Desarrollo y optimización de técnicas que faciliten el diagnóstico genético. Aplicación a trastornos del metabolismo lipídico

El diagnóstico genético proporciona una información fundamental para la práctica clínica. No solamente puede proporcionar diagnósticos precisos o contribuir al diagnóstico diferencial sino que además puede orientar el tratamiento y permitir el desarrollo eficaz de una medicina preventiva. Esta aportación resulta especialmente importante en distintos trastornos del metabolismo lipídico, especialmente en los que resultan en una acumulación lipídica en el organismo. La hipercolesterolemia autosómica dominante (HAD) es uno de los trastornos de origen genético más frecuentes en población general. Provoca niveles plasmáticos muy elevados de lipoproteínas de baja densidad (LDL), lo que está relacionado con el desarrollo de aterosclerosis. La aterosclerosis es la principal causa de enfermedad coronaria, que a su vez es la principal causa de muerte en los países industrializados. Las lipidosis son un grupo de enfermedades causadas por la acumulación intracelular de distintas sustancias lipídicas. Son mucho menos frecuentes en población general, pero tienen una alta frecuencia en determinados grupos étnicos. El diagnóstico genético en ambos casos resulta de gran ayuda para la práctica clínica. Para facilitar el diagnóstico, se han desarrollado y optimizado métodos que permiten analizar los genes asociados con HAD: LDLR, APOB, PCSK9 y APOE; y los genes asociados con enfermedad de Gaucher (GBA) y enfermedad de Niemann-Pick (SMPD1, NPC1, NPC2). Los métodos de análisis se han validado con muestras clínicas, descubriendo nuevas variantes no descritas con anterioridad que permiten avanzar en el conocimiento de las bases moleculares de trastornos del metabolismo lipídico. <br /

Estudio Epidemiológico y funcional de variantes en el gen GLA, en pacientes con miocardiopatía hipertrófica de ventrículo izquierdo de origen desconocido

La enfermedad de Fabry (EF) es una patología lisosomal ligada al cromosoma X, debida al acúmulo de lípidos complejos (globotriaosilceramida principalmente) por un déficit de la enzima α-galactosidasa A (α-Gal A). La incidencia varía en los estudios de hipertrofia de ventrículo izquierdo (HVI). El objetivo es analizar la incidencia de la EF en pacientes con HVI de origen desconocido y realizar el estudio molecular y epidemiológico de las variantes genéticas identificadas. Se llevó a cabo un estudio multicéntrico seguido de una valoración transversal de las historias clínicas. Se determinó la α-Gal A en muestra de gota de sangre seca. Todas las mujeres, y los varones cuya α-Gal A normalizada≤70%, se les analizó el gen GLA mediante electroforesis capilar. Los pacientes en los que se identificaron variantes genéticas fueron más ampliamente estudiados. Se estudiaron 367 sujetos. El patrón de HVI más común fue el concéntrico (42%). Se secuenciaron todas las mujeres y el 26,9% de los varones, identificándose variantes en ambos géneros (11,4% mujeres; 4,9% varones): NP_000160.1:p.Ser126Gly relacionada con actividad residual, el alelo de pseudo-deficiencia NP_000160.1:p.Asp313Tyr y 3 variantes de significado incierto (VSI). 49 pacientes mostraron variantes en el promotor y/o intrones. Tras el análisis in silico de las 3 VSI, la variante NM_000169.2:c.192C>T se consideró como potencialmente patogénica, aun así, se realizó caracterización funcional de las 3 VSI mediante determinación de actividad enzimática en plasma y extracto leucocitario, estudio de grandes reordenamientos génicos, estudio de EMSA, estudio de transcritos alternativos mediante electroforesis y cuantificación de marcadores biológicos subrogados en plasma y orina. Los resultados obtenidos de estos estudios no permitieron confirmar la patogenicidad de ninguna de las 3 VSI, incluso de NM_000169.2:c.192C>T a pesar de los resultados obtenidos in silico. Se realizó un estudio de segregación haplotípica para el resto de variantes identificadas en el estudio genético, estableciendo como mayoritarios 3 haplotipos compuestos por variantes en regiones no codificantes (haplotipo complejo intrónico, HCI). Previa a la caracterización funcional de los HCI se realizó un estudio de asociación estadística de todos los marcadores genéticos que formaban parte de los HCI vs la actividad α-Gal A en gota de sangre seca; una vez se realizó este estudio, se procedió a caracterizar funcionalmente los HCI mediante determinación de actividad enzimática en plasma y extracto leucocitario, estudio de grandes reordenamientos génicos, secuenciación de regiones no codificantes del gen GLA, estudio de EMSA, estudio de transcritos alternativos mediante electroforesis, estudio de la expresión génica, cuantificación de marcadores biológicos subrogados en plasma y orina y cuantificación del acúmulo intracelular de sustratos mediante técnicas de inmunohistoquímica. Los resultados obtenidos de estos estudios indicaron que tan solo el HCI tipo I mostró una reducción significativa de la actividad α-Gal A en gota de sangre seca. Se identificaron nuevos marcadores genéticos en regiones intrónicas profundas tanto en HCI tipo I como tipo III. No se observó niveles elevados de biomarcadores en plasma y orina. No se identificaron reordenamientos patogénicos en el gen GLA. La actividad enzimática de α-Gal A en extracto leucocitario se encontraba significativamente reducida en los pacientes con HCI tipo I, observándose también en ellos una reducción de la expresión del gen GLA y un acúmulo intracelular de manera difusa de globotriaosilceramida a partir de los estudios realizados en cultivo primario de fibroblastos. La incidencia de la EF en nuestro estudio fue nula, sin embargo, se identificaron 3 VSI y varios HCI. El HCI tipo I mostró una reducción significativa de la actividad enzimática, regulación a la baja de la expresión del gen GLA y acúmulo intracelular de sustrato.<br /

