Determination of accurate electron chiral asymmetries in fenchone and camphor in the VUV range: sensitivity to isomerism and enantiomeric purity

Photoelectron circular dichroism (PECD) manifests itself as an intense forward/backward asymmetry in the angular distribution of photoelectrons produced from randomly-oriented enantiomers by photoionization with circularly-polarized light (CPL). As a sensitive probe of both photoionization dynamics and of the chiral molecular potential, PECD attracts much interest especially with the recent performance of related experiments with visible and VUV laser sources. Here we report, by use of quasi-perfect CPL VUV synchrotron radiation and using a double imaging photoelectron/photoion coincidence (i2PEPICO) spectrometer, new and very accurate values of the corresponding asymmetries on showcase chiral isomers: camphor and fenchone. These data have additionally been normalized to the absolute enantiopurity of the sample as measured by a chromatographic technique. They can therefore be used as benchmarking data for new PECD experiments, as well as for theoretical models. In particular we found, especially for the outermost orbital of both molecules, a good agreement with CMS-X PECD modeling over the whole VUV range. We also report a spectacular sensitivity of PECD to isomerism for slow electrons, showing large and opposite asymmetries when comparing R-camphor to R-fenchone (respectively -10% and +16 % around 10 eV). In the course of this study, we could also assess the analytical potential of PECD. Indeed, the accuracy of the data we provide are such that limited departure from perfect enantiopurity in the sample we purchased could be detected and estimated in excellent agreement with the analysis performed in parallel via a chromatographic technique, establishing a new standard of accuracy, in the ±1 % range, for enantiomeric excess measurement via PECD. The i2PEPICO technique allows correlating PECD measurements to specific parent ion masses, which would allow its application to analysis of complex mixtures

Identification of the vibrational marker of tyrosine cation radical using ultrafast transient infrared spectroscopy of flavoprotein systems

Tryptophan and tyrosine radical intermediates play crucial roles in many biological charge transfer processes. Particularly in flavoprotein photochemistry, short-lived reaction intermediates can be studied by the complementary techniques of ultrafast visible and infrared spectroscopy. The spectral properties of tryptophan radical are well established, and the formation of neutral tyrosine radicals has been observed in many biological processes. However, only recently, the formation of a cation tyrosine radical was observed by transient visible spectroscopy in a few systems. Here, we assigned the infrared vibrational markers of the cationic and neutral tyrosine radical at 1483 and 1502 cm−1 (in deuterated buffer), respectively, in a variant of the bacterial methyl transferase TrmFO, and in the native glucose oxidase. In addition, we studied a mutant of AppABLUF blue-light sensor domain from Rhodobacter sphaeroides in which only a direct formation of the neutral radical was observed. Our studies highlight the exquisite sensitivity of transient infrared spectroscopy to low concentrations of specific radicals

