Zecken-übertragene Anaplasmataceae und Babesia microti in Kleinsäugern und ihren Zecken an Standorten mit unterschiedlicher Habitatstruktur

Kleinsäuger sind essentiell für die Entwicklung und die Verbreitung von subadulten Schildzecken. Den Kleinsäugern kommt so eine wichtige Rolle als potentielle Reservoirwirte für Zecken-übertragene Pathogene zu. Die Ziele dieser Studie waren unterschiedliche Zecken-übertragene Pathogene in wildlebenden Kleinsäugern nachzuweisen und die Reservoirfunktion der jeweiligen Kleinsäugerarten, im Zusammenhang mit unterschiedlich strukturierten Habitaten, zu evaluieren. Zwischen 2012 und 2013 wurden Kleinsäuger an drei unterschiedlich strukturierten Standorten gefangen: (1) an einem Stadtpark in Regensburg, (2) an einem silvatischen Standort in Tussenhausen im Unterallgäu und (3) an einem renaturierten Standort, der in der Nähe von Leipzig in Sachsen liegt. Zusätzlich wurden Zecken im Jahr 2013 am Waldstandort geflaggt. DNA wurde aus Blut-, Milz- und Gonaden-Proben der Mäuse und aus Mäuseneonaten extrahiert. Auf den Mäusen befindliche Zecken wurden abgesammelt. Aus diesen und den wirtssuchenden Zecken wurde ebenfalls DNA extrahiert. Zusätzlich wurden bereits vorhandene DNA-Proben aus wirtssuchenden Zecken aus den Jahren 2009-2013 bzw. 2011-2012 vom urbanen bzw. vom silvatischen Standort untersucht. Die Proben wurden mittels konventioneller oder Real-Time PCR auf Anaplasma phagocytophilum, Candidatus Neoehrlichia mikurensis (CNM) und Babesia microti untersucht. Insgesamt wurden 631 Kleinsäuger zehn verschiedener Arten gefangen (4 Apodemus agrarius, 7 Microtus arvalis, 1 M. agrestis, 396 Myodes glareolus, 2 Mustela nivalis, 5 Sorex coronatus, 1 Sorex araneus, 1 Talpa europaea, 36 Ap. sylvaticus, 178 Ap. flavicollis). Davon wurden insgesamt 36 Mäuse im Stadtpark, 243 am silvatischen und 352 am renaturierten Standort, wo die größte Artenvielfalt vorherrschte (n=8), gefangen. Insgesamt wurden 3.391 Zecken drei verschiedener Arten (8 Ixodes trianguliceps, 3.250 Ixodes ricinus, 133 Dermacentor reticulatus) abgesammelt. CNM wurde in insgesamt 28,6 % der Kleinsäuger nachgewiesen. Dabei waren 31,6 % My. glareolus, 28,1 % Ap. flavicollis, 57,1 % M. arvalis und 2,7% Ap. sylvaticus positiv. Die Prävalenzen unterschieden sich signifikant beim Vergleich der jeweiligen Standorte, wobei die Infektionsrate am renaturierten Standort am höchsten war (χ²: 13,4; p: 0,0004). Insgesamt waren 3,8 % der gesogenen und 2,2 % der wirtssuchenden Zecken positiv. In den untersuchten Kleinsäugerföten bzw. -Neonaten, die von positiven Muttertieren stammten, war die Prävalenz für CNM 31,8 %. Insgesamt 60,0 % der positiven Muttertiere hatten wenigstens einen positiven Foetus oder Neonaten. Anaplasma phagocytophilum wurde zu einem geringen Prozentsatz in Nagern festgestellt (0,0-5,6 %), wobei es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Standorten, Jahren und Kleinsäugerarten gab. Jedoch waren gesogene Nymphen (I. ricinus) signifikant häufiger befallen als gesogene Larven (χ²: 25,1; p: <0,0001). Die Prävalenz für B. microti war in Nagern vom Waldstandort (4,6 %) signifikant höher als in Nagern von den beiden anderen Standorten (0-0,6 %) (χ²: 11,95; p: 0,00125). Babesia microti konnte in M. arvalis (14,3 %), Ap. flavicollis (0,4 %) und My. glareolus (2,3 %) festgestellt werden. Babesia microti wurde in 3 von 965 (1 I. trianguliceps, 2 I. ricinus) gesogenen Zecken festgestellt (0,3 %; 95 % CI: 0,0-1,0). Diese Zecken stammten ausschließlich vom Waldstandort. Ixodes ricinus Nymphen waren signifikant häufiger infiziert als I. ricinus Larven (χ²: 26,7; p <0,0001). Ein Vorkommen von I. trianguliceps Zecken war ausschließlich am silvatischen Standort nachweisbar. Gesogene I. trianguliceps und I. ricinus Zecken waren zu einer geringen Prävalenz positiv (14,3 % bzw. 0,2 %). Aufgrund der hohen CNM Prävalenzen und dem möglichen diaplazentaren Übertragungsweg in Mäusen, ist CNM wahrscheinlich eher ein Nager-assoziiertes als ein Zecken-assoziiertes Pathogen. Die Prävalenzen in Nagern waren außerdem 10-mal so hoch, als in gesaugten und wirtssuchenden Zecken. Aufgrund der niedrigen Prävalenzen sind die untersuchten Nagerarten wahrscheinlich nur zufällige Wirte für A. phagocytophilum. Die Zirkulation von B. microti scheint dort wahrscheinlicher, wo es eine sympatrische Existenz von Wühlmäusen und I. trianguliceps Zecken gibt. Im Gegensatz dazu war die Prävalenz in Apodemus spp. gering und somit ist davon auszugehen, dass Mäuse dieser Familie an den untersuchten Standorten für den Erhalt von B. microti eine untergeordnete Rolle spielen