Mapping the genetic and clinical characteristics of Gaucher disease in the Iberian Peninsula

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Gaucher disease (GD) is due to deficiency of the glucocerebrosidase enzyme. It is panethnic, but its presentation reveals ethnicity-specific characteristics.</p> <p>Methods</p> <p>We evaluated the distribution, and clinical and genetic characteristics of GD patients in the Iberian Peninsula (IP). We analysed geographical distribution, demographic, genetic and clinical data, age at diagnosis, type, and years of therapy in 436 GD patients from the IP.</p> <p>Results</p> <p>The prevalence of GD was 1/149,000 inhabitants; 88.3% were type 1, 6.7% type 2, and 5.0% type 3. The mean age at diagnosis in type 1 was 28.7 years. A total of 72.7% were classified as having mild forms, 25.5% moderate, and 1.7% severe. Anemia and thrombocytopenia were present in 56% and 55%, respectively. Bone disease and hepatomegaly were reported in 62% and 68%, respectively, and were more likely in asplenic than in non-splenectomized patients. Sixty-nine mutant alleles were identified, and five mutations accounted for 75% of the <it>GBA </it>alleles. Several patients described in our series had interesting phenotypes. A total of 58.7% of patients had received enzyme replacement therapy and 12.6% were treated with miglustat.</p> <p>Conclusions</p> <p>A broad spectrum of <it>GBA </it>mutations is present in the IP, with 98.2% of type 1 GD being mild and 23.0% never treated. These data highlight genetic and phenotypic heterogeneities among geographic populations.</p

Association of ferritin elevation and metabolic syndrome in males. Results from the Aragon Workers' Health Study (AWHS)

Context: Ferritin concentration is associated with metabolic syndrome, but the possibility of a nonlinear association has never been explored. Objective: This study aimed to examine the relationship between serum ferritin levels and the metabolic syndrome in Spanish adult males. Design: This was a cross-sectional analysis of baseline data from the Aragon Workers' Health Study. Setting: Healthy workers from a factory were studied during their annual checkup. Participants: Spanish male adults (n = 3386) between the ages of 19 and 65 years participated. We excluded participants with ferritin > 500 µg/L, ferritin 10 mg/L. Main Outcome Measure: Metabolic syndrome was defined according to the 2009 consensus definition from the Joint Interim Statement of several international societies. Results: Metabolic syndrome prevalence was 27.1%. We found a positive association between elevated iron stores, measured as serum ferritin concentration, and metabolic syndrome and its criteria. Participants within the highest serum ferritin quintile had a higher risk than those in the lowest quintile for central obesity (odds ratio [OR], 1.88; 95% confidence interval [CI], 1.46–2.42), hypertriglyceridemia (OR, 2.15; 95% CI, 1.69–2.74), and metabolic syndrome (OR, 1.92; 95% CI, 1.48–2.49). The association was nonlinear and occurred at serum ferritin concentrations > 100 µg/L (~ 33th percentile). Ferritin was also associated with insulin resistance, measured by homeostatic model assessment–insulin resistance (HOMA-IR) (P trend < .001). Conclusions: Our findings suggest that serum ferritin is significantly associated with metabolic syndrome and its criteria (especially central obesity and hypertriglyceridemia), suggesting that ferritin could be an early marker of metabolic damage in the development of metabolic syndrome

