Papel de los receptores de carga en la organización funcional de la ruta secretora temprana

Introducción La organización estructural y funcional de la célula eucariota depende, en gran medida, de la actividad de la ruta secretora. Los procesos selectivos de transporte vesicular que operan a lo largo de esta ruta, aseguran la llegada de las distintas proteínas y lípidos a sus destinos funcionales adecuados. De esta forma, se mantiene la compartimentación necesaria para que los diferentes procesos bioquímicos que tienen lugar en cada orgánulo se lleven a cabo eficientemente. El tráfico vesicular en la ruta secretora está mediado por una serie de complejos proteicos citosólicos de cubierta, que se encargan de generar las vesículas de transporte mediante la deformación mecánica de la membrana del orgánulo donador, seleccionar de manera simultánea las moléculas carga que se han de incorporar en las vesículas, y finalmente, dirigir las vesículas hacia su destino intracelular interaccionando con los factores de anclaje, que actúan previamente al evento de fusión con el orgánulo aceptor. Dos tipos de cubierta operan en la ruta secretora temprana: COPII media la exportación de proteínas de secreción del retículo endoplásmico (RE), mientras que COPI (o coatómero) está implicada en el transporte retrógrado desde el aparato de Golgi al RE y entre las cisternas del Golgi. Las proteínas de secreción que no son capaces de interaccionar con la cubierta COPII necesitan la intervención de los denominados receptores de carga. Estos receptores son proteínas muy abundantes y conservadas evolutivamente, que conectan a la carga con la cubierta para que su exportación del RE ocurra eficientemente. En esta tesis se ha pretendido profundizar a nivel molecular en la comprensión del tráfico vesicular en la ruta secretora temprana mediante el estudio de los receptores de carga y su participación en otras funciones además de las previamente descritas, utilizando como modelo la levadura Saccharomyces cerevisiae. El estudio comenzó a partir del análisis del complejo p24, un receptor de carga que forma un complejo heteromérico que cicla constantemente entre el RE y el Golgi. Publicaciones previas de nuestro grupo han permitido describir su función como receptor de carga de las proteínas ancladas a GPI y como estabilizador del coatómero sobre el Golgi, ayudando en la formación de vesículas COPI. Antecedentes y objetivos Para profundizar en el conocimiento de las funciones celulares del complejo p24, se realizó un ensayo de pulldown de una de las subunidades del complejo etiquetada con TAP (Emp24-TAP). Sorprendentemente, se encontraron entre las proteínas que interaccionaban con Emp24-TAP otros receptores de carga, y los componentes del complejo Dsl1, el factor responsable del anclaje de las vesículas COPI al RE. Para analizar la importancia de estas interacciones, se estudió en primer lugar la relación del complejo p24 con los demás receptores de carga. De esta forma se observó que los receptores constituyen una plataforma de alto peso molecular a nivel de los sitios de salida del retículo, y que esta debe tener un significado funcional, ya que existe una fuerte interacción genética entre los distintos receptores. Los receptores que mayor interacción genética mostraron fueron p24 y Erv14p, por lo que se comenzó un estudio del doble mutante emp24Δerv14Δ. Los primeros resultados preliminares evidenciaron que en este doble mutante el cis-Golgi parecía desorganizado. Con estos antecedentes, los objetivos planteados en esta tesis han sido: 1. Analizar el posible papel cooperativo entre los receptores de carga en la organización funcional del cis-Golgi. 2. Analizar el posible papel del complejo p24 en el anclaje de las vesículas COPI al retículo endoplásmico. Resultados 1. Papel cooperativo de los receptores de carga en la organización funcional del cis-Golgi. Los receptores de carga del RE son componentes muy abundantes de la ruta secretora temprana que ciclan continuamente entre el RE y el Golgi en vesículas anterógradas COPII y retrógradas COPI. La función individual de estos receptores es conectar a sus respectivas proteínas de secreción específicas con la cubierta COPII para promover su incorporación eficiente en las vesículas que las llevarán desde el RE hasta el Golgi. Nuestros datos proteómicos y genéticos sugieren que además de esta función individual, los receptores desarrollarían