A“Proteoglycan Targeting Strategy” for the Scintigraphic Imaging and Monitoring of the Swarm Rat Chondrosarcoma Orthotopic Model

Our lab developed 99mTc-NTP 15-5 radiotracer as targeting proteoglycans (PGs) for the scintigraphic imaging of joint. This paper reports preclinical results of 99mTc-NTP 15-5 imaging of an orthotopic model of Swarm rat chondrosarcoma (SRC). 99mTc-NTP 15-5 imaging of SRC-bearing and sham-operated animals was performed and quantified at regular intervals after surgery and compared to bone scintigraphy and tumoural volume. Tumours were characterized by histology and PG assay. SRC exhibited a significant 99mTc-NTP 15-5 uptake at very early stage after implant (with tumour/muscle ratio of 1.61 ± 0.14), whereas no measurable tumour was evidenced. As tumour grew, mean tumour/muscle ratio was increased by 2.4, between the early and late stage of pathology. Bone scintigraphy failed to image chondrosarcoma, even at the later stage of study. 99mTc-NTP 15-5 imaging provided a suitable set of quantitative criteria for the in vivo characterization of chondrosarcoma behaviour in bone environment, useful for achieving a greater understanding of the pathology

Ciblage des protéoglycanes par la fonction ammonium quaternaire. : Développement de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques pour la prise en charge du chondrosarcome.

Our strategy consists in using the quaternary ammonium function, that exhibits a high affinity for proteoglycans of extracellular matrix, as a selective carrier to chondrosarcoma of (i) radioisotopes for a targeted in vivo imaging or (i) cytotoxics for a targeted therapeutic approach. For diagnosis application, a radiotracer radiolabeled with 99m Tc ( 99m Tc-NTP 15-5) was designed and tested in vivo in an orthotopic Swarm chondrosarcoma model. For therapeutic application, a quaternary ammonium derivative of melphalan, Melphalan-AQ, was synthesized and assessed in vitro (cytotoxic activity, cell cycle distribution) and in vivo in the orthotopic Swarm chondrosarcome model (antitumor efficacy, toxicity). Since chondrosarcoma is characterized by hypoxia, research was focused on the vectorization of hypoxia-activated prodrugs. For diagnosis, 99m Tc-NTP 15-5 radiotracer highly accumulated in tumoral tissue at very early stage of pathology while no palpable nor measurable tumor could be assessed. For therapy, chondrosarcoma bearing rats treated with Melphalan-AQ showed a significant tumor growth inhibition with associated heamatological side effects being significantly reduced as compared to Melphalan. Among all phosphoramidate-AQ derivatives synthetised, one was selected on the basis of cytotoxic activity improvement under hypoxia respectively to normoxia. In vivo, this compound demonstrated a significant tumoral growth inhibition in the hypoxic HEMC-SS chondrosarcoma model. This work underlines the potential of the proteoglycans vectorization strategy developed in our lab, for a targeted management of chondrosarcoma including: (i) the first and only radiopharmaceutical able to provide in vivo a specific diagnosis and staging of the tumoral pathology of cartilage and (ii) a promising targeted antineoplastic approach exploiting both the chondrogenic and hypoxic features of chondrosarcoma.Le travail présenté dans ce manuscrit s’inscrit dans une stratégie de vectorisation d’agents diagnostiques et thérapeutiques, vers les protéoglycanes du chondrosarcome, via une structure chimique de reconnaissance : un ammonium quaternaire. Nous nous sommes intéressés aux deux aspects de la prise en charge du chondrosarcome : l’aspect diagnostique par imagerie scintigraphique et l’aspect thérapeutique. Pour l’imagerie, nous avons validé l’intérêt du radiotraceur 99m Tc-NTP 15-5 dans le diagnostic précoce, le staging et le suivi de la réponse au traitement dans un modèle de chondrosarcome de rat. Ce dernier démontre une accumulation spécifique et rapide au niveau du tissu tumoral, et ce, dès les stades précoces de la pathologie. Actuellement en phase de transfert vers la clinique pour la pathologie de l’arthrose, nos résultats ont permis de proposer une extension de l’application au chondrosarcome. Pour la thérapie, nous avons confirmé, in vitro, que la greffe du vecteur ammonium quaternaire, sur un agent alkylant, le melphalan, ne modifiait pas son activité cytotoxique. In vivo, les résultats obtenus avec le dérivé ammonium quaternaire du melphalan, ont mis en évidence un ralentissement net de la croissance tumorale associée à une diminution considérable du syndrome myélodysplasique associé au traitement. Ces résultats prouvent tout l’intérêt de la vectorisation pour l’amélioration de l’index thérapeutique et nous ont permis de valider la preuve de concept pour la vectorisation d’agent cytotoxique. Une autre approche de thérapie a consisté à greffer le vecteur sur des dérivés du cyclophosphamide clivables en hypoxie. Parmi les composés synthétisés, l’un d’entre eux a montré, in vitro, un différentiel de cytotoxicité hypoxie/normoxie intéressant. Son évaluation in vivo dans le modèle de xénogreffe de chondrosarcome HEMC-SS a démontré une inhibition importante de la croissance tumorale. En nous intéressant à l’environnement hypoxique de la tumeur, nous offrons ainsi une approche encore plus spécifique de la thérapie. L’ensemble de ces travaux offrent un véritable espoir pour le management du chondrosarcome, pathologie certes rare mais néanmoins redoutable

Targeting of proteoglycans by the quaternary ammonium function. : Development of new diagnostic and therapeutic approaches for the management of chondrosarcoma.