Glycated Hemoglobin, Fasting Insulin and the Metabolic Syndrome in Males. Cross-Sectional Analyses of the Aragon Workers' Health Study Baseline

Background and Aims Glycated hemoglobin (HbA1c) is currently used to diagnose diabetes mellitus, while insulin has been relegated to research. Both, however, may help understanding the metabolic syndrome and profiling patients. We examined the association of HbA1c and fasting insulin with clustering of metabolic syndrome criteria and insulin resistance as two essential characteristics of the metabolic syndrome. Methods We used baseline data from 3200 non-diabetic male participants in the Aragon Workers' Health Study. We conducted analysis to estimate age-adjusted odds ratios (ORs) across tertiles of HbA1c and insulin. Fasting glucose and Homeostatic model assessment - Insulin Resistance were used as reference. Here we report the uppermost-to-lowest tertile ORs (95\% CI). Results Mean age (SD) was 48.5 (8.8) years and 23\% of participants had metabolic syndrome. The ORs for metabolic syndrome criteria tended to be higher across HbA1c than across glucose, except for high blood pressure. Insulin was associated with the criteria more strongly than HbA1c and similarly to Homeostatic model assessment - Insulin Resistance (HOMA-IR). For metabolic syndrome, the OR of HbA1c was 2.68, of insulin, 11.36, of glucose, 7.03, and of HOMA-IR, 14.40. For the clustering of 2 or more non-glycemic criteria, the OR of HbA1c was 2.10, of insulin, 8.94, of glucose, 1.73, and of HOMA-IR, 7.83. All ORs were statistically significant. The areas under the receiver operating characteristics curves for metabolic syndrome were 0.670 (across HbA1c values) and 0.770 (across insulin values), and, for insulin resistance, 0.647 (HbA1c) and 0.995 (insulin). Among non-metabolic syndrome patients, a small insulin elevation identified risk factor clustering. Conclusions HbA1c and specially insulin levels were associated with metabolic syndrome criteria, their clustering, and insulin resistance. Insulin could provide early information in subjects prone to develop metabolic syndrome.M. Laclaustra was supported in part by grant FIS CP08/00112 from Instituto de Salud Carlos III. Y. Hurtado-Roca was supported by Scholarship No 088-FINCyT-BDE-2014 from Peruvian government. This study was supported in part by grants PI14/00009, PI12/01087, PI12/01703, PI10/00021 (Fondo de Investigacion Sanitaria del Instituto de Salud Carlos III), co-funding by Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER 2007-2013), and RETIC RIC RD12/0042/0055 from Instituto de Salud Carlos III. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.S

Aragon workers’ health study – design and cohort description

BACKGROUND: Spain, a Mediterranean country with relatively low rates of coronary heart disease, has a high prevalence of traditional cardiovascular risk factors and is experiencing a severe epidemic of overweight/obesity. We designed the Aragon Workers’ Health Study (AWHS) to characterize the factors associated with metabolic abnormalities and subclinical atherosclerosis in a middle aged population in Spain free of clinical cardiovascular disease. The objective of this paper is to describe the study design, aims and baseline characteristics of participants in the AWHS. METHODS/DESIGN: Longitudinal cohort study based on the annual health exams of 5,400 workers of a car assembly plant in Figueruelas (Zaragoza, Spain). Study participants were recruited during a standardized clinical exam in 2009–2010 (participation rate 95.6%). Study participants will undergo annual clinical exams and laboratory assays, and baseline and triennial collection of biological materials for biobanking and cardiovascular imaging exams (carotid, femoral and abdominal ultrasonography, coronary calcium score, and ankle-arm blood pressure index). Participants will be followed-up for 10 years. RESULTS: The average (SD) age, body mass index, and waist circumference were 49.3 (8.7) years, 27.7 (3.6) kg/m(2) and 97.2 (9.9) cm, respectively, among males (N = 5,048), and 40.8 (11.6) years, 24.4 (3.8) kg/m(2), and 81.9 (9.9) cm, among females (N = 351). The prevalence of overweight, obesity, current smoking, hypertension, hypercholesterolemia, and diabetes were 55.0, 23.1, 37.1, 40.3, 75.0, and 7.4%, respectively, among males, and 23.7, 8.3, 45.0, 12.1, 59.5, and 0.6%, respectively, among females. In the initial 587 study participants who completed all imaging exams (94.5% male), the prevalence of carotid plaque, femoral plaque, coronary calcium score >1 to 100, and coronary calcium score >100 was 30.3, 56.9, 27.0, and 8.8%, respectively. 67.7% of study participants had at least one plaque in the carotid or femoral arteries. DISCUSSION: Baseline data from the AWHS show a high prevalence of cardiovascular risk factors and of sublinical atherosclerosis. Follow-up of this cohort will allow the assessment of subclinical atherosclerosis progression and the link of disease progression to traditional and emergent risk factors