una función colectiva necesaria para el ensamblaje del cis-Golgi. En el primer capítulo de esta tesis, se muestra cómo los receptores en su conjunto son necesarios para la homeostasis del cis-Golgi, ya que su ausencia combinada promueve la desorganización de este compartimento, hecho que no parece ser debido a un bloqueo general de la salida del RE. Este fenotipo es característico de los mutantes en los factores de anclaje de las vesículas COPII en el cis-Golgi. Es más, el alelo supresor de mutantes de anclaje SLY1-20, suprime el fenotipo de crecimiento y de cis-Golgi desorganizado del doble mutante emp24Δerv14Δ. Los resultados indican que los receptores interaccionan con el factor de anclaje Uso1p una vez han abandonado el RE. Uso1p se encuentra menos asociado a las membranas del Golgi y de las vesículas en el doble mutante emp24Δerv14Δ, sugiriendo que los receptores de carga favorecen el proceso de anclaje vesicular mediante el reclutamiento o estabilización de los factores de anclaje a las vesículas COPII. Agrupando todas las evidencias obtenidas, proponemos un modelo en el que los receptores de carga reclutarían o estabilizarían conjuntamente al factor de anclaje Uso1p a las vesículas recién evaginadas del RE, de forma que las mantendrían unidas entre sí favoreciendo la fusión posterior para formar un nuevo cis-Golgi o fusionar con el cis-Golgi pre-existente. 2. Papel de los receptores de carga en el anclaje de vesículas COPI al retículo endoplásmico Para devolver al RE aquellas proteínas que han escapado, y reciclar los factores de transporte requeridos para futuras rondas de tráfico anterógrado, entre el Golgi y el RE existe un transporte retrógrado mediado por vesículas COPI. Al aproximarse al RE, estas vesículas son capturadas por el complejo de anclaje Dsl1 mediante la interacción entre su subunidad Dsl1p y la cubierta COPI. De esta manera, Dsl1 facilita la interacción de la vesícula con el RE para su posterior fusión. Cuando Dsl1p contacta con el coatómero, promueve a su vez su despolimerización y la vesícula comienza a desnudarse. De esta forma, en ese momento la vesícula quedaría sin sujeción a la membrana del RE, con lo que podría escapar de las inmediaciones de este orgánulo, con la consecuente pérdida de eficiencia en la fusión. En el segundo capítulo de esta tesis se han obtenido resultados que permiten proponer que los receptores de carga tendrían un papel en que la vesícula quede cerca del RE hasta que ocurra la fusión. Los resultados obtenidos indican que los receptores de carga p24 y Erv14p interaccionan físicamente in vivo con el complejo de anclaje vesicular Dsl1. Además, al menos en el caso del complejo p24, esta interacción es directa in vitro. Los estudios de interacción genética han mostrado que esa interacción física tiene un significado funcional en la célula, hecho que también se ha deducido por tener el doble mutante emp24Δtip20-8 más defectos que los mutantes simples en el anclaje de las vesículas COPI al RE. Dicha interacción funcional parece basarse en una colaboración entre los receptores de carga que viajan en las vesículas COPI y Dsl1, como indica el hecho de que en un mutante del coatómero la interacción física entre los receptores y el complejo Dsl1 disminuya, o que sólo sea capaz de recuperar el crecimiento del doble mutante erv14Δtip20-8 la versión silvestre del receptor, y no una que es incapaz de abandonar el RE. Por último, los receptores de carga parecen actuar conjuntamente en el transporte retrógrado, ya que la expresión de ERV14 silvestre es capaz de suprimir los defectos de crecimiento dobles mutantes de alelos termosensibles de los miembros de Dsl1 y emp24Δ. Con los datos obtenidos proponemos el siguiente modelo: los receptores de carga presentes en la vesícula COPI contactan con el complejo Dsl1 tras la despolimerización de la cubierta, manteniendo así a la vesícula en las cercanías del RE y evitando que esta se aleje, aumentando de esta forma la eficiencia del proceso de anclaje llevado a cabo por el complejo Dsl1. Conclusiones Los resultados obtenidos en este trabajo permiten concluir que: 1- Los receptores de carga presentan un papel cooperativo necesario para la biogénesis del cis-Golgi, mediante el reclutamiento de los factores de anclaje vesicular. 2- Los receptores de carga aumentan la eficiencia del anclaje de las vesículas COPI al retículo endoplásmico mediante su interacción con el complejo Dsl1