Dynamique interne des flavoprotéines étudiée par spectroscopie femtoseconde

La nature utilise des réactions de transfert de charge (TdC) dans de nombreuses fonctions biologiquesfaisant intervenir des cofacteurs à activité redox, comme les flavines (FAD et FMN). Le TdC dans les protéines s’effectue souvent par la formation d'intermédiaires radicalaires. Les acides aminés tyrosine(TyrOH) et tryptophane sont impliqués comme intermédiaires majeurs. Les radicaux tryptophanyle ont été caractérisés auparavant dans leurs formes protoné et déprotoné. Cependant, les radicaux tyrosyles n'ont été caractérisés que dans la forme neutre et on pensait qu'ils étaient formés par extraction électronique et déprotonation. Les intermédiaires à courte durée de vie sont souvent difficiles à observer dans les réactions biochimiques, mais peuvent être peuplés s'ils sont formés photochimiquement par de courtes impulsions.Nous avons caractérisé des intermédiaires dans des réactions non-fonctionnelles de TdC dans des flavoprotéines en utilisant la spectroscopie femtoseconde de fluorescence et d'absorption. Des états excités et produits formés dans le type sauvage et des formes mutantes de la flavo-enzyme méthyltransférase TrmFO de Thermus thermophilus ont été étudiés. Dans le site actif de cette enzyme, une tyrosine (Tyr343) est empilée sur le cycle isoalloxazine de la FAD, et une cystéine (Cys51) peut former un adduit avec la FAD très fluorescente. Dans le mutant C51A, la fluorescence du FADox est fortement quenchée par transfert d'électrons de la Tyr343 dans ~1 ps. L'état produit résultant présente une caractéristique spectrale distincte avec une forte bande d'absorption à ~490 nm, encore jamais associée à aucune espèce radicalaire, qui a été attribuée pour la première fois au cation radical de la Tyr343 (TyrOH•+). L’état FAD•-TyrOH•+, est de très courte durée car il retombe par recombinaison de charge en ~3 ps.. Cette étude démontre que- malgré le très bas pKa de TyrOH•+ -le transfert d’électrons à partir de la tyrosine peut avoir lieu sans transfert concomitant de proton.De plus, des expériences de photosélection par polarisation ont permi d’estimer, l’orientation du moment dipolaire de la nouvelle transition entre FADox et TyrOH•+ dans le TrmFO C51A à 31°±5°. Ce résultat évalue l'orientation du moment dipolaire au sein du cycle phénolique. La découverte de directions distinctes pour la bande de transition de la flavine excitée et la transition à 490 nm confirme leur origine dans différentes entités moléculaires.Sur la base des résultats de TrmFO, nous avons réexaminé la photochimie de la flavoprotéine modèle glucose oxydase (GOX). Ddes résidus de tryptophane et de tyrosine sont situés proche du FAD et l'évolution du photoproduit à l'échelle picosecondes est plus complexe. Des phases de déclin de l'état excité avec des constantes de temps de 1 et ~4 ps ont été observées, ainsi que des phases pour l'évolution de l'état produit de ~4 ps, ~37 ps et une phase plus longue. Un modèle complet de la séparation et de recombinaison des charges dans GOX impliquant, des radicaux de tyrosine et de tryptophane, ainsi que des différents états redox du FAD a été décrit. Les résultats pour les phases de 4 ps et de 37 ps mettent en évidence l’implication du radical TyrOH•+, avec des caractéristiques semblables au C51A TrmFO. Ce résultat explique des caractéristiques énigmatiques connues et indique l'implication de TyrOH•+ dans divers systèmes protéiques.A ce jour, seul le radical tyrosyle déprotoné TyrO• a été identifié comme intermédiaire fonctionnel dans plusieurs systèmes. La visualisation d'un radical TyrOH•+ dans TrmFO C51A et GOX suggère sa formation intermédiaire en tant que précurseur de TyrO• dans des réactions biochimiques fonctionnelles.Enfin, dans TrmFO, la construction de variantes spécifiques par mutagénèse dirigée a été initiée pour étudier la flexibilité du site actif en utilisant la vitesse de TdC comme marqueur conformationnel. D'autres travaux sont nécessaires