ABCG5/G8 gene is associated with hypercholesterolemias without mutation in candidate genes and non-cholesterol sterols

Context Approximately 20% to 40% of clinically defined familial hypercholesterolemia (FH) cases do not show a causative mutation in candidate genes (mutation-negative FH), and some of them may have a polygenic origin. Objective The aim of this work was to study the prevalence of ABCG5/G8 genetic variants in mutation-negative FH, as defects in these genes relate to intestinal hyperabsorption of cholesterol and thus ABCG5/G8 variants could explain in part the mechanism of hypercholesterolemia. Design, setting, and patients We sequenced the ABCG5/G8 genes in 214 mutation-negative FH and 97 controls. Surrogate markers of cholesterol absorption (5?-cholestanol, ?-sitosterol, campesterol, stigmasterol, and sitostanol) were quantified by high-performance liquid chromatography?tandem mass spectrometry in both studied groups. Results We found 8 mutation-negative FH patients (3.73%) with a pathogenic mutation in ABCG5/G8 genes. We observed significantly higher concentration of surrogate markers of cholesterol absorption in mutation-negative FH than in controls. In addition, we found significantly higher concentrations of cholesterol absorption markers in mutation-negative FH with ABCG5/G8 defects than in mutation-negative, ABCG5/G8-negative FH. A gene score reflecting the number of common single nucleotide variants associated with hypercholesterolemia was significantly higher in cases than in controls (P = .032). Subjects with a gene score above the mean had significantly higher 5?-cholestanol and stigmasterol than those with a lower gene score. Conclusions Mutation-negative FH subjects accumulate an excess of rare and common gene variations in ABCG5/G8 genes. This variation is associated with increased intestinal absorption of cholesterol, as determined by surrogate makers, suggesting that these loci contribute to hypercholesterolemia by enhancing intestinal cholesterol absorption.This study was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness PI15/01983, PI13/02507, PI12/01321, CIBERCV, CIBEROBN, and Cuenca Villoro Foundation. These projects are co-financed by Instituto de Salud Carlos III and the European Regional Development Fund (ERDF) of the European Union “A way to make Europe.

Increased glycolipid storage produced by the inheritance of a complex intronic haplotype in the α-galactosidase A (GLA) gene

BACKGROUND: Accumulation of galactosphingolipids is a general characteristic of Fabry disease, a lysosomal storage disorder caused by the deficient activity of α-galactosidase A encoded by the GLA gene. Although many polymorphic GLA haplotypes have been described, it is still unclear whether some of these variants are causative of disease symptoms. We report the study of an inheritance of a complex intronic haplotype (CIH) (c.-10C > T, c.369 + 990C > A, c.370-81_370-77delCAGCC, c.640-16A > G, c.1000-22C > T) within the GLA gene associated with Fabry-like symptoms and galactosphingolipid accumulation. We analysed α-Gal A activity in plasma, leukocytes and skin fibroblasts in patients, and measured accumulation of galactosphingolipids by enzymatic methods and immunofluorescence techniques. Additionally, we evaluated GLA expression using quantitative PCR, EMSA, and cDNA cloning. RESULTS: CIH carriers had an altered GLA expression pattern, although most of the carriers had high residual enzyme activity in plasma, leukocytes and in skin fibroblasts. Nonetheless, CIH carriers had significant galactosphingolipid accumulation in fibroblasts in comparison with controls, and also glycolipid deposits in renal tubules and glomeruli. EMSA assays indicated that the c.-10C > T variant in the promoter affected a nuclear protein binding site. CONCLUSIONS: Thus, inheritance of the CIH caused an mRNA deregulation altering the GLA expression pattern, producing a tissue glycolipid storage

