DESAFIOS NA PRODUÇÃO DO CONHECIMENTO EM BIOTECNOLOGIA

Um obstáculo para o Brasil ser reconhecido mundialmente por suas pesquisas em biotecnologia está na burocracia de processos para a aprovação de solicitações, incluindo autorizações de comitês de ética em pesquisa envolvendo seres humanos e animais, o acesso ao patrimônio genético nacional, autorizações estaduais e os pedidos de patentes. O objetivo deste trabalho foi apresentar fluxogramas dos trâmites de acesso às solicitações nas áreas biológicas e afins e as documentações exigidas em cada caso, de modo a servir como fonte de consulta para os pesquisadores na prática. Em razão do excesso de formulários, prazos, entre outras documentações regulamentares, existem resultados desfavoráveis relacionados à produção nacional científica, incluindo a produção de patentes nacionais. Embora a regularização governamental sobre o envolvimento de seres humanos e animais em pesquisas, o acesso ao patrimônio genético e o pedido de patentes sejam essenciais para a preservação da biodiversidade do país, a prevenção de danos e o respeito à propriedade, existem alguns entraves que geram reflexos negativos no crescimento científico nacional. Palavras-chave: Produção do conhecimento. Biotecnologia. Entraves burocráticos

Prevalência de polimorfismos nos genes ANKK1, DRD2, DRD3 e síndrome metabólica na esquizofrenia refratária

Objetivo: estimar a prevalência dos polimorfismos TaqIA, -141C e rs6280 dos genes ANKK1, DRD2 e DRD3 e avaliar sua associação com a ocorrência de síndrome metabólica em pacientes com esquizofrenia refratária. Método: estudo de delineamento transversal, realizado na Região Ampliada Oeste de Minas Gerais, que incluiu pacientes com esquizofrenia refratária em uso do antipsicótico clozapina. Foram coletados dados sociodemográficos, clínicos, antropométricos, bioquímicos e genéticos. Realizou-se análise univariada dos dados. Resultados: participaram 72 pacientes e observou-se a ocorrência de Síndrome Metabólica em 47,2%, não sendo encontrada associação da Síndrome Metabólica com os polimorfismos estudados. Houve diferença estatisticamente significante com o parâmetro do baixo HDL com genótipo homozigoto para alelo C do polimorfismo -141C do gene DRD2. Conclusão: evidenciou-se prevalência de SM elevada. O polimorfismo -141C associou-se ao baixo HDL. A análise genética e a identificação de alterações metabólicas, neste grupo de pacientes, podem nortear o tratamento medicamentoso e propiciar melhor qualidade de vida.Objective: to estimate the prevalence of TaqIA, -141C and rs6280 polymorphisms of the ANKK1, DRD2 and DRD3 genes and evaluate their association with the occurrence of metabolic syndrome in patients with refractory schizophrenia. Method: cross-sectional study conducted in the Extended Western Region of Minas Gerais, with refractory schizophrenic patients using the antipsychotic clozapine. Sociodemographic, clinical, anthropometric, biochemical and genetic data were collected. Univariate analysis of the data was performed. Results: seventy-two patients participated in the study and the occurrence of Metabolic Syndrome was observed in 47.2% of them. There was no association between Metabolic Syndrome and the studied polymorphisms. There was a statistically significant difference in the low HDL parameter with homozygous genotype for the C allele of the -141C polymorphism of the DRD2 gene. Conclusion: a high prevalence of MS was evidenced. The -141C polymorphism was associated with low HDL. Genetic analysis and identification of metabolic alterations in this group of patients can guide drug treatment and provide a better quality of life.Objetivo: estimar la prevalencia de los polimorfismos TaqIA, -141C y rs6280 de los genes ANKK1, DRD2 y DRD3 y evaluar su asociación con el síndrome metabólico en pacientes con esquizofrenia refractária. Método: estudio de delineamiento transversal, realizado en la Región Ampliada Oeste de Minas Gerais, que incluye pacientes con esquizofrenia refractária usando el antipsicótico clozapina. Fueron recogidos datos sociodemográficos, clínicos, antropométricos, bioquímicos y genéticos. Se realizó um análisis univariada de los datos. Resultados: participaron 72 pacientes y se observó el Síndrome Metabólico en 47,2%, no siendo encontrada una asociación del Síndrome Metabólico con los polimorfismos estudiados. Hubo diferencia estadísticamente significante con el parámetro del bajo HDL con genotipo homozigoto para alelo C del polimorfismo -141C del gen DRD2. Conclusión: se vio una prevalencia de SM elevada. El polimorfismo -141C se asoció al bajo HDL. El análisis genético y la identificación de alteraciones metabólicas, en este grupo de pacientes, pueden guiar al tratamiento medicamentoso y propiciar mejor calidad de vida

