Towards understanding R-loop regulation by RNAse H1 in saccharomyces cerevisiae

An RNA:DNA hybrid refers to the base pairing of RNA and DNA. In particular, R-loops are three-stranded nucleic acid structures composed of an RNA:DNA hybrid and a displaced DNA strand. In the recent years, several studies have shown that R-loops impact multiple biological processes, such as transcription, telomere maintenance, and DNA repair. Indeed, failure to resolve R-loops in a timely manner results in genomic instability. Hence, cells have evolved several mechanisms to tightly regulate R-loops. One of the most prominent example of an RNA:DNA hybrid removal factor is RNase H1, a monomeric enzyme that degrades the RNA moiety of RNA:DNA hybrids. In human cells, Replication Protein A (RPA) appears to be a regulator of RNase H1 by promoting its recruitment and activity on R-loops. However, it remains unclear if RPA or other proteins influence RNase H1 activity in yeast. RNase H1 is recruited to the chromatin in conditions with high R-loop levels, suggesting that RNase H1 binds to accumulated R-loops. However, how RNase H1 is regulated and responds to high R-loop levels is still elusive. In this study, we have employed in vitro and in vivo experiments to understand where, when and how RNase H1 binds to R-loops. We confirm that RNase H1 is recruited to loci with accumulated R-loops, especially in RNAPIII-transcribed genes. Furthermore, we show that RNase H1 can remove R-loops in all cell cycle phases, allowing RNase H1 to maintain R-loop homeostasis in all conditions, including outside of a replication-transcription conflict context. Using co-immunoprecipitation experiments, we confirm that RPA interacts with the first Hybrid-binding (HB) domain of RNase H1 in a DNA-dependent manner. However, overexpression of RNase H1 without the first HB domain is able to remove R-loops in vivo, suggesting that RNase H1 overexpression does not require RPA interaction to remove R-loops in yeast. Moreover, using in vivo and in vitro assays, we show that the second HB domain of RNase H1 is sufficient to promote binding and removal of R-loops, unlike what was described. We confirm that both HB domains of RNase H1 contribute to a stable interaction with R-loops and likely both HB domains have different functions in RNase H1 binding to substrates. Taken together, these results shed light on how RNase H1 recognizes and responds to stable RNA-DNA hybrids.II, 149 Seiten ; Illustrationen, Diagramm