Zecken-übertragene Anaplasmataceae und Babesia microti in Kleinsäugern und ihren Zecken an Standorten mit unterschiedlicher Habitatstruktur

Kleinsäuger sind essentiell für die Entwicklung und die Verbreitung von subadulten Schildzecken. Den Kleinsäugern kommt so eine wichtige Rolle als potentielle Reservoirwirte für Zecken-übertragene Pathogene zu. Die Ziele dieser Studie waren unterschiedliche Zecken-übertragene Pathogene in wildlebenden Kleinsäugern nachzuweisen und die Reservoirfunktion der jeweiligen Kleinsäugerarten, im Zusammenhang mit unterschiedlich strukturierten Habitaten, zu evaluieren. Zwischen 2012 und 2013 wurden Kleinsäuger an drei unterschiedlich strukturierten Standorten gefangen: (1) an einem Stadtpark in Regensburg, (2) an einem silvatischen Standort in Tussenhausen im Unterallgäu und (3) an einem renaturierten Standort, der in der Nähe von Leipzig in Sachsen liegt. Zusätzlich wurden Zecken im Jahr 2013 am Waldstandort geflaggt. DNA wurde aus Blut-, Milz- und Gonaden-Proben der Mäuse und aus Mäuseneonaten extrahiert. Auf den Mäusen befindliche Zecken wurden abgesammelt. Aus diesen und den wirtssuchenden Zecken wurde ebenfalls DNA extrahiert. Zusätzlich wurden bereits vorhandene DNA-Proben aus wirtssuchenden Zecken aus den Jahren 2009-2013 bzw. 2011-2012 vom urbanen bzw. vom silvatischen Standort untersucht. Die Proben wurden mittels konventioneller oder Real-Time PCR auf Anaplasma phagocytophilum, Candidatus Neoehrlichia mikurensis (CNM) und Babesia microti untersucht. Insgesamt wurden 631 Kleinsäuger zehn verschiedener Arten gefangen (4 Apodemus agrarius, 7 Microtus arvalis, 1 M. agrestis, 396 Myodes glareolus, 2 Mustela nivalis, 5 Sorex coronatus, 1 Sorex araneus, 1 Talpa europaea, 36 Ap. sylvaticus, 178 Ap. flavicollis). Davon wurden insgesamt 36 Mäuse im Stadtpark, 243 am silvatischen und 352 am renaturierten Standort, wo die größte Artenvielfalt vorherrschte (n=8), gefangen. Insgesamt wurden 3.391 Zecken drei verschiedener Arten (8 Ixodes trianguliceps, 3.250 Ixodes ricinus, 133 Dermacentor reticulatus) abgesammelt. CNM wurde in insgesamt 28,6 % der Kleinsäuger nachgewiesen. Dabei waren 31,6 % My. glareolus, 28,1 % Ap. flavicollis, 57,1 % M. arvalis und 2,7% Ap. sylvaticus positiv. Die Prävalenzen unterschieden sich signifikant beim Vergleich der jeweiligen Standorte, wobei die Infektionsrate am renaturierten Standort am höchsten war (χ²: 13,4; p: 0,0004). Insgesamt waren 3,8 % der gesogenen und 2,2 % der wirtssuchenden Zecken positiv. In den untersuchten Kleinsäugerföten bzw. -Neonaten, die von positiven Muttertieren stammten, war die Prävalenz für CNM 31,8 %. Insgesamt 60,0 % der positiven Muttertiere hatten wenigstens einen positiven Foetus oder Neonaten. Anaplasma phagocytophilum wurde zu einem geringen Prozentsatz in Nagern festgestellt (0,0-5,6 %), wobei es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Standorten, Jahren und Kleinsäugerarten gab. Jedoch waren gesogene Nymphen (I. ricinus) signifikant häufiger befallen als gesogene Larven (χ²: 25,1; p: <0,0001). Die Prävalenz für B. microti war in Nagern vom Waldstandort (4,6 %) signifikant höher als in Nagern von den beiden anderen Standorten (0-0,6 %) (χ²: 11,95; p: 0,00125). Babesia microti konnte in M. arvalis (14,3 %), Ap. flavicollis (0,4 %) und My. glareolus (2,3 %) festgestellt werden. Babesia microti wurde in 3 von 965 (1 I. trianguliceps, 2 I. ricinus) gesogenen Zecken festgestellt (0,3 %; 95 % CI: 0,0-1,0). Diese Zecken stammten ausschließlich vom Waldstandort. Ixodes ricinus Nymphen waren signifikant häufiger infiziert als I. ricinus Larven (χ²: 26,7; p <0,0001). Ein Vorkommen von I. trianguliceps Zecken war ausschließlich am silvatischen Standort nachweisbar. Gesogene I. trianguliceps und I. ricinus Zecken waren zu einer geringen Prävalenz positiv (14,3 % bzw. 0,2 %). Aufgrund der hohen CNM Prävalenzen und dem möglichen diaplazentaren Übertragungsweg in Mäusen, ist CNM wahrscheinlich eher ein Nager-assoziiertes als ein Zecken-assoziiertes Pathogen. Die Prävalenzen in Nagern waren außerdem 10-mal so hoch, als in gesaugten und wirtssuchenden Zecken. Aufgrund der niedrigen Prävalenzen sind die untersuchten Nagerarten wahrscheinlich nur zufällige Wirte für A. phagocytophilum. Die Zirkulation von B. microti scheint dort wahrscheinlicher, wo es eine sympatrische Existenz von Wühlmäusen und I. trianguliceps Zecken gibt. Im Gegensatz dazu war die Prävalenz in Apodemus spp. gering und somit ist davon auszugehen, dass Mäuse dieser Familie an den untersuchten Standorten für den Erhalt von B. microti eine untergeordnete Rolle spielen

