Aneuploidy impairs protein folding and genome integrity in human cells

Aneuploidy or imbalanced chromosome content is the cause of pathological conditions such as Down's syndrome and is also a hallmark of cancer where it is linked with malignancy and poor prognosis. A growing body of evidence has demonstrated that aneuploidy exerts a large number of effects at the cellular level. These effects include an impairment of proliferation, distinct changes to the transcriptome and proteome, as well as a disturbance of cellular proteostasis. However, the molecular mechanisms underlying the impairment of proteostasis and the changes in gene expression are not well understood. Further, the consequences of the altered gene expression in aneuploid cells also remain incompletely characterised. The work described herein was performed to gain insights into the consequences of aneuploidy in human cells. We have found that human aneuploid cells are impaired in HSP90-mediated protein folding. Further, we demonstrate that aneuploidy hampers induction of the heat shock response suggesting that the activity of the transcription factor HSF1 is compromised in human aneuploid cells. Increasing the levels of HSF1, either by endogenous or exogenous means, counteracts the effects of aneuploidy on HSP90 function, indicating that the defective HSP90 function of aneuploid cells is due to insufficient HSF1 capacity. We also demonstrate that the deficient protein folding capacity is at least partly responsible for the complex changes in gene expression observed in aneuploid cells. One of the most striking characteristics of the gene expression changes elicited by aneuploidy is the consistent downregulation of factors related to DNA transactions. Thus, the second study described here was undertaken to determine the effects of aneuploidy on DNA replication and genome stability. Our analysis showed that DNA replication is indeed impaired in human aneuploid cells, leading to higher levels of anaphase bridges, ultrafine bridges, chromosome breaks, as well as ultimately, complex chromosomal rearrangements. These defects were shown to stem from lower expression of the MCM2-7 helicase and could be rescued by MCM2-7 overexpression. The results described here provide mechanistic insight into the causes of the disturbed proteostasis in aneuploids as well as revealing the consequences of impaired protein folding capacity for aneuploid cells. Further, they demonstrate that aneuploidy is by itself capable of destabilising the genome and delineate a molecular mechanism by which this can occur. Taken together, the gleaned insights may have important implications for the role of aneuploidy in pathological conditions.Aneuploidie ist eine numerische Chromosomenaberration, ein Ungleichgewicht der Chromosomenzahl, die Down Syndrom verursacht und zu den Hauptcharakteristiken von Krebs zählt. Bei Tumoren ist Aneuploidie mit Malignität und schlechter Prognose verbunden. Eine stetig wachsende Evidenzlage zeigt, dass Aneuploidie eine Vielzahl von Effekten auf zellulärer Ebene hat. Unter anderem führt Aneuploidie zu einer Beeinträchtigung der Zellproliferation, zu bestimmten Veränderungen des Transkriptoms und des Proteoms, sowie zu Störungen der zellulären Proteostase. Es ist allerdings unklar, welche Mechanismen die Proteostase und die Genexpression beeinträchtigen. Auch sind die genauen Konsequenzen der veränderten Genexpression noch nicht geklärt. Die in dieser Dissertation beschriebene Forschungsarbeit setzte sich zum Ziel, neue Erkenntnisse zur Beantwortung dieser Fragen beizutragen. Wir haben herausgefunden, dass menschliche aneuploide Zellen eine Beeinträchtigung in der HSP90-abhängigen Proteinfaltung aufweisen. Darüber hinaus zeigen wir, dass Aneuploidie die Induktion der zellulären Hitzeschockantwort hemmt, was auf eine Störung des Transkriptionsfaktors HSF1 hindeuten könnte. Tatsächlich führt eine Erhöhung der zellulären HSF1 Konzentration, entweder auf endogene oder auf exogene Weise, zu einer Umkehrung des Effekts von Aneuploidie auf die Funktion von HSP90, was die Hypothese stützt, dass die gestörte HSP90 Funktion in aneuploiden Zellen auf eine unzureichende Kapazität von HSF1 zurückzuführen ist. Wir zeigen außerdem, dass die geminderte Proteinfaltungskapazität zumindest teilweise für die komplexen Veränderungen in der Genexpression in aneuploiden Zellen verantwortlich ist. Eine der auffälligsten Veränderungen der Genexpression in aneuploiden Zellen ist die konstante Repression von Faktoren, die in die DNS-Transaktionen verwickelt sind. Aus diesem Grund setzten wir uns mit der zweiten in dieser Arbeit beschriebenen Studie zum Ziel, die Auswirkungen von Aneuploidie auf DNS-Replikation und auf die genomische Stabilität zu ermitteln. Unsere Analysen beweisen, dass in aneuploiden menschlichen Zellen die DNS-Replikation tatsächlich beeinträchtigt ist, was zu erhöhten Mengen von Anaphase-Brücken, fadenförmigen DNS-Brücken, Chromosombrüchen und letztendlich zu komplexen Umordnungen der Chromosomen führt. Wir zeigen, dass diese Schäden auf eine verringerte Expression der MCM2-7 Helikase zurückzuführen sind und durch Überexpression von MCM2-7 revidierten werden können. Die hier beschriebenen Ergebnisse liefern neue mechanistische Erkenntnisse zu den Ursachen der gestörten Proteostase in Aneuploidie und der Auswirkungen von beeinträchtigter Proteinfaltungskapazität auf aneuploide Zellen. Sie beweisen, dass Aneuploidie selbst imstande ist, das Genom zu destabilisieren und beschreiben den molekularen Mechanismus, der dazu führt. Zusammengefasst könnten die gewonnen Erkenntnisse wichtige Implikationen für die Rolle von Aneuploidie in Krankheitszuständen haben