Peach from Cova da Beira as Health Promotors

The peach’s chemical constitution comprises various antioxidant compounds such as phenolic compounds (flavonoids and non-flavonoids) carotenoids and vitamin C. Their properties have been object of investigation in many areas, proving to have preventive and protective effects against many chronic and age-related diseases such as diabetes, obesity, hypertension, inflammation, cardiovascular, neurodegenerative and oncologic diseases. In this work we evaluate the phenolic profile and biological potential of six peach cultivars (Summer Rich, Fidelia, Royal Glory, Royal Magister, Royal Lu and Sweet Dreams) from Fundão region (Portugal), thus establishing its potential role as a health promotor. The LC-DAD analysis revealed a total of 3 anthocyanins with cyanidin-3-O-glucoside as the main one; and 14 non-colored phenolic compounds which include one hydroxybenzoic acid, eight hydroxycinnamic acids, three flavan-3-ols and three flavonol, chlorogenic and neo-chlorogenic acids are the most abundant, as well as some catechin derivatives. The antioxidant potential was evaluated by FRAP assay and against DPPH and NO radicals. The in vitro assays revealed a good antioxidant activity. Fidelia (13.8 µM Fe2+) presented the major antioxidant power in FRAP, Royal Lu proved to be the most active against DPPH• (IC50 = 62.1 ±1.5 µg/mL), and Sweet Dreams was the most active against NO radical (IC50 = 421.2 ± 45.4 µg/mL). Regarding the a-glucosidase inhibitory activity, Royal Magister and Royal Glory present the highest activity (IC50 = 11.7 ± 1.4 and 17.1 ± 1.7 µg/mL, respectively). Finally, the protective effect of Royal Lu to prevent oxidative damage in human erythrocytes induced by ROO• was performed. Royal Lu proved to be quite efficient with promising results, showing an IC50 value of 110.0 ± 4.5 µg/mL and IC50 at 83.8 ± 6.5 µg/mL for hemolysis and hemoglobin oxidation inhibition. Thus, peach may be considered a promising source of bioactive compounds to be used by the food and pharmaceutical industries, once the inhibition of oxidative mechanisms by antioxidant compounds is a fundamental property that can reduce oxidative stress associated with various diseases.A composição química do pêssego incorpora vários compostos com propriedades antioxidantes, tais como compostos fenólicos (flavonóides e não-flavonóides), carotenóides e vitamina C. Tais propriedades têm sido alvo de investigação em diversas áreas da saúde, demonstrando possuir efeitos protectores e preventivos contra doenças crónicas como a diabetes, obesidade, hipertensão, inflamação, doenças cardiovasculares, neurodegenerativas e oncológicas. No trabalho desenvolvido nesta tese de mestrado avaliou-se o perfil fenólico e o potencial biológico de seis variedades de pêssego do Fundão (Summer Rich, Fidelia, Royal Glory, Royal Magister, Royal Lu e Sweet Dreams), estabelecendo desta forma o seu potencial papel como promotor da saúde. A análise por LC-DAD permitiu a identificação de 3 antocianinas, sendo a cianidina-3-O-glucósido o composto maioritário; e 14 compostos fenólicos não corados, os quais incluem 1 ácido hidroxibenzóico, 8 ácidos hidroxicinâmicos, 3 flavan-3-óis e 3 flavonóis, sendo os ácidos clorogénico e neoclorogénico os compostos mais abundantes, assim como alguns derivados da catequina. O potencial antioxidante foi avaliado através do FRAP e da capacidade de intersecção dos radicais DPPH e NO. Os ensaios in vitro demonstraram uma boa capacidade antioxidante. Fidelia (13.8 µM Fe2+) apresentou um maior poder antioxidante no FRAP, a variedade Royal Lu mostrou ser a mais ativa contra o DPPH• (IC50 = 62,1 ±1,5 µg/mL), a Sweet Dreams (421,2 ± 45,4 µg/mL) foi a variedade que apresentou maior capacidade de interseção do radica NO. Relativamente à inibição da a-glucosidase, as variedades Royal Magister and Royal Glory apresentaram-se como as mais ativas (IC50 = 11,7 ± 1,4 e IC50 = 17,1 ± 1,7 µg/mL, respectivamente). Finalmente, o efeito protector da variedade Royal Lu contra o dano oxidativo induzido por radicais peroxilo em eritrócitos humanos foi avaliado. Os resultados demonstraram uma actividade dependente da concentração, com IC50 de 110,0 ± 4,5 µg/mL para a inibição da hemólise e IC50 at 83,8 ± 6,5 na oxidação da hemoglobina. O pêssego pode ser considerado uma fonte promissora de compostos bioativos que poderão ser usados pelas indústrias alimentares e farmacêuticas, uma vez que a inibição de mecanismos oxidativos através de compostos antioxidantes é uma propriedade fundamental que poderá reduzir o stress oxidativo associado a várias doenças