The Red Fox (Vulpes vulpes) as Sentinel for Tick-Borne Encephalitis Virus in Endemic and Non-Endemic Areas

Tick-borne encephalitis (TBE) is one of the most important viral zoonosis caused by a neurotropic arbovirus (TBEV). In Germany, TBE is classified as a notifiable disease with an average of 350 autochthonous human cases annually. The incidence-based risk assessment in Germany came under criticism because every year, a number of autochthonous human TBE cases have been detected outside of the official risk areas. Therefore, it is necessary to find additional parameters to strengthen TBEV surveillance. The aim of this study was to examine red foxes as sentinels for TBE. Thus far, there are no published data about the sensitivity and specificity for serological methods testing fox samples. Hence, we aimed to define a system for the screening of TBEV-specific antibodies in red foxes. A total of 1233 fox sera were collected and examined by ELISA and IIFA and confirmed by micro-NT. The overall seroprevalence of antibodies against TBEV in red foxes from Germany confirmed by micro-NT was 21.1%. The seroprevalence differed significantly between risk (30.5%) and non-risk areas (13.1%), with good correlations to local TBE incidence in humans. In conclusion, serological monitoring of red foxes represents a promising surrogate marker system and may even determine unexpected TBEV foci in regions currently regarded as non-risk areas

Prevalence and Genotype Allocation of Pathogenic Leptospira Species in Small Mammals from Various Habitat Types in Germany

