Efecto de mutaciones genéticas puntuales en la actividad enzimática de FAD3, una enzima implicada en la producción de ácidos grasos ω3

33 Pags.- Tabls.- Figs. Memoria presentada por Pedro Pastor Andreu, estudiante del grado en Biotecnología de la Universidad de Zaragoza. Elaborada en la Estación Experimental de Aula Dei (EEAD-CSIC). Dirigida por los Drs. Miguel Alfonso y Sara López, investigadores EEAD-CSIC.[ES] Las desaturasas de ácidos grasos son enzimas que introducen un enlace doble o insaturado en la cadena alquílica de un ácido graso. La mayoría de estas enzimas son proteínas de membrana con fuerte carácter hidrofóbico lo que complica su purificación y cristalización por lo que se desconoce su estructura y los residuos que constituyen su centro activo. Se sabe que presentan 3 cajas de histidinas que están muy conservadas entre las distintas desaturasas y entre diferentes especies vegetales y se cree que estas cajas de histidinas podrían participar coordinando átomos de hierro para la reacción de insaturación, en un mecanismo básicamente desconocido. Existen mutantes de la planta modelo Arabidopsis thaliana deficientes en la insaturación de ácidos grasos cuyo estudio permitirá identificar residuos implicados en la función de las ω3 desaturasas. En este trabajo se clonó el gen FAD3 (que codifica para una ω3 desaturasa reticular) de tres líneas vegetales (Arabidopsis thaliana silvestre, mutante fad3 y mutante fad378) en el vector pGEM-T Easy y se llevaron a cabo reacciones de secuenciación detectando una mutación puntual en el aminoácido 103 del mutante fad378 y otra mutación puntual en el aminoácido 292 del mutante fad3. Puesto que estas mutaciones puntuales anulan la actividad desaturasa de FAD3 se puede decir que los aminoácidos de las posiciones citadas son imprescindibles para la actividad enzimática, ya sea porque forman parte de su centro activo o porque están implicados en el correcto plegamiento de la enzima.[EN] Fatty acid desaturases are enzymes that introduce a single bond between two carbon atoms in a double or unsaturated bond in the alkyl chain of the fatty acids. Most of these enzymes are membrane proteins with high hydrophobic character which complicates their purification and crystallization. Accordingly, their structure and the residues of their active site are unknown. It is known that these kind of proteins have three histidine boxes that are highly conserved between different desaturases and between species of plants and it is believed that these histidine boxes could participate in the reaction of unsaturation by binding iron atoms to the protein through a mechanism that is completely unknown. There are Arabidopsis thaliana mutants deficient in fatty acid unsaturation that could be used to identify residues involved in the function of ω3 desaturases. In this project, the FAD3 gene (that encodes a ω3 reticular desaturase) of three plant lines (wild type Arabidopsis thaliana, fad3 mutant and fad378 mutant) was cloned into the plasmid pGEMT-T Easy. Then, the genes were sequenced and two punctual mutations were detected. One was located in the residue 103 of the fad378 mutant and the other was in the residue 292 of the fad3 mutant. Because these punctual mutations inhibit the FAD3 desaturase activity it is possible that the amino acids of described positions are essential for protein function, either because they are part of the active site or are involved in the correct folding of the enzyme.Peer reviewe

EFECTOS CE MUTACIONES GENÉTICAS PUNTUALES EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE FAD3, UNA ENZIMA IMPLICADA EN LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS GRASOS OMEGA 3

