Apport des structures cristallographiques à la compréhension du mécanisme d'inhibition des cholinestérases par les neurotoxiques organophosphorés

1Avant ProposLes cholinestérases sont des sérines hydrolases spécialisées dans l'hydrolyse des esters decholine, en particulier, le neurotransmetteur acétylcholine. Le rôle principal del’acétylcholinestérase humaine (hAChE) est la terminaison de la transmission de l'impulsionnerveuse au niveau des synapses cholinergiques par hydrolyse de l'acétylcholine en acideacétique et choline. Les cholinestérases sont fascinantes par leur efficacité catalytique (108-109 M-1.min-1) et par la subtilité des mécanismes catalytiques et changementsconformationnels associés. Malgré des décennies de recherches, bien des aspects de leurfonctionnement restent incompris. Elles constituent un sujet d'étude riche, sans cesserenouvelé par la diversité des approches nécessaires à la compréhension de leurs différentesfacettes.Dès ma thèse, mes activités de recherche ont été centrées sur l'étude des relationsstructure-activité des cholinestérases et plus particulièrement de la butyrylcholinestérasehumaine (hBChE). La hBChE est une enzyme très proche de l'hAChE (52% d'identité), maisdiffère nettement par sa spécificité de substrat et sa sensibilité aux inhibiteurs. Elle estabondamment présente dans le plasma et dans de nombreux tissus chez les vertébrés. Maiscontrairement à l'AChE, aucun rôle cholinergique ni aucun autre rôle physiologique n'a pu luiêtre attribué. C'est d'ailleurs une enzyme qui n'est pas vitale comme le démontre la viabilitédes individus nullizygotes. Elle peut éventuellement jouer le rôle de suppléant de la hAChEen cas de déficience de cette dernière. Cependant l'importance de la hBChE est capitale d'unpoint de vue toxicologique et pharmacologique car elle est impliquée dans la dégradation denombreux principes actifs, poisons ou médicaments, par exemple la cocaïne, lasuccinylcholine.En raison de sa fonction essentielle dans le système nerveux, la hAChE est la cible d'unvaste répertoire de médicaments et de poisons, naturels ou synthétiques, notamment descomposés organophosphorés (OP) comme les pesticides ou encore les agents neurotoxiquesde guerre. L'emploi d'OP a, par le passé, entrainé des dommages importants, tant lors deconflits militaires comme dans la guerre Iran-Irak (1980-1988) ou la guerre du Golfe (1991)que dans les milieux civils comme l’attentat dans le métro de Tokyo (1995). L'usage de sarinen août 2013 dans le conflit syrien a rappelé que dans le contexte militaire et politique actuel,les armes chimiques de guerre restent une menace concrète et sérieuse, et ce malgré laConvention d’Interdiction des Armes chimiques signée en 1993 et ratifiée par 181 états.2Parallèlement, le contexte socio-économique tend vers une accélération des moyens deproduction, notamment dans le domaine agricole. L’utilisation de pesticidesorganophosphorés, bien que réglementée, provoque des intoxications accidentelles nonnégligeables. Surtout, l'ingestion de pesticides est le premier moyen de suicide dans le monde,en particulier en Asie rurale (Hvistendahl 2013), et représente 1/3 des suicides annuels pourplus de 200 000 décès (Eddleston 2008).Comme la hAChE, la hBChE est inhibée par les carbamates et les OPs sans toutefois desymptômes associées. C'est un excellent bioépurateur des OPs, une forme injectable dehBChE étant en cours de développement pour la protection contre l'intoxication par les OPs.Les moyens thérapeutiques actuels étant assez peu efficaces, leur développement reste unepriorité et passe par la connaissance détaillée des mécanismes d'inhibition et de résistance auxtraitements. C'est dans ce contexte que j'ai développé mes travaux de recherche depuis masoutenance de thèse en 1999.Je commencerai ce mémoire par une introduction non exhaustive sur la structure généraledes cholinestérases, l'inhibition par les pesticides et neurotoxiques organophosphorés et lescontre-mesures médicales des armes chimiques. Dans une seconde partie, je présenterai lecheminement ayant conduit à la résolution de la structure de la butyrylcholinestérase humaineet les principaux enseignements obtenus. Puis je montrerai l'apport des structures decholinestérases phosphylées sur la connaissance détaillée des mécanismes d'inhibition et devieillissement. Et enfin je présenterai mes travaux actuels et leurs perspectives sur ledéveloppement de nouvelles contremesures des toxiques de guerre organophopshorés