The importance of heat against antinutritional factors from Chenopodium quinoa seeds

Chenopodium quinoa seeds have high protein content. The nutritional value of quinoa is superior compared with traditional cereals. Its essential amino acid composition is considered next to the ideal, and its quality matches that of milk proteins. In this study, the seed storage proteins from Chenopodium quinoa were extracted, fractionated, partially purified, and characterized. The structural characterization was performed by Tricine-SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis, and it confirmed the presence of proteins of molecular weight of 30 and 7kDa, probably corresponding to lectins and trypsin inhibitors, respectively. The functional characterization of these proteins evidenced their activity as antinutritional factors due to their in vitro digestibility. Quinoa proteins have an excellent amino acid composition with many essential amino acids. In vitro digestibility evaluation indicated that heat-treated samples showed a more complete digestion than the native state samples. Quinoa seeds can be an important cereal in human diet after adequate heat treatment

Antibacterial and antiviral properties of Chenopodin-derived synthetic peptides

Antimicrobial peptides have been developed based on plant-derived molecular scaffolds for the treatment of infectious diseases. Chenopodin is an abundant seed storage protein in quinoa, an An-dean plant with high nutritional and therapeutic properties. Here, we used computer- and physico-chemical-based strategies and designed four peptides derived from the primary structure of Che-nopodin. Two peptides reproduce natural fragments of 14 amino acids from Chenopodin, named Chen1 and Chen2 and two engineered peptides of the same length were designed based on the Chen1 sequence. The two amino acids of Chen1 containing amide side chains were replaced by ar-ginine (ChenR) or tryptophan (ChenW) to generate engineered cationic and hydrophobic peptides. The evaluation of these 14-mer peptides on Staphylococcus aureus and Escherichia coli showed that Chen1 does not have antibacterial activity up to 512 µM against these strains, while other peptides exhibited antibacterial effects at lower concentrations. The chemical substitutions of glutamine and asparagine by amino acids with cationic or aromatic side chains significantly favoured their antibacterial effects. These peptides did not show significant hemolytic activity. Fluorescence mi-croscopy analysis highlighted the membranolytic nature of Chenopodin-derived peptides. Using molecular dynamic simulations, we found that a pore is formed when multiple peptides are as-sembled in the membrane. Whereas some of them form secondary structures when interacting with the membrane, allowing water translocations during the simulations. Finally, Chen2 and ChenR significantly reduced SARS-CoV-2 infection. These findings demonstrate that Chenopodin is a highly useful template for design, engineering, and manufacturing of non-toxic, antibacterial, and antiviral peptides

Purificação e caracterização de fosfatase acida da semente de mamona (Ricinus communis)