Role of long non-coding RNAs in parasite differenciation

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015O Trypanosoma brucei é um organismo eucariota unicelular responsável pela Doença do Sono. O parasita pertence à ordem Kinetoplastida, caracterizada por uma estrutura que contém DNA mitocondrial designada cinetoplasto. A distribuição da doença é condicionada pela localização do vector que transmite o parasita. A doença é caracterizada por dois estadios: no primeiro, o parasita está restrito ao sangue e ao linfa e, no segundo, o parasita atravessa a barreira hematoencefálica e invade o sistema nervoso central, causando distúrbios no ciclo do sono. Esta doença endémica da África subsariana é letal se não for tratada. Atualmente, não existe ainda uma vacina e o seu tratamento, além de dispendioso, gera efeitos secundários indesejados. Ao longo do seu complexo ciclo de vida, o parasita alterna entre o seu hospedeiro, um mamífero, e o seu vector, a mosca tsé-tsé. Aquando da picada da mosca tsé-tsé, o parasita entra na corrente sanguínea do hospedeiro e diferencia-se em slender forms. Os parasitas slender forms reproduzem-se assexuadamente por fissão binária, estabelecendo e mantendo a infecção no hospedeiro. O parasita apresenta na sua superfície uma proteína designada glicoproteína variante de superfície (VSG). A rápida e periódica mudança da VSG, designada variação antigénica, permite ao parasita escapar do sistema imunitário do hospedeiro, o que leva a um combate pouco eficiente contra a infecção, já que o parasita consegue persistir durante anos no mesmo hospedeiro. Quando a população do parasita atinge grandes concentrações no sangue, um mecanismo de quorum-sensing permite a diferenciação de slender forms para stumpy forms. Os parasitas stumpy forms são a sua forma transmissível e pré-adaptada para sobrevivência no intestino da mosca tsé-tsé. Ao contrário dos slender forms, os stumpy forms diferenciam-se em procyclic forms, aquando da picada da mosca tsé-tsé, o que leva à transmissão do parasita para o seu vector. T. brucei apresenta uma expressão génica pouco comum comparando com outros organismos eucariotas, uma vez que os genes estão organizados em unidades transcricionais policistrónicas (PTU) constituídas por vários genes não-relacionados funcionalmente e transcritos a partir de um promotor comum. Uma vez transcrito um RNA percussor policistrónico, o transcrito é processado em mRNA maduros monocistrónicos por reações de trans splicing e poliadenilação. À exceção dos genes de VSG, não existem evidências de regulação transcricional em T. brucei, motivo pelo qual a expressão génica é regulada ao nível pós-transcricional, particularmente por regulação da estabilidade e da tradução do mRNA. Em T. brucei, as estruturas secundárias contribuem para a estabilidade do mRNA e para o recrutamento de proteínas de ligação ao RNA (RBP). Além disso, as RBP podem ligar-se à região 3’UTR dos mRNA para regular a associação do mRNA com a maquinaria de tradução. Os parasitas stumpy forms resultam da diferenciação irreversível dos slender forms. A transcrição e a síntese proteíca estão geralmente reprimidos em stumpy forms, reforçando o seu estado de células quiescentes. Os stumpy forms são importantes para a transmissão para o vector, bem como para a sua sobrevivência neste último. Além disso, os stumpy forms são igualmente importantes para o prolongamento da infecção no hospedeiro. A diferenciação dos slender forms para os stumpy forms está relacionada com o aumento da densidade da população no hospedeiro. Esta diferenciação ocorre por comunicação parasita-parasita, através de um mecanismo de quorum-sensing, em que os slender forms secretam uma molécula, designada Factor de Indução de Stumpy (SIF). A molécula em causa acumula-se e estimula a diferenciação para os stumpy forms com o aumento do número de parasitas. Recentemente, foram identificados vários genes essenciais para a via de quorum-sensing, embora apenas tenham sido identificados reguladores positivos que atuam em diferentes etapas da via de sinalização de SIF, incluindo as fosfatases, as cinases e as proteínas envolvidas na regulação génica, como as RBP. Os RNA longos não codificantes (lncRNA) são RNA com mais de 200 pares de base que não codificam proteínas. Os lncRNA atuam, em diferentes organismos de todos os reinos da vida, como reguladores de expressão génica, através da regulação da transcrição, da estabilidade de mRNA ou da eficiência da tradução, entre outros. Os lncRNA podem atuar in cis ou in trans, assim como em vários compartimentos celulares, nomeadamente no núcleo ou no citoplasma, para regular a expressão génica e a função. Recentemente, foram identificados, em T. brucei, 946 lncRNA, dos quais 567 foram identificados em apenas um estadio do ciclo de vida do parasita, sugerindo, assim, a existência de lncRNA específicos de um estadio. O objetivo desta tese é identificar e caracterizar o papel dos lncRNA na diferenciação dos slender forms para stumpy forms. Para estudar a diferenciação para os stumpy forms, é necessário estabelecer uma linha celular que os assinale. Para tal, foram criados parasitas que expressam GFP especificamente em stumpy forms, devido ao 3’UTR de PAD1, uma proteína marcadora de stumpy forms, cujo 3’UTR permite a expressão génica específica em stumpy forms. Esta linha celular, designada GP1, foi caracterizada usando dois métodos para a formação de stumpy forms in vitro: meio complementado com metilcelulose e meio complementado com pCPT-cAMP, sendo o número de células na fase G1 foi relacionado com o número de células que expressam GFP. Os parasitas cultivados em meio com metilcelulose e/ou com pCPT-cAMP no final de dois ou três dias apresentam uma acumulação de células na fase G1, característica dos stumpy forms. A linha celular GP1 apenas expressa GFP quando a diferenciação dos stumpy forms é induzida, quer in vitro (meio complementado com metilcelulose e/ou pCPT-cAMP) quer in vivo (sangue recolhido seis dias após a infeção, quando a maioria dos parasitas são stumpy forms). Tal facto confirma que a GP1 é uma linha celular marcadora