Aneuploidy impairs protein folding and genome integrity in human cells

Aneuploidy or imbalanced chromosome content is the cause of pathological conditions such as Down's syndrome and is also a hallmark of cancer where it is linked with malignancy and poor prognosis. A growing body of evidence has demonstrated that aneuploidy exerts a large number of effects at the cellular level. These effects include an impairment of proliferation, distinct changes to the transcriptome and proteome, as well as a disturbance of cellular proteostasis. However, the molecular mechanisms underlying the impairment of proteostasis and the changes in gene expression are not well understood. Further, the consequences of the altered gene expression in aneuploid cells also remain incompletely characterised. The work described herein was performed to gain insights into the consequences of aneuploidy in human cells. We have found that human aneuploid cells are impaired in HSP90-mediated protein folding. Further, we demonstrate that aneuploidy hampers induction of the heat shock response suggesting that the activity of the transcription factor HSF1 is compromised in human aneuploid cells. Increasing the levels of HSF1, either by endogenous or exogenous means, counteracts the effects of aneuploidy on HSP90 function, indicating that the defective HSP90 function of aneuploid cells is due to insufficient HSF1 capacity. We also demonstrate that the deficient protein folding capacity is at least partly responsible for the complex changes in gene expression observed in aneuploid cells. One of the most striking characteristics of the gene expression changes elicited by aneuploidy is the consistent downregulation of factors related to DNA transactions. Thus, the second study described here was undertaken to determine the effects of aneuploidy on DNA replication and genome stability. Our analysis showed that DNA replication is indeed impaired in human aneuploid cells, leading to higher levels of anaphase bridges, ultrafine bridges, chromosome breaks, as well as ultimately, complex chromosomal rearrangements. These defects were shown to stem from lower expression of the MCM2-7 helicase and could be rescued by MCM2-7 overexpression. The results described here provide mechanistic insight into the causes of the disturbed proteostasis in aneuploids as well as revealing the consequences of impaired protein folding capacity for aneuploid cells. Further, they demonstrate that aneuploidy is by itself capable of destabilising the genome and delineate a molecular mechanism by which this can occur. Taken together, the gleaned insights may have important implications for the role of aneuploidy in pathological conditions.Aneuploidie ist eine numerische Chromosomenaberration, ein Ungleichgewicht der Chromosomenzahl, die Down Syndrom verursacht und zu den Hauptcharakteristiken von Krebs zählt. Bei Tumoren ist Aneuploidie mit Malignität und schlechter Prognose verbunden. Eine stetig wachsende Evidenzlage zeigt, dass Aneuploidie eine Vielzahl von Effekten auf zellulärer Ebene hat. Unter anderem führt Aneuploidie zu einer Beeinträchtigung der Zellproliferation, zu bestimmten Veränderungen des Transkriptoms und des Proteoms, sowie zu Störungen der zellulären Proteostase. Es ist allerdings unklar, welche Mechanismen die Proteostase und die Genexpression beeinträchtigen. Auch sind die genauen Konsequenzen der veränderten Genexpression noch nicht geklärt. Die in dieser Dissertation beschriebene Forschungsarbeit setzte sich zum Ziel, neue Erkenntnisse zur Beantwortung dieser Fragen beizutragen. Wir haben herausgefunden, dass menschliche aneuploide Zellen eine Beeinträchtigung in der HSP90-abhängigen Proteinfaltung aufweisen. Darüber hinaus zeigen wir, dass Aneuploidie die Induktion der zellulären Hitzeschockantwort hemmt, was auf eine Störung des Transkriptionsfaktors HSF1 hindeuten könnte. Tatsächlich führt eine Erhöhung der zellulären HSF1 Konzentration, entweder auf endogene oder auf exogene Weise, zu einer Umkehrung des Effekts von Aneuploidie auf die Funktion von HSP90, was die Hypothese stützt, dass die gestörte HSP90 Funktion in aneuploiden Zellen auf eine unzureichende Kapazität von HSF1 zurückzuführen ist. Wir zeigen außerdem, dass die geminderte Proteinfaltungskapazität zumindest teilweise für die komplexen Veränderungen in der Genexpression in aneuploiden Zellen verantwortlich ist. Eine der auffälligsten Veränderungen der Genexpression in aneuploiden Zellen ist die konstante Repression von Faktoren, die in die DNS-Transaktionen verwickelt sind. Aus diesem Grund setzten wir uns mit der zweiten in dieser Arbeit beschriebenen Studie zum Ziel, die Auswirkungen von Aneuploidie auf DNS-Replikation und auf die genomische Stabilität zu ermitteln. Unsere Analysen beweisen, dass in aneuploiden menschlichen Zellen die DNS-Replikation tatsächlich beeinträchtigt ist, was zu erhöhten Mengen von Anaphase-Brücken, fadenförmigen DNS-Brücken, Chromosombrüchen und letztendlich zu komplexen Umordnungen der Chromosomen führt. Wir zeigen, dass diese Schäden auf eine verringerte Expression der MCM2-7 Helikase zurückzuführen sind und durch Überexpression von MCM2-7 revidierten werden können. Die hier beschriebenen Ergebnisse liefern neue mechanistische Erkenntnisse zu den Ursachen der gestörten Proteostase in Aneuploidie und der Auswirkungen von beeinträchtigter Proteinfaltungskapazität auf aneuploide Zellen. Sie beweisen, dass Aneuploidie selbst imstande ist, das Genom zu destabilisieren und beschreiben den molekularen Mechanismus, der dazu führt. Zusammengefasst könnten die gewonnen Erkenntnisse wichtige Implikationen für die Rolle von Aneuploidie in Krankheitszuständen haben