Orientador: Hiroshi AoyamaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A fração AP1 da Fosfatase Ácida (E.C. 3.1.3.2.) foi detectada e parcialmente purificada de sementes de mamona (Ricinus communis ) através de colunas cromatográficas como SP-Sephadex, DEAE-Sephadex, Sephacryl S-200 e Concanavalina A Sepharose 4B. A enzima foi purificada até a homogeneidade 2.100 vezes, com atividade específica de 230 mmol min-1. A massa molecular relativa, determinada através de coluna Shim pack diol150 (Shimadzu HPLC), foi de 60 KDa. A fração AP1 apresenta uma porção de carboidrato na estrutura proteica e se liga a resina de Concanavalina A Sepharose 4B. A fração revela apenas uma banda difusa de atividade por eletroforese em condições não desnaturantes pH 8,3. As propriedades cinéticas da fosfatase ácida de sementes de mamona foram estudadas e a enzima apresentou alta atividade em pH 5,5. O valor da Km de 0,52 mM foi determinado utilizando p-nitrofenilfosfato como substrato em pH 5,5 a 37°C. Usando o pNPP como substrato, nenhum efeito na atividade fosfatásica foi observado na presença de EDTA, DTT b3-mercaptoetanol. Porém a atividade enzimática foi inibida por fosfato inorgânico, fluoreto, molibdato, vanadato, CU2+ e Zn2+. A fosfatase ácida de sementes de mamona não catalisou reações de transfosforilação devido não se ter observado nenhuma estimulação da atividade enzimática utilizando aceptores de fosfato, como glicerol, metanol e etanolAbstract: The acid phosphatase (E.C. 3.1.3.2) AP1 form has been detected and partially purified from castor bean (Ricinus communis) seeds through SP-Sephadex, DEAE-Sephadex, Sephacry1 S-200 and Concanavalin. A chromatographies. The enzyme was purified to homogenity 2,100-fold, with a specific activity of 230 mmol min-1 . Relative molecular mass, determined by Shim pack diol150 column (Shimadzu HPLC), was found to be 60 KDa. AP1 presented a carbohydrate moiety in its proteic structure and binds to concanavalin A Sepharose. The fraction revealed a single phosphatase activity diffuse band on nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis, at pH 8.3. The acid phosphatase purified from castor bean seeds studied here presented a high activity at pH 5.5. An apparent Km of 0.52 mM was found for p nitrophenylphosphate, at pH 5.5 and 37°C. Using pNPP as substrate, no effect was observed on the acid phosphatase activity in the presence of EDT A, dithiothreitol, and b-mercaptoethanol. The enzyme was inhibited by inorganic phosphate, fluoride, vanadate, molybdate, CU2+ and Zn2+. The castor bean seeds acid phosphatase did not catalyze the transphosphorylation reaction since no stimulation was observed with inorganic phosphate acceptors, such as glycerol, methanol and ethanolMestradoBioquimicaMestre em Ciências Biológica

Estudos cineticos, fisico-quimicos e conformacional da fosfatase acida de sementes de mamona (Ricinus communis)