de stumpy forms que pode ser usada para estudar a diferenciação destes. Para selecionar lncRNA potencialmente envolvidos na formação dos stumpy forms, selecionámos lncRNA a jusante e a montante de nove genes essenciais para a formação de stumpy forms, que apresentaram resistência ao SIF in vivo. Assim, propomos que estes lncRNA regulam a expressão e/ou função dos genes essenciais para a formação de stumpy forms, identificando quatro lncRNA localizados imediatamente a jusante ou a montante de três dos nove genes essenciais para formação de stumpy forms. O lncRNA5388 e o lncRNA5389 estão localizados a montante da família de genes NEK, enquanto o lncRNA5837 está localizado a jusante da família de genes RBP7. Por último, o lncRNA6099 está localizado a jusante do gene YAK. Para caracterizar os lncRNA na diferenciação dos stumpy forms, os lncRNA foram quantificados durante a formação de stumpy forms in vitro. Os níveis de transcritos de lncRNA não apresentaram alterações significativas durante a diferenciação para stumpy forms. Para testar a possibilidade de uma função dos lncRNA selecionados ao nível da formação de stumpy forms, determinámos o fenótipo na diferenciação para stumpy forms causado pela depleção ou sobre-expressão dos lncRNA. Contudo, as experiências apresentaram grande variabilidade e inconsistência, tornando-se difícil interpretar e concluir a função dos lncRNA na diferenciação dos stumpy forms. Assim, a continuação do estudo incidiu apenas no lncRNA5837, visto que é o lncRNA localizado a jusante de genes essenciais para a diferenciação dos stumpy forms, assim como para a regulação génica, a família génica RBP7. Além disso, este lncRNA apresenta um perfil de expressão semelhante ao RBP7 durante a diferenciação para stumpy forms. Durante a diferenciação in vitro para stumpy forms, a sobre-expressão de lncRNA5837, tal como a sobre-expressão de RBP7, resultou no aumento de células que expressam GFP, sugerindo isso que há promoção da diferenciação de stumpy forms. Por outo lado, a depleção de lncRNA5837, tal como a depleção de PP1, levou a que menos parasitas se diferenciarem para stumpy forms. Em condições que impedem a formação de stumpy forms, a sobre-expressão de lncRNA5837 é suficiente para induzir os slender forms a se diferenciarem em stumpy forms. Estes resultados são consistentes com o facto de a sobreexpressão de lncRNA5837 levar a uma diminuição da taxa de crescimento dos parasitas, característico da formação de stumpy forms, parasitas em fase G1. A localização celular do lncRNA5837 foi determinada usando RNA FISH. O lncRNA5837 está localizado no núcleo de T. brucei. Em slender forms, é possível observar diversos sinais de lncRNA5837 no núcleo, um sinal mais intenso no nucléolo e um sinal (por vezes, dois) no nucleoplasma. No entanto, os stumpy forms apresentam apenas lncRNA5837 no nucléolo, ainda que aparentemente mais intenso. Em suma, estes resultados sugerem que o lncRNA5837 atua na diferenciação para stumpy forms, através da sua função expressa no nucléolo de T. brucei.Trypanosoma brucei (T. brucei) is the parasite that causes African Human Trypanosomiasis (HAT), also known as sleeping sickness. During its complex life cycle, the parasite alternates between two different hosts, the insect vector and the mammalian host. To adapt and survive in these different environments, the parasite undergoes multiple developmental changes that require coordinated alterations in gene expression. In T. brucei, transcription control of protein-coding genes is scarce and most gene regulation depends on a post-transcriptional regulation. Slender-to-stumpy transition is triggered by an unknown stumpy induction factor (SIF) molecule, which parasites released via quorum-sensing mechanism. Recently, positive regulators of the quorum-sensing pathway have been identified in T. brucei, including an essential protein phosphate 1 (PP1) and stumpy-promoting RNA binding protein (RBP7). Long non-coding RNAs (lncRNAs) are RNAs with more than 200bp that do not encode for protein. In many organisms, lncRNA play important roles in gene regulation, including at post-transcriptional level. Although, our laboratory has recently revealed existence of 946 lncRNA genes in the T. brucei genome, yet any function has been found. We hypothesized lncRNA to control and coordinate gene expression during stumpy formation in T. brucei. The aim of my thesis was to identify lncRNAs that regulate the slender-to-stumpy transition. To that end, we established a reporter cell line, an in vitro culture condition and a gain- and loss-of-function approach to study the function of T. brucei lncRNAs in stumpy differentation. We performed a bioinformatic analysis and selected four lncRNAs based on their genomic location, postulating these lncRNAs to regulate stumpy formation by modulating the expression of their nearby stumpy essential genes. After performing a phenotypic screen for stumpy formation and more detailed experiments, we identified one lncRNA that regulate the slender to stumpy transition of T. brucei. Indeed, while the overexpression of lncRNA5837 promotes stumpy formation, its depletion conversely prevents slender to stumpy transition. Interestingly, the overexpression of lncRNA5837 induces stumpy formation even in absence of external stimulus that promotes parasite differentiation. As a consequence, we identified a new positive regulator of stumpy differentiation in T. brucei. Finally, using RNA FISH experiment, we observed that lncRNA5837 localized mainly in the nucleus of T. brucei. Strikingly, the slender to stumpy transition is associated with a relocalization of lncRNA5837 from the nucleoplasm into the nucleolus of stumpy forms. Altogether, these results suggest that lncRNA5837 regulate the slender-to-stumpy transition through its function inside the nucleolus. In this project, we identify and characterize the first function of a lncRNA in human deadly parasite, T. brucei. Indeed, the lncRNA5837 regulates the parasite differentiation from slender to stumpy forms, which is key process for transmission and infectivity of T. brucei parasite

