assemblage des MTs à partir de zones dont les formes, la taille et la distribution des unes par rapport aux autres sont définies. Pour valider cette technique, j'ai reconstitué des réseaux qui miment des architectures cellulaires (i.e modules du fuseau mitotique). Dans un deuxième temps j'ai étudié le rôle de MAP65s dans l'auto-organisation de réseaux de faisceaux de MTs, et plus particulièrement l'étape de co-alignement entre MTs dynamiques et dispersés. J'ai montré que MAP65-1 de plante et son orthologue chez la levure, Ase1, diminuent fortement la longueur de persistance de MTs isolés ou organisés en faisceaux. Cet assouplissement leur permet de se déformer et donc de se co-aligner pour former des faisceaux lorsqu'ils se rencontrent à des angles de rencontre élevés. L'augmentation de flexibilité est du à l'interaction du domaine de liaison de MAP65-1/Ase1 avec la lattice des MTs. Ces résultats suggèrent que la diminution de la rigidité des MTs contrôle dans les cellules l'issue des évènements des rencontres entre MTs. De façon plus générale, la modulation des propriétés mécaniques des MTs par des MAPs représente un nouveau mécanisme pour réguler la plasticité des réseaux de MTs dans les cellules eucaryotes

Quantification of MAP and molecular motor activities on geometrically controlled microtubule networks.

International audienceThe spatial organization of the microtubule (MT) network directs cell polarity and mitosis. It is finely regulated by hundreds of different types of microtubule-associated proteins and molecular motors whose specific functions are difficult to investigate directly in cells. Here, we have investigated their functions using geometrically controlled MT networks in vitro in cell-free assay. This was achieved by developing a new method to spatially define MT nucleation using MT microseeds adsorbed on a micropatterned glass substrate. This method could be used to control MT growth and the induction of complex MT networks. We selected the interaction of two radial arrays of dynamic and polarized MTs to analyze the formation of the central antiparallel MT bundle. We investigated the effects of the MT cross-linker anaphase spindle elongation 1 (Ase1) and the kinesin motor Klp2, which are known to regulate MT organization in the spindle midzone. We thus identified the respective roles of each protein and revealed their synergy on the establishment of stable antiparallel MT bundles by quantifying MT interactions over hundreds of comparable MT networks

Pupillary abnormalities in non-selected critically ill patients: an observational study

International audienceBackground: Repeated pupillary examination is a key element of neurologic surveillance in intensive care units (ICU). However, in non-selected critically ill patients, the clinical interest of monitoring pupillary diameter and light reflex is poorly documented. We aimed to determine the prevalence and the etiologies of pupillary abnormalities (PAs) in this ICU patient population. Methods: We performed a prospective, observational study in a medical university affiliated ICU over a 6-month period. All patients with at least one pupillary examination were included. PA was defined as areflexia and/or anisocoria present at the time of ICU admission or occurring during the ICU stay. Results: During the study period, we included 297 patients who had 6 +/- 9 pupillary examinations per day (totaling 11,360 pupillary assessments). The majority of patients (n=161, 54%) were admitted to the ICU for acute respiratory or cardiovascular failure. A total of 128 PAs were recorded in 109 patients: 78 areflexia alone (61%), 33 anisocoria alone (26%) and 17 (13%) with associated anisocoria and areflexia. The main causes of PAs were related to acute brain ischemia (n=41, 32%) and sedation/analgesia (n=50, 39%). Among the PAs, 59 (46%) were present upon ICU admission. The etiologies of the PAs at admission did not differ from those occurring during ICU stay (P=NS). Interestingly, 9 (7%) PAs were attributed to ipratropium nebulization in patients with chronic obstructive pulmonary disease exacerbation. Conclusions: The high prevalence of PAs, frequently associated with both brain organic lesions and drug side effects, highlights the clinical interest of pupillary surveillance in non-selected critically ill patients