Las desaturasas de ácidos grasos son enzimas que introducen un enlace doble o insaturado en la cadena alquílica de un ácido graso. La mayoría de estas enzimas son proteínas de membrana con fuerte carácter hidrofóbico lo que complica su purificación y cristalización por lo que se desconoce su estructura y los residuos que constituyen su centro activo. Se sabe que presentan 3 cajas de histidinas que están muy conservadas entre las distintas desaturasas y entre diferentes especies vegetales y se cree que estas cajas de histidinas podrían participar coordinando átomos de hierro para la reacción de insaturación, en un mecanismo básicamente desconocido. Existen mutantes de la planta modelo Arabidopsis thaliana deficientes en la insaturación de ácidos grasos cuyo estudio permitirá identificar residuos implicados en la función de las ω3 desaturasas. En este trabajo se clonó el gen FAD3 (que codifica para una ω3 desaturasa reticular) de tres líneas vegetales (Arabidopsis thaliana silvestre, mutante fad3 y mutante fad378) en el vector pGEM-T Easy y se llevaron a cabo reacciones de secuenciación detectando una mutación puntual en el aminoácido 103 del mutante fad378 y otra mutación puntual en el aminoácido 292 del mutante fad3. Puesto que estas mutaciones puntuales anulan la actividad desaturasa de FAD3 se puede decir que los aminoácidos de las posiciones citadas son imprescindibles para la actividad enzimática, ya sea porque forman parte de su centro activo o porque están implicados en el correcto plegamiento de la enzima

Photoreceptor Activity Contributes to Contrasting Responses to Shade in Cardamine and Arabidopsis Seedlings

Plants have evolved two major ways to deal with nearby vegetation or shade: avoidance and tolerance. Moreover, some plants respond to shade in different ways; for example, Arabidopsis thaliana undergoes an avoidance response to shade produced by vegetation, but its close relative Cardamine hirsuta tolerates shade. How plants adopt opposite strategies to respond to the same environmental challenge is unknown. Here, using a genetic strategy, we identified the C. hirsuta slender in shade1 (sis1) mutants, which produce strongly elongated hypocotyls in response to shade. These mutants lack the phytochrome A (phyA) photoreceptor. Our findings suggest that C. hirsuta has evolved a highly efficient phyA-dependent pathway that suppresses hypocotyl elongation when challenged by shade from nearby vegetation. This suppression relies, at least in part, on stronger phyA activity in C. hirsuta; this is achieved by increased ChPHYA expression and protein accumulation combined with a stronger specific intrinsic repressor activity. We suggest that modulation of photoreceptor activity is a powerful mechanism in nature to achieve physiological variation (shade tolerance vs. avoidance) for species to colonize different habitats

The polygenic basis of relapse after a first episode of schizophrenia

Little is known about genetic predisposition to relapse. Previous studies have linked cognitive and psychopathological (mainly schizophrenia and bipolar disorder) polygenic risk scores (PRS) with clinical manifestations of the disease. This study aims to explore the potential role of PRS from major mental disorders and cognition on schizophrenia relapse. 114 patients recruited in the 2EPs Project were included (56 patients who had not experienced relapse after 3 years of enrollment and 58 patients who relapsed during the 3-year follow-up). PRS for schizophrenia (PRS-SZ), bipolar disorder (PRS-BD), education attainment (PRS-EA) and cognitive performance (PRS-CP) were used to assess the genetic risk of schizophrenia relapse.Patients with higher PRS-EA, showed both a lower risk (OR=0.29, 95% CI [0.11–0.73]) and a later onset of relapse (30.96± 1.74 vs. 23.12± 1.14 months, p=0.007. Our study provides evidence that the genetic burden of neurocognitive function is a potentially predictors of relapse that could be incorporated into future risk prediction models. Moreover, appropriate treatments for cognitive symptoms appear to be important for improving the long-term clinical outcome of relapse

Mechanistic, temporal and spatial insights of the regulatory network controlling plant responses to vegetation proximity