Contribuição para o conhecimento da entomofauna presente na copa e no solo de pomares de castanheiro em produção biológica no norte de Portugal

A cultura do castanheira para fruta tem uma grande tradição em Portugal, sendo a Norte Interior do pais a principal região produtora, onde a castanha e uma fonte de rendimento para muitos agricultores. A existência de informação sobre a entomofauna presente quer na copa quer no solo dos soutos e reduzida, existindo apenas referencia ao bichado da castanha, Cydia splendana Hubner, e ao gorgulho, Curculio elephas Gyll., duas pragas importantes da fruta

Pragas associadas à castanha em Trás-os-Montes: biologia e estragos.

A castanha é uma das principais produções frutícolas de Trás-os-Montes, representando um peso na economia regional, em especial na Terra Fria. O fruto é atacado por algumas pragas e doenças que depreciam o seu valor comercial e causando perdas no rendimento dos agricultores. Este trabalho, teve por objectivo proceder a uma estimativa dos estragos provocados por pragas e doenças da castanha e por outro obter dados acerca da biologia do bichado da castanha, Laspeyresia (= Cydia) splendana (Hübner), a principal praga deste fruto na região, como primeiro passo para o delineamento de estratégias adequadas na protecção da castanha. Os estragos foram variáveis de acordo com o souto e ano, atingindo o máximo de 67,6% de frutos num dos soutos em 2004, sendo na sua maioria originados por pragas. Foram registadas capturas do bichado da castanha entre início de Julho e Outubro com um pico marcado em finais de Agosto/início de Setembro

