Occupancy maps of 208 chromatin-associated proteins in one human cell type

Transcription factors are DNA-binding proteins that have key roles in gene regulation. Genome-wide occupancy maps of transcriptional regulators are important for understanding gene regulation and its effects on diverse biological processes. However, only a minority of the more than 1,600 transcription factors encoded in the human genome has been assayed. Here we present, as part of the ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) project, data and analyses from chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing (ChIP–seq) experiments using the human HepG2 cell line for 208 chromatin-associated proteins (CAPs). These comprise 171 transcription factors and 37 transcriptional cofactors and chromatin regulator proteins, and represent nearly one-quarter of CAPs expressed in HepG2 cells. The binding profiles of these CAPs form major groups associated predominantly with promoters or enhancers, or with both. We confirm and expand the current catalogue of DNA sequence motifs for transcription factors, and describe motifs that correspond to other transcription factors that are co-enriched with the primary ChIP target. For example, FOX family motifs are enriched in ChIP–seq peaks of 37 other CAPs. We show that motif content and occupancy patterns can distinguish between promoters and enhancers. This catalogue reveals high-occupancy target regions at which many CAPs associate, although each contains motifs for only a minority of the numerous associated transcription factors. These analyses provide a more complete overview of the gene regulatory networks that define this cell type, and demonstrate the usefulness of the large-scale production efforts of the ENCODE Consortium

B cell and plasma cell homing to inflamed kidneys in murine SLE

Die Nephritis ist eine häufige und schwerwiegende Komplikation des systemischen Lupus erythematodes. Im Vordergrund steht dabei die Ablagerung von Immunkomplexen in den Glomeruli. Weniger ist bekannt über das Vorkommen von immunkompetenten Zellen in den Nieren und mögliche Auswirkungen dieser auf die Entzündung. In der vorliegenden Arbeit werden Untersuchungen an Mäusen des Stammes NZB/W vorgestellt. Dieser Stamm ist als Modell für eine systemische Autoimmunerkrankung anerkannt. Die Erkrankung ist dem systemischen Lupus erythematodes sehr ähnlich. Im Rahmen dieser, durch Autoantikörper vermittelten Erkrankung kommt es u.a. zur Bildung von langlebigen autoreaktiven Plasmazellen die durch eine zytotoxische Therapie mit Cyclophosphamid nicht eliminiert werden können. Diese erklären das Vorkommen von therapierefraktären Autoantikörpertitern wie z.B. anti-dsDNA-Antikörpern. Frühere Studien an Mäusen des Stammes NZB/W haben gezeigt, dass es zu einer Einwanderung von B- und T-Lymphozyten und von Plasmazellen in die entzündeten Nieren kommt. Unklar blieb dabei wie sich diese Zellen anordnen und wodurch die Einwanderung gesteuert wird. Mit Hilfe der Immunhistologie konnte nun nachgewiesen werden, dass sich B- und T-Lymphozyten innerhalb von deutlich begrenzten Infiltrationsfeldern ansammeln. Interessanterweise wird in enger Kolokalisation dieser Infiltrationsfelder das Chemokin CXCL13, der Ligand von CXCR5, exprimiert. Dieses Chemokin-Chemokinrezeptor-Paar ist in der Milz für die Bildung von Follikeln mit einer typischen Einteilung in B- und T-Zellzonen verantwortlich. Nähere Untersuchungen der B-Lymphozyten zeigen, dass es sich hauptsächlich um naive (B2)B-Zellen und nicht wie vielleicht vermutet um Gedächtnis-B-Zellen handelt. Im Gegensatz dazu finden sich Plasmazellen über weite Bereiche des Nierengewebes verteilt. Sie bilden keine zusammenhängenden Zellverbände. Durchflusszytometrische Untersuchungen der Plasmazellen in den entzündeten Nieren zeigen eine starke Expression von CXCR3 auf der Zelloberfläche. CXCR3 ist der Rezeptor des proinflammatorischen Chemokins CXCL10, das in den entzündeten Nieren von NZB/W-Mäusen nachgewiesen werden kann. Insgesamt legen die Ergebnisse nahe, dass B-Lymphozyten und Plasmazellen weitestgehend unabhängig voneinander in die entzündeten Nieren einwandern und dass diese Prozesse durch zwei unterschiedliche Chemokin-Chemokinrezeptor- Paare gesteuert werden.Glomerulonephritis is a common complication of systemic lupus erythematosus with a frequency of 40-50% in all lupus patients. It has impact on therapy and prognosis. NZB/W mice spontaneously develop a lupus like disease leading to lethal immune complex mediated nephritis. Disease manifestation is accompanied by lymphocyte homing into the kidneys. The results of this study show that kidney infiltrating B cells accumulate in small follicle-like structures while IgG-containing plasma cells are scattered within the whole organ. The chemokine receptor CXCR3 mediates migration towards the inflammatory chemokine CXCL10, abundantly expressed in inflamed NZB/W tissue. CXCR3+ plasma cell precursors (plasmablasts) selectively accumulate in the kidneys, while CXCR3 bearing B cell frequencies are not increased within these tissues compared to bone marrow and spleen. Like in spleens, CXCL13 expression in the inflamed kidneys is exclusively detected in the B cell areas. In accordance with the tissue distribution of B cells and plasma cells, the chemokine receptor CXCR5 that mediates migration towards CXCL13 gradients is expressed by kidney infiltrating B cells but absent on plasmablasts. Interestingly, the kidney infiltrating B cell population contains 50% IgD/IgM+ naïve cells whereas memory B cells could not be detectet in higher frequencies compared to other organs. These data suggest that B cells and plasma cells accumulate within the kidney by different homing mechanisms involving CXCR5/CXCL13 and CXCR3/CXCL10, respectively