Dual Independent Roles of the p24 Complex in Selectivity of Secretory Cargo Export from the Endoplasmic Reticulum

The cellular mechanisms that ensure the selectivity and fidelity of secretory cargo protein transport from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi are still not well understood. The p24 protein complex acts as a specific cargo receptor for GPI-anchored proteins by facilitating their ER exit through a specialized export pathway in yeast. In parallel, the p24 complex can also exit the ER using the general pathway that exports the rest of secretory proteins with their respective cargo receptors. Here, we show biochemically that the p24 complex associates at the ER with other cargo receptors in a COPII-dependent manner, forming high-molecular weight multireceptor complexes. Furthermore, live cell imaging analysis reveals that the p24 complex is required to retain in the ER secretory cargos when their specific receptors are absent. This requirement does not involve neither the unfolded protein response nor the retrograde transport from the Golgi. Our results suggest that, in addition to its role as a cargo receptor in the specialized GPI-anchored protein pathway, the p24 complex also plays an independent role in secretory cargo selectivity during its exit through the general ER export pathway, preventing the non-selective bulk flow of native secretory cargos. This mechanism would ensure receptor-regulated cargo transport, providing an additional layer of regulation of secretory cargo selectivity during ER export.Ministerio de Economía y Competitividad BFU2017-89700-P, BFU2016-78265-

Ceramide chain length–dependent protein sorting into selective endoplasmic reticulum exit sites

Protein sorting in the secretory pathway is crucial to maintain cellular compartmentalization and homeostasis. In addition to coat-mediated sorting, the role of lipids in driving protein sorting during secretory transport is a longstanding fundamental question that still remains unanswered. Here, we conduct 3D simultaneous multicolor high-resolution live imaging to demonstrate in vivo that newly synthesized glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins having a very long chain ceramide lipid moiety are clustered and sorted into specialized endoplasmic reticulum exit sites that are distinct from those used by transmembrane proteins. Furthermore, we show that the chain length of ceramide in the endoplasmic reticulum membrane is critical for this sorting selectivity. Our study provides the first direct in vivo evidence for lipid chain length–based protein cargo sorting into selective export sites of the secretory pathway.Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO; grant number BFU2017-89700-P)University of Seville (VIPPIT-2020-I.5)Japan Society for the Promotion of Science (JP25221103, JP17H06420, and JP18H05275)Swiss National Science Foundation (grant no. 163966)Swiss National Supercomputing Centre (CSCS) under project IDs s726 and s84

COPII coat composition is actively regulated by luminal cargo maturation

Background Export from the ER is an essential process driven by the COPII coat, which forms vesicles at ER exit sites (ERESs) to transport mature secretory proteins to the Golgi. Although the basic mechanism of COPII assembly is known, how COPII machinery is regulated to meet varying cellular secretory demands is unclear. Results Here, we report a specialized COPII system that is actively recruited by luminal cargo maturation. Glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins (GPI-APs) are luminal secretory proteins anchored to the membrane by the glycolipid GPI. After protein attachment in the ER lumen, lipid and glycan parts of the GPI anchor are remodeled. In yeast, GPI-lipid remodeling concentrates GPI-APs into specific ERESs. We found that GPI-glycan remodeling induces subsequent recruitment of the specialized ER export machinery that enables vesicle formation from these specific ERESs. First, the transmembrane cargo receptor p24 complex binds GPI-APs as a lectin by recognizing the remodeled GPI-glycan. Binding of remodeled cargo induces the p24 complex to recruit the COPII subtype Lst1p, specifically required for GPI-AP ER export. Conclusions Our results show that COPII coat recruitment by cargo receptors is not constitutive but instead is actively regulated by binding of mature ligands. Therefore, we reveal a novel functional link between luminal cargo maturation and COPII vesicle budding, providing a mechanism to adjust specialized COPII vesicle production to the amount and quality of their luminal cargos that are ready for ER exit. This helps to understand how the ER export machinery adapts to different needs for luminal cargo secretion.This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Science and Innovation BFU2008-04119 (to M.M.), BFU2011-24513 (to M.M.), BFU2009-07290 (to V.G.), and BFU2010-21339 (to R.E.W.); Junta de Andalucia P09-CVI-4503 (to M.M.) and P11-CTS-7962 (to R.E.W.); Swiss National Science Foundation and the NCCR Chemical Biology (to H.R.); the Max-Planck Society (to P.H.S.); the RIKEN-Max-Planck Joint Center for Chemical Biology (to D.V.S.); by JSPS KAKENHI grant number 21580094 (to K.F.); University of Seville fellowships (to A.A.-R., J.M.-L., and A.M.P.-L.); and Ramon y Cajal program (to V.G.). We are grateful to Servicios de Biología y Microscopía (CITIUS, Universidad de Sevilla)