Determinação de aditivos alimentares nos novos refrigerantes à base de água mineral

Os aditivos alimentares desempenham um papel vital na indústria alimentar moderna e são geralmente utilizados na manutenção da qualidade e das características dos alimentos, promovendo desta forma a segurança alimentar. Para garantir o consumo seguro de alimentos com aditivos, os Estados Membros da União Europeia devem estabelecer um sistema regular de vigilância para monitorização desse consumo. No sentido de obter essa informação, é necessário aplicar métodos de análise robustos de modo a quantificar os níveis dessas substâncias numa larga variedade de matrizes alimentares. O presente trabalho teve como objectivos: a determinação analítica do tipo e do teor de aditivos alimentares nos novos refrigerantes à base de água mineral através de um método de HPLC baseado na norma EN 12856, a validação do método analítico para a quantificação dos edulcorantes (acessulfame K, aspartame e sacarina) e dos conservantes (ácido sórbico e ácido benzóico) e a comparação dos resultados obtidos com os valores máximos permitidos pela legislação portuguesa. Dos refrigerantes à base de água existentes no mercado português, foram analisadas 34 amostras de diferentes marcas, para determinação do tipo e teor de aditivos. Na validação da metodologia foram avaliados os seguintes parâmetros: gama de trabalho, linearidade, sensibilidade, limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ), precisão (repetibilidade e precisão intermédia) e exactidão. Relativamente à análise dos edulcorantes, verificou-se a presença do acessulfame K em 12 refrigerantes numa concentração que oscilou entre 34 e 94 mg/L. O aspartame foi encontrado apenas em 5 amostras num intervalo de concentração de 36 a 159 mg/L e a sacarina não foi detectada. No caso dos conservantes, o ácido sórbico foi encontrado em 19 dos refrigerantes numa gama de concentração entre 109 e 283 mg/L enquanto que o ácido benzóico, presente em 18 amostras, apresentou um teor que variou entre 91 e 143 mg/L. Observou-se ainda que o teor de cada um dos aditivos nos diferentes refrigerantes não excedeu o limite máximo legislado

Ciclo biológico e estragos associados a monosteira, Monosteira unicostata (Mulsant & Rey, 1852), em amendoeira, no Planalto Mirandês

A monosteira, Monostelro unicostata (Mulsant & Rey, 1852), e considerada uma praga importante da amendoeira. Contudo, em Portugal, são escassos os conhecimentos acerca da sua biologia e dos estragos que ocasiona. Neste sentido, com o presente trabalho pretendeu-se par um lado estudar o cicio biológico do insecto em amendoeira no Planalto Mirandês, e por outro lado proceder a uma avaliação dos estraagos causados pela praga. O trabalho decorreu em 2007 e 2008 num amendoal localizado em Vilarinho dos Galegos (Mogadouro) onde, com periodicidade semanal ou quinzenal, se procedeu a recolha de 20 folhas em 20 árvores para observação (i) da existência de ovos, ninfas e adultos de monosteira e (ii) do numero de folhas com estragos visíveis. Paralelamente, e com periodicidade aproximadamente quinzenal foi realizada a técnica de pancadas em 25 arvores escolhidas aleatoriamente na parcela para quantificação dos adultos da praga

Atratores e dimensão fractal

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Matemática, 2013.Com o objetivo de obter atratores de semigrupos em espaço de Banach de dimensão infinita como objetos em espaços de dimensão finita estudamos condições sobre o semigrupo que asseguram que o atrator global possui dimensão de Hausdorff ou fractal ("upper"box-couting dimension) finita. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTIn order to obtain the attractors of semigroups in in nite dimensional Banach spaces as objects in nite dimensional spaces, we study conditions on the semigroups which guarantee nite Hausdorff, or fractal ("upper"box-counting dimension), dimension for the attractors