pour poursuivre cette voie.Nature employs charge transfer reactions in many biological functions. Redox-active cofactors like flavins (FAD and FMN) are often implicated in such reactions. Charge transfer in proteins often proceeds via formation of radical intermediates. The amino acid radicals of tyrosine (TyrOH) and tryptophan are thought to play important roles as intermediates in intra- and interprotein charge transfer reactions. Tryptophanyl radicals (both protonated cation and deprotonated neutral forms), had been characterized before. However, tyrosyl radicals had only been characterized in the neutral form, and were thought to be formed by concerted electron extraction and deprotonation of tyrosine. Short-lived intermediates are often difficult to observe in biochemical reactions, but may be populated when they can be photochemically formed using short light pulses.In this work, we have characterized intermediates in non-functional charge transfer reactions in flavoproteins using femtosecond time-resolved fluorescence and absorption spectroscopy. Excited states and product states formed in the wild type and mutant forms of the methyltransferase flavoenzyme TrmFO from Thermus thermophilus were investigated. In the TrmFO active site, a tyrosine (Tyr343), is closely stacked on the FAD isoalloxazine ring and a cysteine (Cys51) can form a highly fluorescent adduct with the FAD. In the mutant C51A, FADox fluorescence is strongly quenched by electron transfer from the Tyr343 in ~1ps. The resulting product state displayed a distinct spectral feature- a strong absorption band at ~490 nm unlike any previously characterized radical species. It was assigned to the radical cation of tyrosine (TyrOH•+) which had never been observed before. The FAD•-TyrOH•+ intermediate, is very short-lived as it decays in ~3ps, through charge recombination. As a general conclusion, despite the very low pKa of TyrOH•+, electron transfer from tyrosine can occur without concomitant proton transfer.Using polarization photoselection experiments, we estimated the dipole moment direction for this new transition. The resultant angle between the excited FADox transition and the probed TyrOH•+ transition in C51A TrmFO was 31º±5º. This result sets the orientation of the dipole moment of the transition in the molecular frame of the phenol ring. The finding of distinct directions for the excited FAD transition band and the 490 nm transition confirms their origin in different molecular entities.Following the results from TrmFO, we reinvestigated the photochemistry in the model flavoprotein glucose oxidase (GOX). Here, both tryptophan and tyrosine residues are located in the vicinity of FAD and the photoproduct evolution on the picosecond timescale is more complex. Distinct phases of excited state decay with time constants of 1ps and ~4ps were observed, as well as phases of ~4ps, ~37 ps and a longer-lives phase for product state evolution. Consequently, a comprehensive model for the involvement of radicals of tyrosine and tryptophan and, the different FAD redox states, in the light-induced charge separation and recombination in GOX was made. Partial involvement of the TyrOH•+ radical cation, spectrally similar to C51A TrmFO, was required for the 4 ps and 37 ps phases to account for the ensemble of data. This result explains previous enigmatic features and indicates the involvement of TyrOH•+ in a variety of protein systems.So far, only the deprotonated tyrosyl radical TyrO• had been observed as a functional intermediate in several systems. The visualization of protonated TyrOH•+ radical in TrmFO C51A and GOX suggests the possibility of its intermediate formation as a precursor of TyrO• in functional biochemical reactions.Finally, in TrmFO the construction of specific variants with site-directed mutagenesis was initiated to study active-site flexibility using electron transfer rates as conformational markers. Further experimental and modeling work is required to pursue this goal