El cultivo de garbanzo (Cicer arietinum L.) en Argentina

El Programa Transferencia de Resultados de Investigación y Comunicación Pública de la Ciencia (PROTRI), de la Secretaría de Ciencia y Tecnología del Gobierno de la Provincia de Córdoba, financió la realización del libro El cultivo de garbanzo en Argentina con el objeto de promover la transferencia de resultados, experiencias o saberes entre las áreas del sector social y productivo para una mejor calidad de vida. Para la ejecución de esta obra han sido convocados técnicos e investigadores de las Ciencias Agropecuarias, Biológicas y Económicas, quienes en una forma clara y sencilla, aunque no menos consistente, ponen a disposición del lector sus experiencias adquiridas a lo largo de varios años de trabajo. El desarrollo de los diferentes temas se realiza a través de dieciséis Capítulos que abarcan desde la domesticación de Cicer y su llegada a la Argentina (Capítulo 1), pasando por el estudio morfológico de las diferentes partes de la planta en relación a los cultivares locales (Capítulo 2), además del manejo del suelo y sus nutrientes, en cuanto a requerimientos edáficos en los sistemas productivos (Capítulo 3). También se contempla el análisis de la influencia de los diversos factores ambientales para la determinación de zonas productivas (Capítulo 4). En el Capítulo 5 se hace referencia a la ecofisiología del cultivo, sus requerimientos en las diferentes etapas fenológicas, y cuándo y cómo se expresan en los cultivares. Un tema de indudable importancia para las leguminosas en general, y para el garbanzo en particular, es la simbiosis con las bacterias fijadoras de nitrógeno y su influencia en la productividad, el cual se desarrolla en el Capítulo 6. La mejora genética en el país es abordada en el Capítulo 7, donde se exponen sus inicios, desarrollo, disponibilidad de recursos, bondades y potencial del germoplasma disponible. A lo largo del ciclo biológico de la planta, el cultivo es visitado por insectos e infectado por hongos. Identificarlos y conocer sus ciclos biológicos y comportamientos es un aspecto importante para seleccionar las medidas de manejo y control más adecuadas (Capítulos 8 y 9). Quizás pocos sepan que el volumen de semilla genética de un cultivar, alcanza sólo unos pocos gramos (alrededor de 20). Para llevar este pequeño volumen a toneladas, se requiere del trabajo y tesón de investigadores, fitomejoradores y productores. Resultado de ese esfuerzo es la difusión de los seis cultivares obtenidos en el país, y se sigue trabajando para lograr nuevos materiales que se adapten a las diversas áreas y sistemas de producción (Capítulo 10). El desarrollo de los diferentes cultivares, que dan lugar a diversas arquitecturas de plantas, sumado a la adopción de diversos sistemas de producción, hace que el tema de la mecanización ocupe un lugar importante. Maquinas pequeñas y grandes intervienen en las etapas de siembra y de cosecha tratando de lograr la mayor eficiencia posible y un producto de calidad (Capítulo 11). Un cuello de botella para la expansión del cultivo es su comercialización, tanto para consumo interno como externo. En el Capítulo 12 se analizan los diferentes mercados y la necesidad de lograr un producto rentable de alta calidad, para mercados muy diversos. En el Capítulo 13 se hace un recorrido por las diferentes Provincias que actualmente producen garbanzo. Sus autores comentan como se incorporó el cultivo a los sistemas productivos de la región, sobre posibilidades y limitaciones, manejos y potencial de rendimiento, entre otros aportes. Los Capítulos 14 y 15 presentan dos temas de relevancia actual: la composición química del grano y las posibilidades de brindar valor agregado a éste, aspectos reforzados en la última década por el auge de las tendencias que promueven un nuevo estilo de vida y una alimentación sana, con alimentos naturales, bajos en grasa y con un buen balance nutricional. En el último Capítulo (16) se presentan experiencias de investigación en las que se utilizó al garbanzo como materia prima o como sustrato para diversas experimentaciones. La interacción docente-investigador-alumno permitió que vieran la luz diversos trabajos que, además de la formación de recursos humanos, brindan una información útil y novedosa al incursionar en temas tales como manejo de fechas de siembra, riego, alimento para pollos, cerdos y abejas. Estimado lector, tiene en sus manos un libro que es una invitación a un viaje con dieciséis estaciones. En cada una de ellas encontrará información sobre el cultivo del garbanzo en la Argentina. Estos datos fueron obtenidos por docentes, investigadores, productores, estudiantes que trabajaron y siguen trabajando para aportar al conocimiento del cultivo en nuestro país, bajo la realidad local y el contexto regional, ya que la mayoría de los trabajos y publicaciones son de origen extranjero y la aplicación de muchas de las tecnologías de manejo requieren una correcta adaptación y validación. Esperamos que este libro, además de serle útil, pueda ser disfrutado, sintiendo la pasión y el entusiasmo de cada uno de los autores por brindar y compartir sus conocimientos y logros