Le travail présenté dans ce manuscrit s’inscrit dans une stratégie de vectorisation d’agents diagnostiques et thérapeutiques, vers les protéoglycanes du chondrosarcome, via une structure chimique de reconnaissance : un ammonium quaternaire. Nous nous sommes intéressés aux deux aspects de la prise en charge du chondrosarcome : l’aspect diagnostique par imagerie scintigraphique et l’aspect thérapeutique. Pour l’imagerie, nous avons validé l’intérêt du radiotraceur 99m Tc-NTP 15-5 dans le diagnostic précoce, le staging et le suivi de la réponse au traitement dans un modèle de chondrosarcome de rat. Ce dernier démontre une accumulation spécifique et rapide au niveau du tissu tumoral, et ce, dès les stades précoces de la pathologie. Actuellement en phase de transfert vers la clinique pour la pathologie de l’arthrose, nos résultats ont permis de proposer une extension de l’application au chondrosarcome. Pour la thérapie, nous avons confirmé, in vitro, que la greffe du vecteur ammonium quaternaire, sur un agent alkylant, le melphalan, ne modifiait pas son activité cytotoxique. In vivo, les résultats obtenus avec le dérivé ammonium quaternaire du melphalan, ont mis en évidence un ralentissement net de la croissance tumorale associée à une diminution considérable du syndrome myélodysplasique associé au traitement. Ces résultats prouvent tout l’intérêt de la vectorisation pour l’amélioration de l’index thérapeutique et nous ont permis de valider la preuve de concept pour la vectorisation d’agent cytotoxique. Une autre approche de thérapie a consisté à greffer le vecteur sur des dérivés du cyclophosphamide clivables en hypoxie. Parmi les composés synthétisés, l’un d’entre eux a montré, in vitro, un différentiel de cytotoxicité hypoxie/normoxie intéressant. Son évaluation in vivo dans le modèle de xénogreffe de chondrosarcome HEMC-SS a démontré une inhibition importante de la croissance tumorale. En nous intéressant à l’environnement hypoxique de la tumeur, nous offrons ainsi une approche encore plus spécifique de la thérapie. L’ensemble de ces travaux offrent un véritable espoir pour le management du chondrosarcome, pathologie certes rare mais néanmoins redoutable.Our strategy consists in using the quaternary ammonium function, that exhibits a high affinity for proteoglycans of extracellular matrix, as a selective carrier to chondrosarcoma of (i) radioisotopes for a targeted in vivo imaging or (i) cytotoxics for a targeted therapeutic approach. For diagnosis application, a radiotracer radiolabeled with 99m Tc ( 99m Tc-NTP 15-5) was designed and tested in vivo in an orthotopic Swarm chondrosarcoma model. For therapeutic application, a quaternary ammonium derivative of melphalan, Melphalan-AQ, was synthesized and assessed in vitro (cytotoxic activity, cell cycle distribution) and in vivo in the orthotopic Swarm chondrosarcome model (antitumor efficacy, toxicity). Since chondrosarcoma is characterized by hypoxia, research was focused on the vectorization of hypoxia-activated prodrugs. For diagnosis, 99m Tc-NTP 15-5 radiotracer highly accumulated in tumoral tissue at very early stage of pathology while no palpable nor measurable tumor could be assessed. For therapy, chondrosarcoma bearing rats treated with Melphalan-AQ showed a significant tumor growth inhibition with associated heamatological side effects being significantly reduced as compared to Melphalan. Among all phosphoramidate-AQ derivatives synthetised, one was selected on the basis of cytotoxic activity improvement under hypoxia respectively to normoxia. In vivo, this compound demonstrated a significant tumoral growth inhibition in the hypoxic HEMC-SS chondrosarcoma model. This work underlines the potential of the proteoglycans vectorization strategy developed in our lab, for a targeted management of chondrosarcoma including: (i) the first and only radiopharmaceutical able to provide in vivo a specific diagnosis and staging of the tumoral pathology of cartilage and (ii) a promising targeted antineoplastic approach exploiting both the chondrogenic and hypoxic features of chondrosarcoma

Un enjeu de la chimiothérapie actuelle (le développement de traitements plus spécifiques)