NOXA contributes to the sensitivity of PERK-deficient cells to ER stress.

PKR-like ER kinase (PERK) deficient mouse embryonic fibroblasts (MEFs) are hypersensitive to ER stress-induced apoptosis. However, the molecular determinants of increased sensitivity of PERK(-/-) MEFs are not clearly understood. Here we show that induction of several Unfolded Protein Response (UPR) target genes is attenuated in PERK(-/-) MEFs. We also report elevated expression of the BH3-only protein, NOXA in PERK(-/-) MEFs. Further, shRNA-mediated knockdown of NOXA rescued the hypersensitivity of PERK(-/-) MEFs to ER stress-induced apoptosis. Taken together our results suggest that compromised induction of UPR and increased NOXA expression contributes to hypersensitivity of PERK(-/-) MEFs to ER stress-induced apoptosis

Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation

Do young and old protein molecules have the same probability to be degraded? We addressed this question using metabolic pulse-chase labeling and quantitative mass spectrometry to obtain degradation profiles for thousands of proteins. We find that gt;10 of proteins are degraded non-exponentially. Specifically, proteins are less stable in the first few hours of their life and stabilize with age. Degradation profiles are conserved and similar in two cell types. Many non-exponentially degraded (NED) proteins are subunits of complexes that are produced in super-stoichiometric amounts relative to their exponentially degraded (ED) counterparts. Within complexes, \NED\} proteins have larger interaction interfaces and assemble earlier than \{ED\} subunits. Amplifying genes encoding \{NED\ proteins increases their initial degradation. Consistently, decay profiles can predict protein level attenuation in aneuploid cells. Together, our data show that non-exponential degradation is common, conserved, and has important consequences for complex formation and regulation of protein abundance

The presence of extra chromosomes leads to genomic instability

Aneuploidy is a hallmark of cancer and underlies genetic disorders characterized by severe developmental defects, yet the molecular mechanisms explaining its effects on cellular physiology remain elusive. Here we show, using a series of human cells with defined aneuploid karyotypes, that gain of a single chromosome increases genomic instability. Next-generation sequencing and SNP-array analysis reveal accumulation of chromosomal rearrangements in aneuploids, with break point junction patterns suggestive of replication defects. Trisomic and tetrasomic cells also show increased DNA damage and sensitivity to replication stress. Strikingly, we find that aneuploidy-induced genomic instability can be explained by the reduced expression of the replicative helicase MCM2-7. Accordingly, restoring near-wild-type levels of chromatin-bound MCM helicase partly rescues the genomic instability phenotypes. Thus, gain of chromosomes triggers replication stress, thereby promoting genomic instability and possibly contributing to tumorigenesis