Internal dynamics of flavoproteins studied by femtosecond spectroscopy

Nature employs charge transfer reactions in many biological functions. Redox-active cofactors like flavins (FAD and FMN) are often implicated in such reactions. Charge transfer in proteins often proceeds via formation of radical intermediates. The amino acid radicals of tyrosine (TyrOH) and tryptophan are thought to play important roles as intermediates in intra- and interprotein charge transfer reactions. Tryptophanyl radicals (both protonated cation and deprotonated neutral forms), had been characterized before. However, tyrosyl radicals had only been characterized in the neutral form, and were thought to be formed by concerted electron extraction and deprotonation of tyrosine. Short-lived intermediates are often difficult to observe in biochemical reactions, but may be populated when they can be photochemically formed using short light pulses.In this work, we have characterized intermediates in non-functional charge transfer reactions in flavoproteins using femtosecond time-resolved fluorescence and absorption spectroscopy. Excited states and product states formed in the wild type and mutant forms of the methyltransferase flavoenzyme TrmFO from Thermus thermophilus were investigated. In the TrmFO active site, a tyrosine (Tyr343), is closely stacked on the FAD isoalloxazine ring and a cysteine (Cys51) can form a highly fluorescent adduct with the FAD. In the mutant C51A, FADox fluorescence is strongly quenched by electron transfer from the Tyr343 in ~1ps. The resulting product state displayed a distinct spectral feature- a strong absorption band at ~490 nm unlike any previously characterized radical species. It was assigned to the radical cation of tyrosine (TyrOH•+) which had never been observed before. The FAD•-TyrOH•+ intermediate, is very short-lived as it decays in ~3ps, through charge recombination. As a general conclusion, despite the very low pKa of TyrOH•+, electron transfer from tyrosine can occur without concomitant proton transfer.Using polarization photoselection experiments, we estimated the dipole moment direction for this new transition. The resultant angle between the excited FADox transition and the probed TyrOH•+ transition in C51A TrmFO was 31º±5º. This result sets the orientation of the dipole moment of the transition in the molecular frame of the phenol ring. The finding of distinct directions for the excited FAD transition band and the 490 nm transition confirms their origin in different molecular entities.Following the results from TrmFO, we reinvestigated the photochemistry in the model flavoprotein glucose oxidase (GOX). Here, both tryptophan and tyrosine residues are located in the vicinity of FAD and the photoproduct evolution on the picosecond timescale is more complex. Distinct phases of excited state decay with time constants of 1ps and ~4ps were observed, as well as phases of ~4ps, ~37 ps and a longer-lives phase for product state evolution. Consequently, a comprehensive model for the involvement of radicals of tyrosine and tryptophan and, the different FAD redox states, in the light-induced charge separation and recombination in GOX was made. Partial involvement of the TyrOH•+ radical cation, spectrally similar to C51A TrmFO, was required for the 4 ps and 37 ps phases to account for the ensemble of data. This result explains previous enigmatic features and indicates the involvement of TyrOH•+ in a variety of protein systems.So far, only the deprotonated tyrosyl radical TyrO• had been observed as a functional intermediate in several systems. The visualization of protonated TyrOH•+ radical in TrmFO C51A and GOX suggests the possibility of its intermediate formation as a precursor of TyrO• in functional biochemical reactions.Finally, in TrmFO the construction of specific variants with site-directed mutagenesis was initiated to study active-site flexibility using electron transfer rates as conformational markers. Further experimental and modeling work is required to pursue this goal.La nature utilise des réactions de transfert de charge (TdC) dans de nombreuses fonctions biologiquesfaisant intervenir des cofacteurs à activité redox, comme les flavines (FAD et FMN). Le TdC dans les protéines s’effectue souvent par la formation d'intermédiaires radicalaires. Les acides aminés tyrosine(TyrOH) et tryptophane sont impliqués comme intermédiaires majeurs. Les radicaux tryptophanyle ont été caractérisés auparavant dans leurs formes protoné et déprotoné. Cependant, les radicaux tyrosyles n'ont été caractérisés que dans la forme neutre et on pensait qu'ils étaient formés par extraction électronique et déprotonation. Les intermédiaires à courte durée de vie sont souvent difficiles à observer dans les réactions biochimiques, mais peuvent être peuplés s'ils sont formés photochimiquement par de courtes impulsions.Nous avons caractérisé des intermédiaires dans des réactions non-fonctionnelles de TdC dans des flavoprotéines en utilisant la spectroscopie femtoseconde de fluorescence et d'absorption. Des états excités et produits formés dans le type sauvage et des formes mutantes de la flavo-enzyme méthyltransférase TrmFO de Thermus thermophilus ont été étudiés. Dans le site actif de cette enzyme, une tyrosine (Tyr343) est empilée sur le cycle isoalloxazine de la FAD, et une cystéine (Cys51) peut former un adduit avec la FAD très fluorescente. Dans le mutant C51A, la fluorescence du FADox est fortement quenchée par transfert d'électrons de la Tyr343 dans ~1 ps. L'état produit résultant présente une caractéristique spectrale distincte avec une forte bande d'absorption à ~490 nm, encore jamais associée à aucune espèce radicalaire, qui a été attribuée pour la première fois au cation radical de la Tyr343 (TyrOH•+). L’état FAD•-TyrOH•+, est de très courte durée car il retombe par recombinaison de charge en ~3 ps.. Cette étude démontre que- malgré le très bas pKa de TyrOH•+ -le transfert d’électrons à partir de la tyrosine peut avoir lieu sans transfert concomitant de proton.De plus, des expériences de photosélection par polarisation ont permi d’estimer, l’orientation du moment dipolaire de la nouvelle transition entre FADox et TyrOH•+ dans le TrmFO C51A à 31°±5°. Ce résultat évalue l'orientation du moment dipolaire au sein du cycle phénolique. La découverte de directions distinctes pour la bande de transition de la flavine excitée et la transition à 490 nm confirme leur origine dans différentes entités moléculaires.Sur la base des résultats de TrmFO, nous avons réexaminé la photochimie de la flavoprotéine modèle glucose oxydase (GOX). Ddes résidus de tryptophane et de tyrosine sont situés proche du FAD et l'évolution du photoproduit à l'échelle picosecondes est plus complexe. Des phases de déclin de l'état excité avec des constantes de temps de 1 et ~4 ps ont été observées, ainsi que des phases pour l'évolution de l'état produit de ~4 ps, ~37 ps et une phase plus longue. Un modèle complet de la séparation et de recombinaison des charges dans GOX impliquant, des radicaux de tyrosine et de tryptophane, ainsi que des différents états redox du FAD a été décrit. Les résultats pour les phases de 4 ps et de 37 ps mettent en évidence l’implication du radical TyrOH•+, avec des caractéristiques semblables au C51A TrmFO. Ce résultat explique des caractéristiques énigmatiques connues et indique l'implication de TyrOH•+ dans divers systèmes protéiques.A ce jour, seul le radical tyrosyle déprotoné TyrO• a été identifié comme intermédiaire fonctionnel dans plusieurs systèmes. La visualisation d'un radical TyrOH•+ dans TrmFO C51A et GOX suggère sa formation intermédiaire en tant que précurseur de TyrO• dans des réactions biochimiques fonctionnelles.Enfin, dans TrmFO, la construction de variantes spécifiques par mutagénèse dirigée a été initiée pour étudier la flexibilité du site actif en utilisant la vitesse de TdC comme marqueur conformationnel. D'autres travaux sont nécessaires pour poursuivre cette voie