Interaction of prion protein with acetylcholinesterase: potential pathobiological implications in prion diseases

The prion protein (PrP) binds to various molecular partners, but little is known about their potential impact on the pathogenesis of prion diseases. Here, we show that PrP can interact in vitro with acetylcholinesterase (AChE), a key protein of the cholinergic system in neural and non-neural tissues. This heterologous association induced aggregation of monomeric PrP and modified the structural properties of PrP amyloid fibrils. Following its recruitment into PrP fibrils, AChE loses its enzymatic activity and enhances PrP-mediated cytotoxicity. Using several truncated PrP variants and specific tight-binding AChE inhibitors (AChEis), we then demonstrate that the PrP-AChE interaction requires two mutually exclusive sub-sites in PrP N-terminal domain and an aromatic-rich region at the entrance of AChE active center gorge. We show that AChEis that target this site impair PrP-AChE complex formation and also limit the accumulation of pathological prion protein (PrPSc) in prion-infected cell cultures. Furthermore, reduction of AChE levels in prion-infected heterozygous AChE knock-out mice leads to slightly but significantly prolonged incubation time. Finally, we found that AChE levels were altered in prion-infected cells and tissues, suggesting that AChE might be directly associated with abnormal PrP. Our results indicate that AChE deserves consideration as a new actor in expanding pathologically relevant PrP morphotypes and as a therapeutic target

Rapid discovery and crystallography study of highly potent and selective butylcholinesterase inhibitors based on oxime-containing libraries and conformational restriction strategies

22 p.-9 fig.-8 tab.Butyrylcholinesterase is regarded as a promising drug target in advanced Alzheimer’s disease. In order to identify highly selective and potent BuChE inhibitors, a 53-membered compound library was constructed via the oxime-based tethering approach based on microscale synthesis. Although A2Q17 and A3Q12 exhibited higher BuChE selectivity versus acetylcholinesterase, the inhibitory activities were unsatisfactory and A3Q12 did not inhibit Aβ1-42 peptide self-induced aggregation. With A2Q17 and A3Q12 as leads, a novel series of tacrine derivatives with nitrogen-containing heterocycles were designed based on conformation restriction strategy. The results demonstrated that 39 (IC50 = 3.49 nM) and 43 (IC50 = 7.44 nM) yielded much improved hBuChE inhibitory activity compared to the lead A3Q12 (IC50 = 63 nM). Besides, the selectivity indexes (SI = AChE IC50 / BChE IC50) of 39 (SI = 33) and 43 (SI = 20) were also higher than A3Q12 (SI = 14). The results of the kinetic study showed that 39 and 43 exhibited a mixed-type inhibition against eqBuChE with respective Ki values of 1.715 nM and 0.781 nM. And 39 and 43 could inhibit Aβ1-42 peptide self-induced aggregation into fibril. X-ray crystallography structures of 39 or 43 complexes with BuChE revealed the molecular basis for their high potency. Thus, 39 and 43 are deserve for further study to develop potential drug candidates for the treatment of Alzheimer’s disease.We gratefully acknowledge financial support from the Shandong Provincial Key Research and Development Project (No. 2019JZZY021011), Science Foundation for Outstanding Young Scholars of Shandong Province (ZR2020JQ31), Foreign Cultural and Educational Experts Project (GXL20200015001), Qilu Young Scholars Program of Shandong University, Distinguished Young and Middle-aged Scholar of Shandong University, the Taishan Scholar Program at Shandong Province, and MINECO (Grants SAF2016-76693-R to A.M), F.C., F.N. and X.B. were supported by the French Ministry of Armed Forces (Direction Générale de l'Armement and Service de Santé des Armées, NBC-5-C-4210). Authors would like to thank the ESRF for long-term beamtime access (MX2329 IBS BAG).Peer reviewe

Fine-Tuning the Biological Profile of Multitarget Mitochondriotropic Antioxidants for Neurodegenerative Diseases