Mécanisme de régulation de l'acétyltransférase p300/CBP

Le p300/CBP acétyltransférase est un co-activateur transcriptionnel très important qui est impliqué dans la régulation d'un grand nombre de processus biologiques, comme la transcription d'ADN, le développement et l'immunité innée. Jusqu'à présent, le rôle de p300/CBP dans la régulation de l'expression des gènes a été largement étudiée, mais les mécanismes qui régulent son activité enzymatique sont encore peu connus. Des études ont montré que le dysfonctionnement de p300/CBP est associé à plusieurs formes de cancer et de maladies neurodégénératives. Dés lors, chaque progrès concernant les mécanismes de régulation de p300/CBP est devenu primordial pour le développement de nouvelles thérapies. Le 'noyau' de p300/CBP contient deux domaines pour la reconnaissance des modifications post-traductionnelles (MPTs), un bromodomaine et un PHD finger (le module BP), adjacent à un domaine HAT (ou domaine histone acétyltransférase). Plusieurs enzymes, modifiant la chromatine, contiennent des domaines de reconnaissance des MPTs. Fréquemment des groupements particuliers de ces domaines sont très conservés et liés, au sein de la même protéine ou du même complexe protéique, suggérant qu'ils réalisent des fonctions coordonnées. Ces domaines adjacents peuvent agir en concertation dans la reconnaissance simultanée de différents MPTs ou peuvent exercer des fonctions différentes de celles qui sont effectuées par ces deux domaines particuliers, tels que les fonctions de régulation enzymatique. Plusieurs études suggèrent que les cycles acétylation/désacétylation dans la boucle d'auto-inhibition, à l'intérieur du domaine HAT, jouent un rôle important dans la régulation de l'activité enzymatique de p300/CBP. La proximité du module BP et du domaine HAT suggère que la spécificité de liaison, appartenant au module BP, peut être intrinsèquement liée à la régulation de l'activité du domaine HAT. L'objectif de ma thèse est de déterminer le rôle du module BP dans la régulation de l'activité du domaine HAT. Je propose que le module BP soit impliqué dans la régulation de p300/CBP de deux façons. La première consiste à établir un lien avec le domaine HAT qui stabilise la conformation auto-inhibée de l'enzyme. La deuxième exige que le module BP joue un rôle dans le choix des substrats de p300/CBP. J'ai été en mesure de montrer que BP peut se lier au domaine HAT et à la chromatine modifiée et qu'il peut reconnaître les modifications effectuées par p300/CBP lui-même. Les données obtenues indiquent que le module BP peut être impliqué dans la régulation de l'activité de p300/CBP et dans son ciblage à la chromatine.The p300/CBP acetyltransferase is an important transcriptional co-activator which is involved in regulating a wide range of biological processes, such as DNA transcription, development and innate immunity. To date, the role of p300/CBP in gene regulation has been extensively described but little is known about the mechanisms which regulate its activity. Since misregulation of p300/CBP has been associated to the development of several forms of cancers and neurodegenerative diseases, studies directed to decipher the mechanisms of regulation of p300/CBP are of great importance for the development of new therapies. The p300/CBP 'core' contains two post-translational modifications (PTMs) recognition motifs, a bromodomain and a PHD domain (the bromo-PHD module, BP), in close proximity to a histone acetyltransferase domain (HAT). Many chromatin modifying enzymes contain recognition modules for PTMs. Frequently particular groupings of such modules are conserved and linked within the same protein or the same multisubunit complex, suggesting that they perform concerted functions. These linked modules may act combinatorially to allow recognition of multiple PTMs or display new functions that are not possessed by the single modules, such as regulatory properties. Accumulating evidence suggests that acetylation/deacetylation in a conserved autoinhibitory loop of the p300/CBP HAT domain plays an important role in regulation of HAT activity. The close apposition of the BP module and the HAT domain suggests that BP substrate recognition is intrinsically linked to regulation of HAT activity. During my thesis work, I have investigated the role of BP in HAT regulation. I propose that the BP module is involved in p300/CBP regulation by binding to the HAT domain and stabilizing the autoinhibited conformation of the enzyme. I have also investigated substrate specificity of the BP module towards modified chromatin. I could show that the BP module binds histone modifications including those that are p300/CBP dependent. Altogether, the data suggests that the BP module is involved in regulating p300/CBP HAT activity and in targeting of chromatin.SAVOIE-SCD - Bib.électronique (730659901) / SudocGRENOBLE1/INP-Bib.électronique (384210012) / SudocGRENOBLE2/3-Bib.électronique (384219901) / SudocSudocFranceF