Crosslinking assay to study a specific cargo-coat interaction through a transmembrane receptor in the secretory pathway

Intracellular trafficking through the secretory organelles depends on transient interactions between cargo proteins and transport machinery. Cytosolic coat protein complexes capture specific luminal cargo proteins for incorporation into transport vesicles by interacting with them indirectly through a transmembrane adaptor or cargo receptor. Due to their transient nature, it is difficult to study these specific ternary protein interactions just using conventional native co-immunoprecipitation. To overcome this technical challenge, we have applied a crosslinking assay to stabilize the transient and/or weak protein interactions. Here, we describe a protocol of protein crosslinking and co-immunoprecipitation, which was employed to prove the indirect interaction in the endoplasmic reticulum of a luminal secretory protein with a selective subunit of the cytosolic COPII coat through a specific transmembrane cargo receptor. This method can be extended to address other transient ternary interactions between cytosolic proteins and luminal or extracellular proteins through a transmembrane receptor within the endomembrane system

Reducing the environmental impact of surgery on a global scale: systematic review and co-prioritization with healthcare workers in 132 countries

Abstract Background Healthcare cannot achieve net-zero carbon without addressing operating theatres. The aim of this study was to prioritize feasible interventions to reduce the environmental impact of operating theatres. Methods This study adopted a four-phase Delphi consensus co-prioritization methodology. In phase 1, a systematic review of published interventions and global consultation of perioperative healthcare professionals were used to longlist interventions. In phase 2, iterative thematic analysis consolidated comparable interventions into a shortlist. In phase 3, the shortlist was co-prioritized based on patient and clinician views on acceptability, feasibility, and safety. In phase 4, ranked lists of interventions were presented by their relevance to high-income countries and low–middle-income countries. Results In phase 1, 43 interventions were identified, which had low uptake in practice according to 3042 professionals globally. In phase 2, a shortlist of 15 intervention domains was generated. In phase 3, interventions were deemed acceptable for more than 90 per cent of patients except for reducing general anaesthesia (84 per cent) and re-sterilization of ‘single-use’ consumables (86 per cent). In phase 4, the top three shortlisted interventions for high-income countries were: introducing recycling; reducing use of anaesthetic gases; and appropriate clinical waste processing. In phase 4, the top three shortlisted interventions for low–middle-income countries were: introducing reusable surgical devices; reducing use of consumables; and reducing the use of general anaesthesia. Conclusion This is a step toward environmentally sustainable operating environments with actionable interventions applicable to both high– and low–middle–income countries

Assay for dual cargo sorting into endoplasmic reticulum exit sites imaged by 3D Super-resolution Confocal Live Imaging Microscopy (SCLIM)

Understanding how in eukaryotic cells thousands of proteins are sorted from each other through the secretory pathway and delivered to their correct destinations is a central issue of cell biology. We have further investigated in yeast how two distinct types of cargo proteins are sorted into different endoplasmic reticulum (ER) exit sites (ERES) for their differential ER export to the Golgi apparatus. We used an optimized protocol that combines a live cell dual-cargo ER export system with a 3D simultaneous multi-color high-resolution live cell microscopy called Super-resolution Confocal Live Imaging Microscopy (SCLIM). Here, we describe this protocol, which is based on the reversible ER retention of two de novo co-expressed cargos by blocking COPII function upon incubation of the thermo-sensitive COPII allele sec31-1 at restrictive temperature (37°C). ER export is restored by shifting down to permissive temperature (24°C) and progressive incorporation of the two different types of cargos into the fluorescently labelled ERES can be then simultaneously captured at 3D high spatial resolution by SCLIM microscopy. By using this protocol, we have shown that newly synthesized glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins having a very long chain ceramide lipid moiety are clustered and sorted into specialized ERES that are distinct from those used by transmembrane secretory proteins. Furthermore, we showed that the chain length of the ceramide present in the ER membrane is critical for this sorting selectivity. Therefore, thanks to the presented method we could obtain the first direct in vivo evidence for lipid chain length-based protein cargo sorting into selective ERES