La llum és essencial per a les plantes, no només com a font d'energia per a la fotosíntesi, sinó també com un senyal d'informació ambiental que els permet adaptar el seu desenvolupament per prosperar en diferents escenaris. En les plantes que eviten l'ombra, com Arabidopsis thaliana, la proximitat de vegetació potencialment competidora desencadena un grup de respostes conegut com a síndrome de fugida de l'ombra (SAS, de les seves sigles en anglès), que inclou l'allargament de l'hipocòtil. Els fitocroms, que són els fotoreceptors que detecten els senyals de proximitat vegetal, interaccionen amb els factors de transcripció PHYTOCHROME INTERACTING FACTORS (PIFs). Aquesta interacció resulta en la integració dels senyals de llum i ajusta el desenvolupament de les plantes a aquests canvis ambientals. La hipòtesi actual estableix que la inactivació induïda per l'ombra del fitocrom B (phyB) allibera la repressió imposada sobre els PIFs, el que resulta en canvis ràpids en l'expressió gènica i la promoció de l'allargament de l'hipocòtil. Els PIFs contenen un motiu d'unió a phyB actiu (APB) i un domini bàsic-hèlix-bucle-hèlix (bHLH), responsable de la unió a l'ADN. Entre els PIFs existents, PIF7 és el més important en la promoció de l'allargament de l'hipocòtil en ombra. Es desconeix si la unió de PIF7 a l'ADN i al phyB modula independentment diferents aspectes del desenvolupament regulat per la llum, com passa amb PIF3, el membre fundador i probablement millor estudiat dels PIFs. Per abordar aquesta qüestió, hem portat a terme anàlisis d'estructura-funció generant derivats de PIF7 amb els dominis bHLH i APB mutats. En el primer capítol d'aquest treball, vam mostrar que les activitats de PIF7, tant d'unió a l'ADN com al phyB, estan vinculades i són fonamentals per induir ràpidament l'expressió de gens diana de PIF7 i el creixement de l'hipocòtil en ombra. Altres components classificats com a reguladors positius i negatius participen en la modulació de la SAS mitjançant la construcció d'una xarxa reguladora complexa. No està clar, però, com s'organitzen aquests components. Per aprofundir en l'arquitectura d'aquesta xarxa de senyalització i en les connexions entre els seus components, en el segon capítol d'aquesta tesi vam realitzar anàlisis fisiològics, cel·lulars i transcriptòmics de l'allargament de l'hipocòtil induït per l'ombra utilitzant mutants deficients en els diferents reguladors. Els nostres resultats demostren que els components reguladors de la SAS s'organitzen en dues branques principals que actuen en moments lleugerament diferents del desenvolupament de la plàntula i modulen l'allargament de diferents cèl·lules al llarg de l'eix de l'hipocòtil. A més, també trobem una convergència dels senyals de les dues branques, ja que els PIFs i ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5), components que pertanyen a aquestes branques separades, regulen l'expressió de gens diana comuns.La luz es esencial para las plantas, no solo como fuente de energía para la fotosíntesis, sino también como una señal de información ambiental que les permite adaptar su desarrollo para prosperar en diferentes escenarios. En las plantas que evitan la sombra, como Arabidopsis thaliana, la proximidad de vegetación potencialmente competidora desencadena un grupo de respuestas conocido como síndrome de huida de la sombra (SAS, de sus siglas en inglés), que incluye el alargamiento del hipocótilo. Los fitocromos, que son los fotorreceptores que detectan las señales de proximidad vegetal, interaccionan con los factores de transcripción PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs (PIFs). Esta interacción resulta en la integración de las señales de luz para ajustar el desarrollo de las plantas a estos cambios ambientales. La hipótesis actual establece que la inactivación inducida por la sombra del fitocromo B (phyB) libera la represión impuesta sobre los PIFs, lo que resulta en cambios rápidos en la expresión génica y la promoción del alargamiento del hipocótilo. Los PIFs contienen un motivo de unión a phyB activo (APB) y un dominio básico-hélice-bucle-hélice (bHLH), responsable de la unión al ADN. Entre los PIFs existentes, PIF7 es el más importante en la promoción del alargamiento del hipocótilo en sombra. Se desconoce si la unión de PIF7 al ADN y al phyB modula independientemente diferentes aspectos del desarrollo regulado por la luz, como ocurre con PIF3, el miembro fundador y