Small mammals serve as most important reservoirs for Leptospira spp., the causative agents of Leptospirosis, which is one of the most neglected and widespread zoonotic diseases worldwide. The knowledge about Leptospira spp. occurring in small mammals from Germany is scarce. Thus, this study's objectives were to investigate the occurrence of Leptospira spp. and the inherent sequence types in small mammals from three different study sites: a forest in southern Germany (site B1);a National Park in south-eastern Germany (site B2) and a renaturalised area, in eastern Germany (site S) where small mammals were captured. DNA was extracted from kidneys of small mammals and tested for Leptospira spp. by real-time PCR. Positive samples were further analysed by duplex and conventional PCRs. For 14 positive samples, multi locus sequence typing (MLST) was performed. Altogether, 1213 small mammals were captured: 216 at site B1, 456 at site B2 and 541 at site S belonging to following species: Sorex (S.) araneus, S. coronatus, Apodemus (A.) flavicollis, Myodes glareolus, Microtus (Mi.) arvalis, Crocidura russula, Arvicola terrestris, A. agrarius, Mustela nivalis, Talpa europaea, and Mi. agrestis. DNA of Leptospira spp. was detected in 6% of all small mammals. At site B1, 25 small mammals (11.6%), at site B2, 15 small mammals (3.3%) and at site S, 33 small mammals (6.1%) were positive for Leptospira spp. Overall, 54 of the positive samples were further determined as L. kirschneri, nine as L. interrogans and four as L. borgpetersenii while five real-time PCR-positive samples could not be further determined by conventional PCR. MLST results revealed focal occurrence of L. interrogans and L. kirschneri sequence type (ST) 117 while L. kirschneri ST 110 was present in small mammals at all three sites. Further, this study provides evidence for a particular host association of L. borgpetersenii to mice of the genus Apodemus

Preliminary Study on Artificial versus Animal-Based Feeding Systems for Amblyomma Ticks (Acari: Ixodidae)

Hard ticks pose a threat to animal and human health. Active life stages need to feed on a vertebrate host in order to complete their life cycle. To study processes such as tick-pathogen interactions or drug efficacy and pharmacokinetics, it is necessary to maintain tick colonies under defined laboratory conditions, typically using laboratory animals. The aim of this study was to test a membrane-based artificial feeding system (AFS) applicable for Amblyomma ticks using Amblyomma tonelliae as a biological model. Adult ticks from a laboratory colony were fed in a membrane-based AFS. For comparison, other A. tonelliae adults were fed on calf and rabbit. The proportions of attached (AFS: 76%; calf/rabbit: 100%) and engorged females (AFS: 47.4%; calf/rabbit: 100%) in the AFS were significantly lower compared to animal-based feeding (p = 0.0265). The engorgement weight of in vitro fed ticks (̲ = 658 mg; SD ± 259.80) did not significantly differ from that of ticks fed on animals (p = 0.3272, respectively 0.0947). The proportion of females that oviposited was 100% for all three feeding methods. However, the incubation period of eggs (̲ = 54 days; SD ± 7) was longer in the AFS compared to conventional animal-based feeding (p = 0.0014); ̲ = 45 days; SD ± 2 in the rabbit and (p = 0.0144). ̲ = 48 days; SD ± 2 in the calf). Egg cluster hatching (̲ = 41%; SD ± 44.82) was lower in the AFS than in the other feeding methods (rabbit: ̲ = 74%; SD ± 20; p = 0.0529; calf: ̲ = 81%; SD ± 22; p = 0.0256). Although the attachment, development, and the hatching of AFS ticks were below those from animal-based feeding, the method may be useful in future experiments. Nevertheless, further experiments with a higher number of tick specimens (including immature life stages) and different attractant stimuli are required to confirm the preliminary results of this study and to evaluate the applicability of AFS for Amblyomma ticks as an alternative to animal-based feeding methods

Evaluating Transmission Paths for Three Different Bartonella spp. in Ixodes ricinus Ticks Using Artificial Feeding

Bartonellae are facultative intracellular alpha-proteobacteria often transmitted by arthropods. Ixodes ricinus is the most important vector for arthropod-borne pathogens in Europe. However, its vector competence for Bartonella spp. is still unclear. This study aimed to experimentally compare its vector competence for three Bartonella species: B. henselae, B. grahamii, and B. schoenbuchensis. A total of 1333 ticks (1021 nymphs and 312 adults) were separated into four groups, one for each pathogen and a negative control group. Ticks were fed artificially with bovine blood spiked with the respective Bartonella species. DNA was extracted from selected ticks to verify Bartonella-infection by PCR. DNA of Bartonella spp. was detected in 34% of nymphs and females after feeding. The best engorgement results were obtained by ticks fed with B. henselae-spiked blood (65.3%) and B. schoenbuchensis (61.6%). Significantly more nymphs fed on infected blood (37.3%) molted into adults compared to the control group (11.4%). Bartonella DNA was found in 22% of eggs laid by previously infected females and in 8.6% of adults molted from infected nymphs. The transovarial and transstadial transmission of bartonellae suggest that I. ricinus could be a potential vector for three bacteria

Host–pathogen associations revealed by genotyping of European strains of Anaplasma phagocytophilum to describe natural endemic cycles