Etudes structurales sur l'assemblage du nucléosome

Au sein du noyau, l'ADN est organise en chromatine dont l'unité de base est le nucléosome. La structure de la chromatine est très dynamique, ce qui est nécessaire pour la plupart des opérations qui se produisent dans l'ADN telles que la réplication, la transcription, la réparation et la recombinaison. Le nucléosome est constitué de deux dimères H2A/H2B et deux dimères H3/H4 associés avec 147 paires de bases d'ADN. La protéine Nap1 est un chaperon d'histone H2A/H2B impliquée dans l'assemblage et démontage des nucléosomes. Nap1 protège les interactions non spécifiques entre l'ADN chargé négativement et les dimères H2A/H2B chargés positivement, afin de permettre la formation de la structure ordonnée des nucléosomes. Lors de l'assemblage des nucléosomes, les dimères d'histones H3/H4 sont déposés en premier lieu, suivi par le dépôt de dimères H2A/H2B. Lors du démontage du nucléosome, les dimères H2A/H2B sont retirés avant le retrait des dimères H3/H4. La determination de la structure du complexe Nap1-H2A/H2B pourra permettre une meilleure compréhension du processus d'assemblage du nucléosome. Dans cette étude, nous voulons comprendre comment le chaperon Nap1 cible spécifiquement les dimères d'histones H2A/H2B pour l'assemblage des nucléosomes. Notre objectif est de caractériser la structure et la fonction du complexe de Nap1-H2A/H2B. Ainsi nous nous sommes tout d'abord intéresse à la stoechiometrie de ce complexe. Nous avons trouvé qu'un dimère de Nap1 s'associe à un dimère H2A/H2B (Nap1_2-H2A/H2B). D'autre part, l'analyse par spectrométrie de masse non-dénaturante a montré que ce complexe de base peut s'oligomériser et contenir jusqu'à 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. L'analyse de ce complexe par spectrométrie de masse non-dénaturant a montré que ce complexe peu oligomériser dans un grand complexe contenant jusqu'à 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. Nous avons également obtenu la première structure cristalline à basse résolution de ce complexe. L'analyse du même complexe par microscopie électronique à coloration négative a révélé la présence en solution du même oligomère que dans l'unité asymétrique du cristal, qui contient aussi 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence de nouvelles interfaces d'interaction entre les différents composants de ce complexe qui nous permettent de mieux comprendre le processus d'assemblage des nucléosomes. Le remodelage de la chromatine permet l'expression des gènes eucaryotes. Ce remodelage nécessite des enzymes telles que des histone acétyltransférases (HAT) et les chaperons d'histones. Les HATs acétylent les chaînes latérales des lysines. Il a été proposé que les HATs et les histones chaperons agissent en synergie pour moduler la structure de la chromatine pendant la transcription. La HAT p300 a été proposé d'interagir avec l'histone chaperon Nap1. Nous avons entrepris de caractériser cette interaction. Malheureusement, nos expériences n'ont pas pu détecter d'interaction directe entre ces protéines.Assembly of chromatin is an essential process that concerns most DNA transactions in eukaryotic cells. The basic repeating unit of chromatin are nucleosomes, macromolecular complexes that consist of a histone octamer that organizes 147 bp of DNA in two superhelical turns. Although, the structures of nucleosomes are known in detail, their assembly is poorly understood. In vivo, nucleosome assembly is orchestrated by ATP-dependent remodelling enzymes, histone-modifying enzymes and a number of at least partially redundant histone chaperones. Histone chaperons are a structurally diverse class of proteins that direct the productive assembly and disassembly of nucleosomes by facilitating histone deposition and exchange. The currently accepted model is that nucleosome assembly is a sequential process that begins with the interaction of H3/H4 with DNA to form a (H3/H4)2 tetramer-DNA complex. The addition of two H2A/H2B dimers completes a canonical nucleosome. High-resolution structures of histone chaperons in complex with H3/H4 histones have resulted in detailed insights into the process of nucleosome assembly. However, our understanding of the mechanism of nucleosome assembly has been hampered by the as yet limited number of co-crystal structures of histone chaperone complexes. In particular it remains unclear how histone chaperons mediate H2A/H2B deposition to complete nucleosome assembly. In this work, we have investigated the role of the H2A/H2B chaperon Nap1 (Nucleosome assembly protein 1) in nucleosome assembly. We have determined the crystal structure of the complex between Nap1 and H2A/H2B and analysed the assembly by various biophysical methods. The structure shows that a Nap1 dimer binds to one copy of H2A/H2B (Nap1_2-H2A/H2B). A large ~550 kDa macromolecular assembly containing 6 copies of the Nap12-H2A/H2B complex is seen in the asymmetric crystallographic unit. We confirmed by both non-denaturing mass spectroscopy and negative stain electron microscopy studies that this assembly is the predominant form of the Nap1_2-H2A/H2B complex in solution. We further investigated the potential interplay between p300-mediated histone acetylation and nucleosome assembly. Together, the structure and associated functional analysis provide a detailed mechanism for the Nap1 chaperon activity, its role in H2A/H2B deposition and in nucleosome assembly.SAVOIE-SCD - Bib.électronique (730659901) / SudocGRENOBLE1/INP-Bib.électronique (384210012) / SudocGRENOBLE2/3-Bib.électronique (384219901) / SudocSudocFranceF