Short‐Lived Radical Intermediates in the Photochemistry of Glucose Oxidase

International audienc

Identification of the TyrOH •+ Radical Cation in the Flavoenzyme TrmFO

International audienceTyrosine (TyrOH) and tryptophan radicals play important roles as intermediates in biochemical charge-transfer reactions. Tryptophanyl radicals have been observed both in their protonated cation form and in their unprotonated neutral form, but to date, tyrosyl radicals have only been observed in their unprotonated form. With a genetically modified form of the flavoenzyme TrmFO as a suitable model system and using ultrafast fluorescence and absorption spectroscopy, we characterize its protonated precursor TyrOH•+, and we show this species to have a distinct visible absorption band and a transition moment that we suggest to lie close to the phenol symmetry axis. TyrOH•+ is formed in ∼1 ps by electron transfer to excited flavin and decays in ∼3 ps by charge recombination. These findings imply that TyrOH oxidation does not necessarily induce its concerted deprotonation. Our results will allow disentangling of photoproduct states in flavoproteins in often-encountered complex situations and more generally are important for understanding redox chains relying on tyrosyl intermediates

Photochemical processes in flavo-enzymes as a probe for active site dynamics: TrmFO of Thermus thermophilus

International audienceQuenching of flavin fluorescence by electron transfer from neighboring aromatic residues is ubiquitous in flavoproteins. Apart from constituting a functional process in specific light-active systems, time-resolved spectral characterization of the process can more generally be employed as a probe for the active site configuration and dynamics. In the C51A variant of the bacterial RNA-transforming flavoenzyme TrmFO from the bacterium Thermus thermophilus, fluorescence is very short-lived (~ 1 ps), and close-by Tyr343 is known to act as the main quencher, as confirmed here by the very similar dynamics observed in protein variants with modified other potential quenchers, Trp283 and Trp214. When Tyr343 is modified to redox-inactive phenylalanine, slower and highly multiphasic kinetics are observed on the picosecond-nanosecond timescale, reflecting heterogeneous electron donor–acceptor configurations. We demonstrate that Trp214, which is located on a potentially functional flexible loop, contributes to electron donor quenching in this variant. Contrasting with observations in other nucleic acid-transforming enzymes, these kinetics are strikingly temperature-independent. This indicates (a) near-barrierless electron transfer reactions and (b) no exchange between different configurations on the timescale up to at least 2 ns, despite the presumed flexibility of Trp214. Results of extensive molecular dynamics simulations are presented to explain this unexpected finding in terms of slowly exchanging protein configuration