Chaque année, de plus en plus de personnes sont touchées par le cancer, qui demeure la seconde cause de mortalité dans les pays industrialisés. Bien qu'il existe tout un arsenal thérapeutique à la disposition du thérapeute, cette maladie demeure encore aujourd'hui invaincue. L'une des raisons majeures est le manque de sélectivité des chimiothérapies associé à de graves effets secondaires qui nécessite une diminution des doses et n'entraîne, finalement, qu'une thérapie partielle de la maladie. Les agents alkylants sont partie d'une famille les plus anciennes de principes actifs cytotoxiques utilisés en clinique, ils interviennent au niveau de l'ADN et empêchent sa réplication. Forts de nouvelles connaissances, les efforts de la recherche s'orientent aujourd'hui vers la mise au point de traitements toujours plus sélectifs et moins toxiques consistant soit à amener l'agent cytotoxique au niveau du site souhaité, soit à cibler spécifiquement des caractères physico-chimiques associés à la malignité et donc à développer respectivement de nouvelles thérapies vectorisées et ciblées. Après un bref rappel sur le cancer et ses traitements de chimiothérapie, des exemples de thérapies vectorisées et ciblées sont présentées. La dernière partie est relative à des travaux de synthèse réalisés au sein de l'UMR INSERM 484 visant à l'obtention de nouvelles molécules vectorisées par l'intermédiaire du FDG.CLERMONT FD-BCIU-Santé (631132104) / SudocLYON1-BU Santé (693882101) / SudocSudocFranceF

3D Coculture between Cancer Cells and Macrophages: From Conception to Experimentation

International audienc

Chondrosarcoma Co-Culture 3D Model─An Insight to Evaluate Drugs Acting on TAMs

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Comparison of several biomarkers (MMP-2, MMP-9, the MMP-9 inhibitor TIMP-1, CTX-II, calprotectin, and COMP) in the synovial fluid and serum of patients with and without septic arthritis

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Targeted hypoxia-activated phosphoramide mustards toward tumor proteoglycans in chondrosarcoma

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Development and characterization of a human three-dimensional chondrosarcoma culture for in vitro drug testing

International audienceIt has been suggested that chemoresistance of chondrosarcoma (CHS), the cartilage tumor, is caused by the phenotypic microenvironmental features of the tumor tissue, mainly the chondrogenic extracellular matrix (ECM), and hypoxia. We developed and characterized a multicellular tumor spheroid (MCTS) of human chondrosarcoma HEMC-SS cells to gain insight into tumor cell biology and drug response. At Day 7, HEMC-SS spheroids exhibited a homogeneous distribution of proliferative Ki-67 positive cells, whereas in larger spheroids (Day 14 and Day 20), proliferation was mainly localized in the periphery. In the core of larger spheroids, apoptotic cells were evidenced by TUNEL assay, and hypoxia by pimonidazole staining. Interestingly, VEGF excretion, evidenced by ELISA on culture media, was detectable from Day 14 spheroids, and increased as the spheroids grew in size. HEMC-SS spheroids synthesized a chondrogenic extracellular matrix rich in glycosaminoglycans and type-2 collagen. Finally, we investigated the sensitivity of Day 7 and Day 14 chondrosarcoma MCTS to hypoxia-activated prodrug TH-302 and doxorubicin compared with their 2D counterparts. As expected, TH-302 exhibited higher cytotoxic activity on larger hypoxic spheroids (Day 14) than on non-hypoxic spheroids (Day 7), with multicellular resistance index (MCRI) values of 7.7 and 9.1 respectively. For doxorubicin, the larger-sized spheroids exhibited higher drug resistance (MCRI of 5.0 for Day 7 and 18.3 for Day 14 spheroids), possibly due to impeded drug penetration into the deep layer of spheroids, evidenced by its auto-fluorescence property. We have developed a model of human chondrosarcoma MCTS that combines an ECM rich in glycosaminoglycans with a high hypoxic core associated with VEGF excretion. This model could offer a more predictive in vitro chondrosarcoma system for screening drugs targeting tumor cells and their microenvironment

Tumor microenvironment imaging: Benefits of multimodality to study chondrosarcoma

International audienceSwarm rat CHSs were implanted subcutaneously in NMRI nude mice (n=10). When tumors were measurable (12-16 days post-transplant), mice were imaged by CEST MRI (Dou W et al., Quant Imaging Med Surg, 2019). Proteoglycans, the main component of chondrogenic extracellular matrix, were quantified by GAG CEST contrast. Guanidyl-and APT CEST contrasts were combined to characterize acidic pH, as hypoxia reflect. ☢ These two features, proteoglycans and hypoxia, were assessed in parallel by nuclear imaging with [ 99m Tc]Tc-NTP 15-5 SPECT imaging (Peyrode C et al., Sarcoma, 2011) and [ 18 F]-FMISO PET imaging (Rajendran JG et al., Clin Cancer Res, 2004), respectively. Data were also completed by ex vivo analyses of tumor and muscle proteoglycans (Alcian blue stain and biochemical assay with dimethylmethylene blue) and hypoxia (pimonidazole immunofluorescence). CONCLUSION: The results from CEST MRI, nuclear imaging and ex vivo analyses were in agreement and highlighted a rich proteoglycan extracellular matrix and a heterogeneous hypoxic tumoral microenvironment for Swarm rat CHS xenograft in mice. This study emphasizes the role of multimodal imaging to characterize tumor phenotypes resistant to treatments and allows a better understanding of the relationship between tumor cells and their environment. Grants: "La Ligue contre le Cancer Auvergne-Rhône-Alpes". All imaging experiments were performed at In Vivo Imaging Auvergne (IVIA) facilit