Online Learners And Technology: A Gap In Higher Education And Student Affairs Professional Preparation

Online learning, an essential component of the higher education landscape on a global scale, has become a lucrative operation for colleges and universities. Enrollment in online programs continues to outpace enrollment in higher education overall, particularly in the North American market. Even so, there is little evidence that graduates of North American higher education and student affairs preparation programs enter the workforce with the knowledge, skills, and competencies required to support undergraduate and graduate online learners. A mixed-method national survey of programs in the United States was conducted to develop a picture of the ways higher education and student affairs graduate preparation programs currently prepare future professionals to address the needs of online learners. Results indicate that preparation of higher education and student affairs professionals for the delivery of services to online students is not yet seen as an integral component of these graduate programs

The McrBC restriction endonuclease assembles into a ring structure in the presence of G nucleotides

McrBC from Escherichia coli K-12 is a restriction enzyme that belongs to the family of AAA(+) proteins and cuts DNA containing modified cytosines. Two proteins are expressed from the mcrB gene: a full-length version, McrB(L), and a short version, McrB(S). McrB(L) binds specifically to the methylated recognition site and is, therefore, the DNA-binding moiety of the McrBC endonuclease. McrB(S) is devoid of DNA-binding activity. We observed that the quaternary structure of the endonuclease depends on binding of the cofactors. In gel filtration experiments, McrB(L) and McrB(S) form high molecular weight oligomers in the presence of Mg(2+) and GTP, GDP or GTP-γ-S. Oligomerization did not require the presence of DNA and was independent of GTP hydrolysis. Electron micrographs of negatively stained McrB(L) and McrB(S) revealed ring-shaped particles with a central channel. Mass analysis by scanning transmission electron microscopy indicates that McrB(L) and McrB(S) form single heptameric rings as well as tetradecamers. In the presence of McrC, a subunit that is essential for DNA cleavage, the tetradecameric species was the major form of the endonuclease

The structure of the cohesin ATPase elucidates the mechanism of SMC–kleisin ring opening

Genome regulation requires control of chromosome organization by SMC–kleisin complexes. The cohesin complex contains the Smc1 and Smc3 subunits that associate with the kleisin Scc1 to form a ring-shaped complex that can topologically engage chromatin to regulate chromatin structure. Release from chromatin involves opening of the ring at the Smc3–Scc1 interface in a reaction that is controlled by acetylation and engagement of the Smc ATPase head domains. To understand the underlying molecular mechanisms, we have determined the 3.2-Å resolution cryo-electron microscopy structure of the ATPγS-bound, heterotrimeric cohesin ATPase head module and the 2.1-Å resolution crystal structure of a nucleotide-free Smc1–Scc1 subcomplex from Saccharomyces cerevisiae and Chaetomium thermophilium. We found that ATP-binding and Smc1–Smc3 heterodimerization promote conformational changes within the ATPase that are transmitted to the Smc coiled-coil domains. Remodeling of the coiled-coil domain of Smc3 abrogates the binding surface for Scc1, thus leading to ring opening at the Smc3–Scc1 interface