Background The zoonotic intracellular alpha-proteobacterium Anaplasma phagocytophilum is a tick-transmitted pathogen. The associations between vertebrate reservoirs and vectors are described as wide-ranging, and it was previously shown that the pathogenicity of A. phagocytophilum differs depending on the combination of pathogen variant and infected host species. This leads to the question of whether there are variations in particular gene loci associated with different virulence. Therefore, this study aims at clarifying existing host-variant combinations and detecting possible reservoir hosts. To understand these interactions, a complex toolset for molecular epidemiology, phylogeny and network theory was applied. Methods Sequences of up to four gene loci (msp4, msp2, groEL and 16S rRNA) were evaluated for different isolates from variable host species, including, for example, dogs, cattle and deer. Variant typing was conducted for each gene locus individually, and combinations of different gene loci were analysed to gain more detailed information about the genetic plasticity of A. phagocytophilum. Results were displayed as minimum spanning nets and correlation nets. Results The highest diversity of variants for all gene loci was observed in roe deer. In cattle, a reduced number of variants for 16S rRNA [only 16S-20(W) and 16S-22(Y)] but multiple variants of msp4 and groEL were found. For dogs, two msp4 variants [m4-20 and m4-2(B/C)] were found to be linked to different variants of the other three gene loci, creating two main combinations of gene loci variants. Cattle are placed centrally in the minimum spanning net analyses, indicating a crucial role in the transmission cycles by possibly bridging the vector-wildlife cycle to infections of humans and domestic animals. The minimum spanning nets confirmed previously described epidemiological cycles of the bacterium in Europe, showing separation of variants originating from wildlife animals only and a set of variants shared by wild and domestic animals. Conclusions In this comprehensive study of 1280 sequences, we found a high number of gene variants only occurring in specific hosts. Additionally, different hosts show unique but also shared variant combinations. The use of our four gene loci expand the knowledge of host–pathogen interactions and may be a starting point to predict future spread and infection risks of A. phagocytophilum in Europe

Ixodes ricinus and Its Transmitted Pathogens in Urban and Peri-Urban Areas in Europe: New Hazards and Relevance for Public Health.

Tick-borne diseases represent major public and animal health issues worldwide. Ixodes ricinus, primarily associated with deciduous and mixed forests, is the principal vector of causative agents of viral, bacterial, and protozoan zoonotic diseases in Europe. Recently, abundant tick populations have been observed in European urban green areas, which are of public health relevance due to the exposure of humans and domesticated animals to potentially infected ticks. In urban habitats, small and medium-sized mammals, birds, companion animals (dogs and cats), and larger mammals (roe deer and wild boar) play a role in maintenance of tick populations and as reservoirs of tick-borne pathogens. Presence of ticks infected with tick-borne encephalitis virus and high prevalence of ticks infected with Borrelia burgdorferi s.l., causing Lyme borreliosis, have been reported from urbanized areas in Europe. Emerging pathogens, including bacteria of the order Rickettsiales (Anaplasma phagocytophilum, "Candidatus Neoehrlichia mikurensis," Rickettsia helvetica, and R. monacensis), Borrelia miyamotoi, and protozoans (Babesia divergens, B. venatorum, and B. microti) have also been detected in urban tick populations. Understanding the ecology of ticks and their associations with hosts in a European urbanized environment is crucial to quantify parameters necessary for risk pre-assessment and identification of public health strategies for control and prevention of tick-borne diseases

Ixodes ricinus and its transmitted pathogens in urban and peri-urban areas in Europe: new hazards and relevance for public health

Tick-borne diseases represent major public and animal health issues worldwide. Ixodes ricinus, primarily associated with deciduous and mixed forests, is the principal vector of causative agents of viral, bacterial, and protozoan zoonotic diseases in Europe. Recently, abundant tick populations have been observed in European urban green areas, which are of public health relevance due to the exposure of humans and domesticated animals to potentially infected ticks. In urban habitats, small and medium-sized mammals, birds, companion animals (dogs and cats), and larger mammals (roe deer and wild boar) play a role in maintenance of tick populations and as reservoirs of tick-borne pathogens. Presence of ticks infected with tick-borne encephalitis virus and high prevalence of ticks infected with Borrelia burgdorferi s.l., causing Lyme borreliosis, have been reported from urbanized areas in Europe. Emerging pathogens, including bacteria of the order Rickettsiales (Anaplasma phagocytophilum, “Candidatus Neoehrlichia mikurensis,” Rickettsia helvetica, and R. monacensis), Borrelia miyamotoi, and protozoans (Babesia divergens, B. venatorum, and B. microti) have also been detected in urban tick populations. Understanding the ecology of ticks and their associations with hosts in a European urbanized environment is crucial to quantify parameters necessary for risk pre-assessment and identification of public health strategies for control and prevention of tick-borne diseases