The p24 Complex Contributes to Specify Arf1 for COPI Coat Selection

Golgi trafficking depends on the small GTPase Arf1 which, upon activation, drives the assembly of different coats onto budding vesicles. Two related types of guanine nucleotide exchange factors (GEFs) activate Arf1 at different Golgi sites. In yeast, Gea1 in the cis-Golgi and Gea2 in the medial-Golgi activate Arf1 to form COPIcoated vesicles for retrograde cargo sorting, whereas Sec7 generates clathrin/adaptorcoated vesicles at the trans-Golgi network (TGN) for forward cargo transport. A central question is how the same activated Arf1 protein manages to assemble different coats depending on the donor Golgi compartment. A previous study has postulated that the interaction between Gea1 and COPI would channel Arf1 activation for COPI vesicle budding. Here, we found that the p24 complex, a major COPI vesicle cargo, promotes the binding of Gea1 with COPI by increasing the COPI association to the membrane independently of Arf1 activation. Furthermore, the p24 complex also facilitates the interaction of Arf1 with its COPI effector. Therefore, our study supports a mechanism by which the p24 complex contributes to program Arf1 activation by Gea1 for selective COPI coat assembly at the cis-Golgi compartment.Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades BFU2017-89700-PMinisterio dle Economía y Competitividad BFU2015- 69183-PUniversidad de Sevilla VIPPIT-2020-I.

Determination of the lipid composition of the GPI anchor

In eukaryotic cells, a subset of cell surface proteins is attached by the glycolipid glycosylphosphatidylinositol (GPI) to the external leaflet of the plasma membrane where they play important roles as enzymes, receptors, or adhesion molecules. Here we present a protocol for purification and mass spectrometry analysis of the lipid moiety of individual GPI-anchored proteins (GPI-APs) in yeast. The method involves the expression of a specific GPI-AP tagged with GFP, solubilization, immunoprecipitation, separation by electrophoresis, blotting onto PVDF, release and extraction of the GPI-lipid moiety and analysis by mass spectrometry. By using this protocol, we could determine the precise GPI-lipid structure of the GPI-AP Gas1-GFP in a modified yeast strain. This protocol can be used to identify the lipid composition of the GPI anchor of distinct GPI-APs from yeast to mammals and can be adapted to determine other types of protein lipidation.FEDER/Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades BFU2017- 89700-PUniversidad de Sevilla VIPPIT-2020-I.5NCCR Chemical Biology and the Swiss National Science Foundation (51NF40-185898 and 310030_184949

Dual Independent Roles of the p24 Complex in Selectivity of Secretory Cargo Export from the Endoplasmic Reticulum

This article belongs to the Section Organelle Function.The cellular mechanisms that ensure the selectivity and fidelity of secretory cargo protein transport from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi are still not well understood. The p24 protein complex acts as a specific cargo receptor for GPI-anchored proteins by facilitating their ER exit through a specialized export pathway in yeast. In parallel, the p24 complex can also exit the ER using the general pathway that exports the rest of secretory proteins with their respective cargo receptors. Here, we show biochemically that the p24 complex associates at the ER with other cargo receptors in a COPII-dependent manner, forming high-molecular weight multireceptor complexes. Furthermore, live cell imaging analysis reveals that the p24 complex is required to retain in the ER secretory cargos when their specific receptors are absent. This requirement does not involve neither the unfolded protein response nor the retrograde transport from the Golgi. Our results suggest that, in addition to its role as a cargo receptor in the specialized GPI-anchored protein pathway, the p24 complex also plays an independent role in secretory cargo selectivity during its exit through the general ER export pathway, preventing the non-selective bulk flow of native secretory cargos. This mechanism would ensure receptor-regulated cargo transport, providing an additional layer of regulation of secretory cargo selectivity during ER export.This research was funded by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO), BFU2017-89700-P to Manuel Muñiz and BFU2016-78265-P to Veit Goder. ‘V Own Research Plan’ of the University of Seville (VPPI-US) contract (cofounded by the European Social Fund) to Sergio Lopez. University of Seville fellowships to Sofia Rodriguez-Gallardo, Ana Maria Perez-Linero and Javier Manzano-Lopez. Ministry of Education, Culture and Sport (MECD) fellowship to Susana Sabido-Bozo