Orientador: Hiroshi AoyamaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O presente trabalho contém dados sobre estudos cinéticos, físico-químicos e conformacional da fosfatase ácida de sementes de mamona. Através do enfoque cinético foram estudados efeitos de inibidores e determinados os aminoácidos presentes no sítio ativo ou importantes para a catálise. Para fosfato, molibdato e o-vanadato as inibições foram do tipo competitiva, com valores de Ki 0,14 mM, 10 x 10-6 mM e 1,6 x 10-3 mM, respectivamente. Por outro lado, na presença de fluoreto a inibição foi do tipo mista, com valores de Kic e Kiu de 0,91 mM e 0,42 mM, respectivamente. Nos estudos sobre estabilidade térmica observou-se que a enzima perdeu 80% de sua atividade quando incubada a 60°C por 15 mino Na presença de 10 mM de p-nitrofenol e fosfato inorgânico, a perda foi de 40%. Na determinação dos aminoácidos presentes no sítio ativo da enzima utilizando-se agentes modificadores, observou-se que a fosfatase ácida de sementes de mamona era inativada em 5010 por ácido iodoacético (IA A), que atua em grupos SH, sendo esta inativação tempo e concentração dependente. Observou se a presença de duas cisteínas no sítio ativo, com valor de constante bimolecular igual 2,9 X 10-4 M-1 S-I. Do ponto de vista físico-químico e conformacional, determinou-se o ponto isoelétrico da enzima, o seu conteúdo em carboidrato e realizou-se um estudo de desnaturação da enzima, por temperatura e por agentes caotrópicos. A fosfatase ácida de sementes de mamo na apresentou um ponto isoelétrico de 4,6 e um conteúdo de carboidratos de 40%, sendo glicose o único monossacarídeo detectado. A desnaturação da enzima na presença de agentes caotrópicos, como uréia e cio reto de guanidina, mostrou ser reversível. Foram determinados os parâmetros termodinâmicos como variação de energia livre {_G(HzO)}, concentração do composto que causa 50'0 de desnaturação (D1/z) e o intercepto da transição desnaturante (m), cujos valores foram 4,9 Kcal mol-l, 4,95 M e 0,991 Kcal mol-l M-l, em presença de uréia, e 4,98 Kcal mol-l, 2,35 M e 2,118 Kcal mol-l M-l em presença de GndHCl, respectivamente. Na desnaturação térmica o desnovelamento da enzima resultou em aumento da absorbância, com formação de agregados quando a temperatura foi superior a 90°C. Porém, este efeito não foi observado quando a desnaturação da enzima ocorreu na presença de 10 mM de pNP e Pi. Porém, o processo de desnaturação térmica da enzima apresentou ser i rreversíve I em ambas as situações. Por fim foram estudadas algumas propriedades da enzima após remoção da porção de carboidrato pela endoglicosidase H. Observou-se o aparecimento de um pH ótimo adicional em 3,5, uma diminuição de duas vezes na constante de especificidade para o substrato p-nitrofenilfosfato, um aumento do ponto isoelétrico para 4,75 e uma diminuição da heterogeneidade da banda de proteína em eletroforese de gel de poliacrilamida. Nos estudos de germinação foram determinadas as atividades fosfatásicas dos extratos de plântulas germinadas durante um período. A enzima apresentou picos de atividade fosfatásica nos 79., 59. e 99. dias utilizando pNPP, PEP, PPi e Tyr-P como substratos, respectivamente. Porém, durante este período não foi observada atividade fosfatásica na presença de ácido fítico. A quantidade de proteínas aumentou durante a germinação ao passo que a quantidade de fosfato diminuiAbstract: This work contains results about kinetic, physico-chemical and conformationalstudies of castor bean seed acid phosphatase. About kinetic approaches we studied the effect of inhibitors and determined the amino acids present in the active site. Inorganic phosphate, molybidate and o vanadate were competitive inhibitors, with Ki values of 0,14 mM, 10 x 10-6 mM e 1,6 X 10-3 mM, respectively. On the other hand, fluoride inhibition was of the mixed type, with Kic and Kiu values of 0.91 mM and 0.42 mM, respectively. The thermal stability studies showed that the enzyme lost 80% of activity when incubated at 60°C for 15 mino But, in the presence of 10 mM of p-nitrophenol and Pi the enzyme lost 40% of activity. 5tudying the amino acids present in the active site by using modifying reagents, we observed that castor bean seed acid phosphatase was inactivated 50% in the presence of IAA, that acted sulfhydryl groups, in an inactivation time- and concentration-dependent. The acid phosphatase has two cysteines in its active site, with bimolecular constant value of 2.9 X 10-4 M-1 S-I. In the physico-chemical and conformational approaches, we determined the isoeletric point, the carbohydrate composition and denaturation studies in the presence of caotropic agents and temperature. The acid phosphatase has a pI value of 4.6 and contained 40% of carbohydrate in its structure, and glucose was the only monossacharide found in the composition. The enzyme denaturation in the presence of caotropic agents, as urea and GndHCl, showed to be reversible. The thermal parameters such as f1G (HzO), DlIz and m were determined to be 4.9 Kcal mol-l, 4.95 M and 0.991 Kcal mol-l, in the presence of urea, and 4.98 Kcal mol-l, 2.35 M and 2.118 Kcal mol-l, in the presence of GdnHCl, respectively. In the thermal denaturation, the enzyme unfolded as aggregate when the temperature was ligher than 90°C. This aggregation was not observed when the enzyme was incubated in the presence of 10 mM pNP and Pi. In both cases the process of denaturation was irreversible. Finally, we studied some properties of the enzyme after carbohydrate remotion by endoglicosidase H. We observed an additional optimum pH of 3.5, a decrease in the specificity constant using pNPP as substrate, a increasing in the pI value and a decrease in the carbohydrate heterogeneity migration in SDS-PAGE. This work contains also some germination studies of castor bean seeds, with determination of acid phosphates activity using pNPP, Tyr-P and PPi as substrates. The peaks of acid phosphatase activity using pNPP, PEP, PPi and Tyr-P as substrates were 7th, 5th and 9th, respectively. The protein concentration increase during germination whi le phosphate concentration decreaseDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecula