P2 purinoceptors signaling in fibroblasts of rat subcutaneous tissue

Mestrado em Biologia Molecular e CelularO tecido conjuntivo parece estar envolvido na génese de diversas condições patológicas. O aumento da rigidez do tecido conjuntivo, resultante da fibrose, pode constituir um factor importante no mecanismo patogénico da dor crónica resistente a fármacos (Langevin & Sherman, 2007). Por outro lado, os nucleótidos extracelulares parecem estar envolvidos na fisiopatologia da dor crónica (Burnstock, 2001). Assim, este estudo teve como objectivo averiguar o efeito dos nucleótidos de adenina e uridina na proliferação e síntese de colagénio tipo I de fibroblastos do tecido subcutâneo de rato em cultura. Os resultados obtidos mostram que a incubação com UTP (0.3-100 M, n=5) induz um aumento da proliferação e da produção de colagénio tipo I, o qual é dependente da concentração. Contrariamente, o agonista selectivo dos receptores P2Y2, o MRS 2768 (10 μM, n=3), não teve qualquer efeito no que se refere à proliferação, mas diminuiu significativamente (P<0.05) a síntese de colagénio tipo I. Uma vez que o aumento da produção de colagénio induzida pelo UTP (100 μM) foi proporcional ao aumento do número de células (proliferação celular),podemos especular que este aumento se deve ao aumento do número de células per si do que a uma maior actividade sintética de cada célula. Assim, ao normalizar os valores do colagénio tipo I em relação aos valores obtidos do MTT para os mesmos momentos/dias, deixamos de observar diferenças estatisticamente significativas entre o controlo e as células expostas ao UTP. Uma vez que os receptores P2Y2 não parecem estar envolvidos nesta resposta do UTP (100 μM), esta poderá estar a ser mediada pela activação dos receptores P2Y4 e/ou P2Y6. Considerando que o RB-2 (10 μM, n=5), um antagonista não selectivo que actua preferencialmente no subtipo de receptores P2Y4, não foi capaz de modificar a resposta induzida pelo UTP (100 μM), os receptores P2Y4 parecem também não estar envolvidos. Por outro lado, o MRS 2578 (100 nM), um antagonista selectivo dos receptores P2Y6, atenuou de forma significativa o aumento induzido pelo UTP (100 μM). A corroborar os nossos resultados, uma análise imunocitoquímica mostrou uma imunorreactividade positiva contra os receptores P2Y2 e P2Y6, mostrando um padrão de marcação citoplasmático/membranar, o qual é típico para este tipo de receptores, ao contrário do padrão nuclear exibido pelo anticorpo contra os receptores P2Y4. Relativamente ao envolvimento dos receptores sensíveis ao ADP, os resultados obtidos mostraram que o ADPβS (10-100 μM, n=3-6), um análogo estável do ADP, não parece induzir efeitos significativamente diferentes (P>0.05) na proliferação celular. Contudo, a sua incubação continuada aumentou a produção de colagénio tipo I de forma dependente da concentração (P<0.05). De modo a identificar os receptores purinérgicos envolvidos neste efeito, testamos o ADPβS (100 μM) na presença do MRS 2179 (0.3 μM), do AR-C 66096 (0.1 μM), e do MRS 2211 (10 μM), os quais antagonizam selectivamente os receptores P2Y1, P2Y12 e P2Y13, respectivamente. O efeito facilitatório induzido pelo ADPβS (100 μM) foi atenuado de forma significativa na presença do antagonista dos receptores P2Y1, o MRS 2179 (0.3 μM, n=3), sem ser afectado pelo antagonista dos receptores P2Y12, o AR- C 66096 (0.1 μM, n=3). Pelo contrário, o MRS 2211 (10 μM, n=2) potenciou o aumento da produção de colagénio induzida pelo ADPβS (100 μM), indicando assim que a síntese de colagénio tipo I induzida pelo receptor P2Y1 pode estar a ser parcialmente influenciada por uma activação síncrona do receptor inibitório P2Y13. Por último, uma análise por imunocitoquímica mostrou que estas células apresentam imunorreactividade positiva para os receptores P2Y1 e P2Y13, exibindo um padrão citoplasmático/membranar, contrariamente ao padrão nuclear dos receptores ostentado pelo anticorpo contra os receptores P2Y12. Concluindo, a remodelação da fáscia superficial induzida pelos fibroblastos parece ser regulada por um balanço entre a activação dos receptores P2Y2 e P2Y6, assim como dos receptores P2Y13 e P2Y1. Clarificar as vias que conduzem ao processo de fibrose pode representar uma oportunidade para esclarecer o seu envolvimento na patogénese da dor crónica musculo-esquelética, bem como ser útil no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.Connective tissue may be involved in the pathogenesis of a wide variety of disease conditions. Increased connective tissue stiffness due to fibrosis may be an important link to the pathogenic mechanism leading to drug-resistant chronic pain (Langevin & Sherman, 2007). In addition, extracellular nucleotides seem to be involved in the pathophysiology of chronic pain (Burnstock, 2001). Therefore, we aimed at investigating the effect of adenine and uridine nucleotides on the proliferation and synthesis of type I collagen by rat fibroblasts from subcutaneous connective tissue. The results showed that continuous incubation of UTP (0.3-100 M, n=5) concentration-dependently increased fibroblasts proliferation, as also increased the synthesis of type I collagen above the control levels. Conversely, the selective P2Y2 agonist, MRS 2768 (10 μM, n=3), was devoid of effect in what concerns proliferation, but significantly (P<0.05) decreased type I collagen synthesis. Since the increase in type I collagen synthesis induced by UTP (100 μM) was proportional to the increase in the amount of cells in the culture (fibroblasts proliferation), we speculated that such an increase could be related to the increase in the cell number rather than a higher synthetic activity. Thus, we performed a more detailed data analysis, in which we normalized type I collagen production taking into consideration the MTT values obtained at the same time points, and we observed no longer significant differences between control and UTP-exposed cells. Discounting the contribution of MRS 2768-sensitive P2Y2 receptors, UTP (100 μM)-induced increase in cells proliferation could be due to P2Y4 and/or P2Y6 receptor activation. Since RB-2 (10 μM, n=5), a non-selective antagonist that acts preferentially on the P2Y4 subtype, did not modify the effect of UTP (100 μM), P2Y4 does not seem to be involved. In turn, MRS 2578 (100 nM), which is a selective P2Y6 antagonist, significantly attenuated UTP (100 μM)-induced increase. To corroborate our results, an immunocytochemistry analysis showed a positive immunoreactivity against the P2Y2 and P2Y6 receptors exhibiting a cytoplasmic/membrane labeling pattern, which is typical for those receptors in many different cells, conversely to the nuclear labeling pattern exhibited by the antibody against the P2Y4. To investigate the involvement of ADP-sensitive P2 receptors on cell proliferation and extracellular matrix production, fibroblast cultures were continuously incubated with the stable ADP analogue, ADPβS (10-100 μM). Results obtained with ADPβS (10-100 μM, n=3-6) showed no significant (P>0.05) differences in fibroblast cells proliferation. However, a continuous incubation with ADPβS (10-100 μM, n=2-5) concentration-dependently increased type I collagen production by fibroblasts (P<0.05). In order to identify which purinoceptor(s) that could be mediating this effect, we tested ADPβS (100 μM) in the presence of MRS 2179 (0.3 μM), AR-C 66096 (0.1 μM), and MRS 2211 (10 μM), which antagonize selectively ADP-sensitive P2Y1, P2Y12 and P2Y13 receptors, respectively. The facilitatory effect of ADPβS (100 μM) was significantly attenuated in the presence of the P2Y1 antagonist, MRS 2179 (0.3 μM, n=3), without being affected by the P2Y12 antagonist, AR- C 66096 (0.1 μM, n=3). In contrast, MRS 2211 (10 μM, n=2) potentiated the effect of ADPβS (100 μM) on type I collagen synthesis, thus indicating that the P2Y1-receptor-induction of type I collagen synthesis may be partially counteracted by synchronous activation of the inhibitory P2Y13 receptor. Finally, an immunocytochemistry analysis showed that these cells exhibit immunoreactivity to P2Y1 and P2Y13 receptors with a cytoplasmic/membrane staining pattern, conversely to the nuclear pattern of P2Y12. Concluding, a delicate balance between the activation of P2Y2 and P2Y6, as well as P2Y13 and P2Y1 purinoceptors, might regulate fibroblast’s induced superficial fascia remodeling. Targeting the pathways leading to fibrosis may represent an opportunity to clarify its involvement in the pathogenesis of musculoskeletal chronic pain and it may be useful for designing novel therapeutic strategies to overcome this disease

O salvamento em direito dos seguros: reflexão sobre o ónus de afastamento e mitigação dos danos ocasionados pelo sinistro

Divulgação dos SUMÁRIOS das obras recentemente incorporadas ao acervo da Biblioteca Ministro Oscar Saraiva do STJ. Em respeito à lei de Direitos Autorais, não disponibilizamos a obra na íntegra.Localização na estante: 368(469) F383

Collection and organization of a standard and blood metabolite NMR library for the metabolomics analysis

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019Um atual desafio nos estudos metabolómicos é o baixo número de metabolitos identificados em comparação com o grande número de metabolitos existentes nos fluidos biológicos. A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é uma das tecnologias mais usadas para tentar superar este problema. Através da construção de bibliotecas de metabolitos, é possível aumentar o conhecimento nesta área e aumentar a possibilidade da sua deteção com esta tecnologia e caraterizar os seus desvios químicos e multiplicidade. Esta informação fornece um conhecimento importante que ajudará na identificação de metabolitos quando amostras mais complexas, como por exemplo o sangue, forem analisadas. Amostras como o soro/plasma apresentam uma complicação extra quando este tipo de análise é aplicada. A alta concentração de proteínas no sangue provoca interferências nos espectros de RMN. As proteínas originam sinais amplos nos espetros padrão do protão (1H) e impedem a deteção de metabolitos, de baixo peso molecular. Este fenómeno pode ser superado através dos espetro de RMN 1H editado por T2, porém as informações dos metabolitos que se ligam às proteínas serão perdidas. Assim, primeiro os metabolitos devem ser separados das proteínas e, em seguida, as proteínas devem ser removidas. Para atingir o primeiro objetivo foram adicionadas às amostras de soro/plasma substâncias que influenciam a ligação entre proteínas. Essas substâncias podem fazer precipitar proteínas, por exemplo guanidina e sulfato de alumínio, ou funcionar como um ligando das proteínas, hexafluorobenzeno. Em seguida, para remover as proteínas, foram testados diversos métodos referidos na literatura e selecionados os três métodos que se apresentaram mais vantajosos e que mostraram melhores resultados. Destes, dois deles são métodos orgânicos, precipitação de proteínas com metanol e precipitação de proteínas com metanol-diclorometano, e um deles é baseado em propriedades físicas, ultrafiltração. Dos 65 metabolitos que se pretendia identificar, foi possível identificar 64 na biblioteca de metabolitos e 54 nas amostras de sangue. Comparando os diferentes métodos testados, alguns deles demonstraram ser mais eficientes na remoção de proteínas, no entanto alguns dos metabolitos desapareceram, enquanto outros métodos foram capazes de conjugar a remoção de proteínas com uma maior deteção de metabolitos. Os espetros das amostras de soro/plasma contêm ainda muitos sinais não identificados. No futuro, novas experiências para os identificar são necessárias.An ongoing challenge in metabolomics is the low number of metabolites identified compared with the huge number of existing metabolites in biofluids. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is one of the technologies that have been used to try to overcome this problem. Through the construction of a metabolite library it is possible to increase the number of known metabolites detected with this technology and establish the chemical shifts and signal multiplicities of the metabolites. This provides a valuable knowledge that will help when more complex samples, as blood, are analysed. However, serum/plasma samples show complications when this type of analysis is applied. The high protein content in blood induces interferences in NMR spectra. Proteins give broad signals to standard proton (1H) NMR spectrum and prevent the detection of low-molecular weight metabolites. This can be overcome by measuring T2-edited 1H NMR spectrum but the information from metabolites that bind to proteins will be lost. Thus, first metabolites should be separated from proteins and then the proteins should be removed. To accomplish the first goal, substances that influence the linkage between proteins and metabolites were added to serum/plasma samples. These substances could either precipitate proteins, guanidine and aluminium sulphate, or function as a protein ligand, hexafluorobenzene. Then, to remove proteins, through the many different methods referred in the literature, the three methods with the best results and the most advantages were chosen. Two of them are organic methods, protein precipitation with methanol and protein precipitation with methanol-dichloromethane, and one is a physical method, ultrafiltration. From the 65 metabolites intended to be identified, it was possible to identify 64 of them in the metabolite library and, from these, 54 were present in blood samples. Comparing the different methods tested, some of them were more efficient removing proteins, however some metabolites disappeared, while others were able to conjugate the removal of proteins with the detection of more metabolites. Besides that, there are still many unidentified signals in the serum/plasma spectra. In the future, further experiments to identify these signals are required.University of Eastern Finland, Hospital Lusíadas Lisboa, Farmácia Holon do Campo Grand

Polyglutamine diseases (PolyQ): construction and characterization of yeast models

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e TecnologiaThere are a number of serious diseases which have in common the inappropriate folding of a particular protein, as polyglutamine disease group. Machado-Joseph‟s and Huntington‟s disease are grouped in the polyglutamine diseases, being the cause of the disease the presence of a CAG repeat tract in the causative gene, ATXN3 and HTT, respectively. This CAG repeats tract leads to the formation of polyglutamine tract in ataxin-3 and huntingtin proteins, respectively, that do not allow the correct protein folding. In diverse models, the expansion of the poluglutamine tract into disease related-proteins, promote their aggregation and their negative effect on cellular metabolism were described as associated to toxic effect. In this study, it was proposed the construction of the first yeast model for Machado-Joseph‟s disease and the characterization of the role of autophagy in the yeast model for Huntington‟s disease during yeast life cycle. For the yeast model for Machado-Joseph‟s disease we successfully constructed a Tet On system harboring the variant 1 genes, normal and expanded, fused with GFP gene, to further allow the subcellular localization of the expressed protein into yeast cells. In yeast model for Huntington‟s disease the chronological lifespan (CLS) of yeast cells at different physiological states after expressing the normal and the pathogenic protein and their subcellular localization, using epifluorescent microscopy was studied. It was demonstrated that cells harboring the huntingtin with 103 glutamines (pathogenic protein) during the inhibition of autophagic process, by chloroquine, presents an increased in CLS and the formation of large foci that could correspond to aggregosomes. In aged cells this effect is more pronounced leading to the hypothesis that in these cells the autophagic mechanism is impaired and enhances the toxic effects of expressed huntingtin 103Q and that the inhibition of the autophagic process can rescue the cells from the toxic effects. On the other hand, when the normal huntingtin (25Q) was expressed at exponential phase the inhibition of autophagy led to a drastic decrease on CLS, demonstrated that in functional cells the autophagy had a positive effect being a crucial process, probably removing unwanted intracellular components and providing energy

Vitamins as regulators of immune cells and immune functions

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2022As vitaminas são micronutrientes essenciais que o ser humano não consegue sintetizar ou que não sintetiza em quantidades suficientes. Têm de ser fornecidas através da dieta, ou através da sua produção pelas bactérias comensais. As vitaminas têm um papel em diversos eventos biológicos, nomeadamente na regulação de respostas imunes, pelo que, quando se encontram em concentrações deficientes aumentam o risco de desregulação imunológica. Nos últimos anos, nas sociedades ocidentais, temos assistido a um aumento de incidência de doenças autoimunes/inflamatórias e cancro, apontando para uma maior influência de fatores ambientais em oposição aos fatores genéticos. O cancro é a segunda causa de morte no mundo. Desta forma, é importante perceber as interações entre o microambiente tumoral e o sistema imune; como é que as células tumorais conseguem escapar à vigilância imune e proliferar. Um dos tratamentos mais inovadores contra o cancro é a imunoterapia, capaz de estimular as células imunes contra as células tumorais. Quando funciona, pode ser revolucionária, no entanto, apenas uma minoria de pacientes beneficia dela. As vitaminas influenciam as respostas das células imunes e as células imunes são essenciais no desenvolvimento do cancro. Será que componentes da dieta, como as vitaminas, podem influenciar células tumorais através da sua ação nas células imunes? Nesta revisão, pretendemos abordar os principais conhecimentos existentes acerca das funções das vitaminas A, C e D nas respostas imunes, com particular foco na ação destas sobre as principais células imunes na homeostase, bem como o seu potencial modulador das respostas linfocitárias com impacto no crescimento e tratamento neoplásico. Utilizou-se o PubMed para pesquisa bibliográfica e selecionou-se artigos originais e algumas revisões de 2011 até 2021.Vitamins are essential micronutrients that human organism cannot synthesize or does not synthesize in sufficient quantities. Consequently, vitamins need to be supplied by the diet or commensal bacteria. They have diverse functions in many biological events, including regulation of immune responses, leading to increased susceptibility to immune dysregulation and immune-related diseases, when lacking. Clinical evidence points to a continuous rise in autoimmune/inflammatory diseases and cancer throughout westernized societies over the past decade, suggesting to a stronger influence of environmental factors as opposed to genetic factors. Cancer is the second most common cause of death worldwide. Hence, it is urgent to understand the tumour microenvironment, the interactions between tumour and immune cells, and how cancers manage to escape the immune surveillance and progress. Immunotherapies are one of the most innovative treatments in cancer, enhancing immune system to fight against tumour cells. When immunotherapy works, the result can be life-changing, unfortunately, only a minority of patients benefit from it. Vitamins influence immune cells responses and immune cells are key players in the initiation and development of cancer. Hence, can dietary components, such as vitamins, impact the cancer growth by their action on immune cells? In this review, we intend to discuss the progress regarding the immune function of vitamins A, C and D with a particular focus on how they influence key immune players in steady state, as well as their potential role as immune modulators of antitumoral lymphocytes responses and as co-adjuvant of immunotherapies, such as immune checkpoint inhibitors. The literature research was conducted using the electronic database PubMed and were selected original articles and few reviews from 2011 up to 2021

Celebrity endorsement advertising campaign : can celebrity endorsement change PT Comunicações customer’s negative predisposition to the brand?

This marketing teaching case study aimed to understand how an incumbent company in the Portuguese telecommunication sector dealt with the increase in market competition. Despite the liberalization of telecommunication market in 2000, PT Comunicações, a company of Portugal Telecom Group was still understood as a monopolist and arrogant brand by its customers in the beginning of 2006. In this scenario, PT Comunicações marketing managers knew that it was urgent to change the communication strategy followed up until that moment if PT Comunicações wanted to maintain the leadership in the market. Thereafter, was developed a new endorsement advertising campaign with humorist group Gato Fedorento. The purpose of this case study is to act as teaching tool. Students are confronted with real business life situation of understanding if using the mix of humor and celebrity endorsement in advertising campaigns was the best communication strategy to follow

Comunicación como expresión de la atención humanizada en el final de la vida: una revisión sistemática

Objective: to identify the communication strategies that promote the humanization of health care provided to adult/older adult patients hospitalized at the end of life. Method: systematic review carried out with primary studies from EBSCO, PubMed, CINAHL, MEDLINE, LILACS, Web of Knowledge, and B-On databases, and SciELO and Cochrane digital libraries, between November 2012 and January 2013, selected according to the PIOS method, from the following question: What are the communication strategies that promote the humanization of health care in the interaction between nurses and adult/older adult patients at the end of life? Results: the articles selected demonstrated the urgent need to acquire specific skills in the field of communication, in order to promote a dignified end of life. Conclusion: regardless of experience, or even the ability to deal with the proximity of death, it is extremely important to develop strategies that are not exclusively based on verbal expression, but also on nonverbal signals, in order to promote a positive health care experience.Objetivo: identificar as estratégias comunicacionais promotoras da humanização do cuidado ao paciente adulto/idoso hospitalizado em fim de vida. Método: revisão sistemática resultante da pesquisa de estudos primários nas bases de dados EBSCO, PubMed, CINAHL, MEDLINE, LILACS, Web of Knowledge, B-On e nas bibliotecas virtuais SciELO e Cochrane, entre novembro de 2012 e janeiro de 2013, selecionados de acordo com o método PIOS, a partir da seguinte questão: Quais são as estratégias comunicacionais promotoras da humanização dos cuidados na interação enfermeiro-pessoa adulta/idosa em fim de vida? Resultados: os artigos selecionados evidenciam a necessidade premente de adquirir competências específicas na área da comunicação, para que se possa promover um fim de vida digno. Conclusão: independentemente da experiência, ou até mesmo da preparação para lidar com a proximidade da morte, revela-se extremamente importante desenvolver estratégias que não passem exclusivamente pela expressão verbal, mas também pelos sinais não verbais, de forma a promover uma experiência de cuidado positiva.Objetivo: identificar las estrategias de comunicación que promuevan la humanización de la atención al paciente adulto/adulto mayor hospitalizado en el final de la vida. Método: revisión sistemática llevada a cabo con estudios primarios de las bases de datos EBSCO, PubMed, CINAHL, MEDLINE, LILACS, Web of Knowledge y B-On, y en las bibliotecas virtuales SciELO y Cochrane, entre noviembre de 2012 y enero de 2013, seleccionados según el método PIOS con la siguiente pregunta: ¿Cuáles son las estrategias de comunicación que promueven la humanización de la atención en la interacción entre enfermeros y adultos/adultos mayores en el fin de la vida? Resultados: los artículos seleccionados demuestran la urgente necesidad de adquirir habilidades específicas en el área de comunicación, con el fin de promover un final de vida digno. Conclusión: independientemente de la experiencia, o incluso la habilidad para lidiar con la proximidad de la muerte, es extremadamente importante desarrollar estrategias que no se basen exclusivamente en la expresión verbal, sino también en las señales no verbales, para fomentar una experiencia positiva de cuidados

Internationalization process of SkyPro Shoes in the Middle East

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Management from the NOVA – School of Business and EconomicsThis Work Project is integrated on SME Competitiveness: internationalization strategy field lab and its aim is to study a Portuguese SME. Abotoa is a small and medium enterprise that sells corporative footwear to a specific niche market – airline industry. The main goal of internationalization of this company is to increase both sales and profitability, which is Skypro’s major short/medium-term goal. Since the Portuguese market has already saturated, Skypro sells to almost all Portuguese airline companies and Skypro has already tried to reach new markets by internationalization. The Middle East appears to Skypro as one of the best regions to expand its sales. It is a region where the majority of the airline companies provide footwear to its employees and where some big companies employ, at least, the same number of the current biggest client of Skypro, TAP. These companies have a great commitment to quality service and the image wear is very important. They are also concerned about providing good footwear to its employees. The airline industry has been having high growth rates. Therefore, we can conclude that it is a very good region to invest/penetrate