probablemente mejor estudiado de los PIFs. Para abordar esta cuestión, llevamos a cabo análisis de estructura-función generando derivados de PIF7 con los dominios bHLH y APB mutados. En el primer capítulo de este trabajo, mostramos que las actividades de PIF7, tanto de unión al ADN como al phyB están vinculadas y son fundamentales para inducir rápidamente la expresión de genes diana de PIF7 y el crecimiento del hipocótilo en sombra. Otros componentes clasificados como reguladores positivos y negativos participan en la modulación de SAS mediante la construcción de una compleja red reguladora. Sin embargo, no está claro cómo se organizan estos componentes. Para profundizar en la arquitectura de esta red de señalización y en las conexiones entre sus componentes, en el segundo capítulo de esta tesis realizamos análisis fisiológicos, celulares y transcriptómicos del alargamiento del hipocótilo inducido por la sombra utilizando mutantes deficientes en los diferentes reguladores. Nuestros resultados demuestran que los componentes reguladores del SAS se organizan en dos ramas principales que actúan en momentos ligeramente diferentes del desarrollo de la plántula y modulan el alargamiento de diferentes células a lo largo del eje del hipocótilo. Además, también encontramos una convergencia de las señales de las dos ramas, ya que los PIFs y ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5), componentes que pertenecen a estas ramas separadas, regulan la expresión de genes diana comunes.Light is essential for plants, not only for fueling photosynthesis, but also as environmental information that allows them to adapt their development to thrive in different scenarios. In shade-avoider (sun-loving) plants, such as Arabidopsis thaliana, proximity of potentially competing vegetation triggers a group of responses known as Shade Avoidance Syndrome (SAS), including the well-studied hypocotyl elongation. Phytochromes are the photoreceptors that detect vegetation proximity signals that, by binding to PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs (PIFs), integrate light signals into acclimation changes in plant development. The current regulatory model states that the shade-induced inactivation of phytochrome B (phyB) releases the repression imposed over PIFs, which results in the rapid activation of gene expression changes and in hypocotyl elongation promotion. PIFs contain an active phyB-binding (APB) motif and a basic helix-loop-helix (bHLH) domain, responsible of DNA-binding. Among PIFs, the photostable PIF7 has a major role in promoting hypocotyl elongation in shade. However, it is unknown if PIF7 DNA- and phyB-binding activities can modulate independently different aspects of the light-regulated development, as it occurs in the well-studied and founder member PIF3. To address this question, we carried out a structure-function analysis by generating PIF7 derivatives with the bHLH and the APB domains mutated. In the first chapter of this work we show that both the PIF7 DNA- and phyB-binding activities are linked and fundamental to rapidly induce the expression of PIF7 targets and the hypocotyl growth in shade. Other components classified as positive and negative regulators participate in the modulation of SAS by building a complex regulatory network. Nevertheless, it is still unclear how these components are organized. To refine the architecture of this signaling network and establish the connections between its components, in the second chapter of this thesis we carried out physiological, cell biology and transcriptomic analyses of the shade-induced hypocotyl elongation using defective mutants of the different regulators. Our results demonstrate that the SAS regulatory components are organized in two main branches that act in slightly different moments and modulate the elongation of different cells along the hypocotyl axis. Nevertheless, we also found a signaling convergence between the two branches, as PIFs and ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5), components that belong to these separate branches, regulate the expression of common target genes

Filling the gaps to understand plant responses to vegetation proximity: genetic, spatial and temporal regulation

Trabajo presentado a la XXIII Reunión Bianual de la Sociedad Española de Fisiología Vegetal y al XVI Congreso Hispano-Luso de Fisiología Vegetal, celebrados en Pamplona del 26 al 28 de junio de 2019