Neurotransmitter depletion and mitochondrial dysfunction are among the multiple pathological events that lead to neurodegeneration. Following our previous studies related with the development of multitarget mitochondriotropic antioxidants, this study aims to evaluate whether the π-system extension on the chemical scaffolds of AntiOXCIN2 and AntiOXCIN3 affects their bioactivity and safety profiles. After the synthesis of four triphenylphosphonium (TPP+) conjugates (compounds 2-5), we evaluated their antioxidant properties and their effect on neurotransmitter-metabolizing enzymes. All compounds were potent equine butyrylcholinesterase (eqBChE) and moderate electric eel acetylcholinesterase (eeAChE) inhibitors, with catechols 4 and 5 presenting lower IC50 values than AntiOXCIN2 and AntiOXCIN3, respectively. However, differences in the inhibition potency and selectivity of compounds 2-5 towards non-human and human cholinesterases (ChEs) were observed. Co-crystallization studies with compounds 2-5 in complex with human ChEs (hChEs) showed that these compounds exhibit different binging modes to hAChE and hBChE. Unlike AntiOXCINs, compounds 2-5 displayed moderate human monoamine oxidase (hMAO) inhibitory activity. Moreover, compounds 4 and 5 presented higher ORAC-FL indexes and lower oxidation potential values than the corresponding AntiOXCINs. Catechols 4 and 5 exhibited broader safety windows in differentiated neuroblastoma cells than benzodioxole derivatives 2 and 3. Compound 4 is highlighted as a safe mitochondria-targeted antioxidant with dual ChE/MAO inhibitory activity. Overall, this work is a contribution for the development of dual therapeutic agents addressing both mitochondrial oxidative stress and neurotransmitter depletion

Etudes biochimiques et structurales d'enzymes interagissant avec les toxiques organophosphorés

Les enzymes réagissant avec les organophosphorés (OP) ont le potentiel de constituer les principes actifs des futures contre-mesures médicales destinées à protéger et à traiter l'homme contre l'agression OP. Les travaux réalisés au cours de cette thèse visent à 1) déterminer les facteurs permettant l'amélioration des propriétés des phosphotriesterases bactériennes, en vue de leur utilisation comme bioépurateurs catalytiques des OP; 2) approfondir les connaissances sur le mécanisme d'inhibition et de vieillissement des cholinestérases (ChEs), en particulier la butyrylcholinestérase humaine qui présente l'intérêt d'être le premier bioépurateur stoechiométrique proposé comme alternative au prétraitement actuel de l'intoxication organophosphorée.La phosphotriestérase bactérienne (PTE) hydrolyse la liaison phosphoester des OP. L'avantage de la PTE par rapport aux ChE s, est son activité catalytique élevée vis-à-vis des OP. C'est un bon candidat pour la décontamination et la protection cutanée. Cependant les difficultés d'expression et de production de l'enzyme entravent son développement. L'étude présentée dans cette thèse, permet de réévaluer les propriétés catalytiques de l'enzyme exprimée en présence de différents cations métalliques et une meilleure compréhension des problèmes d'expression rencontrés avec la PTE. PEGylée ou encapsulée dans des liposomes, la PTE pourrait être administrée à l 'homme et améliorer considérablement l'efficacité du traitement des intoxications OP.Les ChEs sont les principales cibles physiologiques des OP. Malgré les progrès réalisés ces vingt dernières années, la prophylaxie et le traitement de l'intoxication par les OPs neurotoxiques restent imparfaits. En particulier, les réactivateurs (oximes) utilisés comme antidotes contre l'intoxication organophosphorée, sont peu efficaces sur les cholinestérases inhibées par le tabun.Les études biochimiques et cristallographiques réalisées dans cette thèse montrent que cette résistance est principalement due à des facteurs électroniques propres au tabun et à des interactions particulières avec les résidus du site actif des ChEs. De plus, nous avons établi que la réaction secondaire de vieillissement correspondait à une O-déalkylation du groupement ethoxy de l'adduit phosphoramidate lié à la sérine catalytique, et non pas à une déamination, comme proposé jusqu'à présent. La déalkylation conduit à la formation d'un pont salin entre l'histidine protonée du site catalytique et l'oxyanion du composé OP déalkylé.À ce stade, la régénération de l'activité par réactivation par les oximes n'est plus possible.La connaissance du mécanisme d'inhibition et de déalkylation de la BChE et l'AChE phosphorylées par le tabun et des phosphoramidates analogues du tabun, en particulier la résolution de la structure cristallographique des conjugués non vieillis et vieillis, sont une base structurale essentielle à la conception de nouveaux réactivateurs plus efficaces. Les données structurales obtenues vont aussi permettre d'optimiser par modélisation moléculaire, des mutants de ChEs capables de se régénérer spontanément et/ou plus facilement réactivables par les oximes. De tels mutants pourraient alors être utilisables comme bioépurateurs pseudo-catalytiques.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Evolution of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in the vertebrates: an atypical butyrylcholinesterase from the Medaka Oryzias latipes

Acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) are thought to be the result of a gene duplication event early in vertebrate evolution. To learn more about the evolution of these enzymes, we expressed in vitro, characterized, and modeled a recombinant cholinesterase (ChE) from a teleost, the medaka Oryzias latipes. In addition to AChE, O. latipes has a ChE that is different from either vertebrate AChE or BChE, which we are classifying as an atypical BChE, and which may resemble a transitional form between the two. Of the fourteen aromatic amino acids in the catalytic gorge of vertebrate AChE, ten are conserved in the atypical BChE of O. latipes; by contrast, only eight are conserved in vertebrate BChE. Notably, the atypical BChE has one phenylalanine in its acyl pocket, while AChE has two and BChE none. These substitutions could account for the intermediate nature of this atypical BChE. Molecular modeling supports this proposal. The atypical BChE hydrolyzes acetylthiocholine (ATCh) and propionylthiocholine (PTCh) preferentially but butyrylthiocholine (BTCh) to a considerable extent, which is different from the substrate specificity of AChE or BChE. The enzyme shows substrate inhibition with the two smaller substrates but not with the larger substrate BTCh. In comparison, AChE exhibits substrate inhibition, while BChE does not, but may instead show substrate activation. The atypical BChE from O. latipes also shows a mixed pattern of inhibition. It is effectively inhibited by physostigmine, typical of all ChEs. However, although the atypical BChE is efficiently inhibited by the BChE-specific inhibitor ethopropazine, it is not by another BChE inhibitor, iso-OMPA, no

Progress in the development of enzyme-based nerve agent bioscavengers

International audienceAcetylcholinesterase is the physiological target for acute toxicity of nerve agents. Attempts to protect acetylcholinesterase from phosphylation by nerve agents, is currently achieved by reversible inhibitors that transiently mask the enzyme active site. This approach either protects only peripheral acetylcholinesterase or may cause side effects. Thus, an alternative strategy consists in scavenging nerve agents in the bloodstream before they can reach acetylcholinesterase. Pre- or post-exposure administration of bioscavengers, enzymes that neutralize and detoxify organophosphorus molecules, is one of the major developments of new medical counter-measures. These enzymes act either as stoichiometric or catalytic bioscavengers. Human butyrylcholinesterase is the leading stoichiometric bioscavenger. Current efforts are devoted to its mass production with care to pharmacokinetic properties of the final product for extended lifetime. Development of specific reactivators of phosphylated butyrylcholinesterase, or variants with spontaneous reactivation activity is also envisioned for rapid in situ regeneration of the scavenger. Human paraoxonase 1 is the leading catalytic bioscavenger under development. Research efforts focus on improving its catalytic efficiency toward the most toxic isomers of nerve agents, by means of directed evolution-based strategies. Human prolidase appears to be another promising human enzyme. Other non-human efficient enzymes like bacterial phosphotriesterases or squid diisopropylfluorophosphatase are also considered though their intrinsic immunogenic properties remain challenging for use in humans. Encapsulation, PEGylation and other modifications are possible solutions to address this problem as well as that of their limited lifetime. Finally, gene therapy for in situ generation and delivery of bioscavengers is for the far future, but its proof of concept has been established

Respiratory failure triggered by cholinesterase inhibitors may involve activation of a reflex sensory pathway by acetylcholine spillover

International audienceRespiration failure during exposure by cholinesterase inhibitors has been widely assumed to be due to inhibition of cholinesterase in the brain. Using a double chamber plethysmograph to measure various respiratory parameters , we observed long "end inspiratory pauses" (EIP) during most exposure that depressed breathing. Surprisingly, Colq KO mice that have a normal level of acetylcholinesterase (AChE) in the brain but a severe deficit in muscles and other peripheral tissues do not pause the breathing by long EIP. In mice, long EIP can be triggered by a nasal irritant. Eucalyptol, an agonist of cold receptor (TRPM8) acting on afferent sensory neurons and known to reduce the EIP triggered by such irritants, strongly reduced the EIP induced by cholinesterase inhibitor. These results suggest that acetylcholine (ACh) spillover from the neuromuscular junction, which is unchanged in Colq KO mice, may activate afferent sensory systems and trigger sensory reflexes, as reversed by eucalyptol. Indeed, the role of AChE at the cholinergic synapses is not only to accurately control the synaptic transmission but also to prevent the spillover of ACh. In the peripheral tissues, the ACh flood induced by cho-linesterase inhibition may be very toxic due to interaction with non-neuronal cells that use ACh at low levels to communicate with afferent sensory neurons