Étude des interactions entre infection à ostreid herpesvirus 1, immunité, autophagie et pesticides chez l’huître creuse, Crassostrea gigas

The thesis work is part of the very current issue on mass mortality outbreaks affecting Pacific oyster, C. gigas, spat and juveniles and questions about the involvement of pesticides in this phenomenon. The first part of this thesis was devoted to study the effects of pesticides on hemocyte parameters in the Pacific oyster (in vitro and in vivo). The immunomodulator effect of selected pesticides (alone or in mixture) has been explored principally through flow cytometry. The second part concerned the study of the effects of a pesticides mixture on OsHV-1 itself. No direct effects have been reported on the viral particles in presence of the pollutants. Moreover, pesticide effects on Pacific oysters were also explored through experimental pathology assays after treatment of animals with a polluant mixture. Results showed that pesticide treated oysters appeared more susceptible to the viral infection in experimental conditions. The third part concerned the study of autophagy in the Pacific oyster, C. gigas. The publication of the complete genome in 2012 has opened up new possibilities for the study of innate immunity in this species. The study of autophagy for the first time in oysters consisted in a first step in the in silico search for genes involved in this pathway and the corresponding proteins by Western blotting. Then, the role of this important process in innate immunity has been explored through reproduction infections tests with or without modulators of autophagy. Results showed that autophagy appeared as involved in defence mechanisms against viral and bacterial infection in Pacific oysters.Le travail de thèse s’inscrit dans la problématique très actuelle des mortalités massives de naissain et de juvéniles d’huîtres creuses, C. gigas, et des questionnements autour de l’implication des pesticides dans ce phénomène. La première partie de la thèse a été consacrée à l’étude des effets de pesticides sur les capacités hémocytaires de l’huître creuse (in vitro et in vivo). L’effet immuno-modulateur des xénobiotiques sélectionnés (seul ou en mélange) a été exploré principalement au travers de la cytométrie en flux. La deuxième partie de la thèse a concerné l’étude des effets d’un mélange de pesticides sélectionnés sur le virus OsHV-1 et l’infection qu’il induit chez l’huître creuse. Les effets des pesticides sur le virus lui-même ont été évalués. Les expériences réalisées n'ont pas permis de mettre en évidence, dans les conditions testées, de dégradation des particules virales en présence des polluants. D’autre part, leurs effets sur les huîtres elles-mêmes ont été explorés après traitement des animaux avec un mélange de pesticides lors d’essais de pathologie expérimentale. Il a ainsi pu être montré que des huîtres préalablement contaminées par un mélange de pesticides à des concentrations retrouvées dans l’environnement semblaient être plus sensibles à l’infection virale. La troisième partie de la thèse a concerné l’étude de l’autophagie chez l’huître creuse, C. gigas. La publication du génome complet de cette espèce en 2012 a ouvert de nouvelles possibilités pour étudier l'immunité innée. L’étude de l’autophagie réalisée pour la première fois chez l’huître creuse a consisté lors d’une première étape en la recherche in silico de gènes impliqués dans cette voie et des protéines correspondantes par western blotting. Puis, le rôle de ce processus important dans l’immunité innée a été exploré au travers d’essais de reproduction d’infections en présence ou non de modulateurs de l’autophagie. Les résultats obtenus semblent montrer que l’autophagie soit un processus important pouvant être impliqué dans les capacités de défense de l’huître creuse vis-à-vis d’infections virales et bactériennes

Autophagy plays an important role in protecting Pacific oysters from OsHV-1 and Vibrio aestuarianus infections.

Recent mass mortality outbreaks around the world in Pacific oysters, Crassostrea gigas, have seriously affected the aquaculture economy. Although the causes for these mortality outbreaks appear complex, infectious agents are involved. Two pathogens are associated with mass mortality outbreaks, the virus ostreid herpesvirus 1 (OsHV-1) and the bacterium Vibrio aestuarianus. Here we describe the interactions between these 2 pathogens and autophagy, a conserved intracellular pathway playing a key role in innate immunity. We show for the first time that autophagy pathway is present and functional in Pacific oysters and plays an important role to protect animals from infections. This study contributes to better understand the innate immune system of Pacific oysters.This work was partially funded through the EU project Bivalife (FP7 KBBE, contract n 266157), the Poitou Charentes Region and DPMA (Direction des p^eches maritimes et de l’aquaculture, AESTU project). David Rubinsztein is aWellcome Trust Prinicipal Research Fellow.This is the final published version. It first appeared at http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15548627.2015.1017188

Experimental infection of Pacific oyster Crassostrea gigas spat by ostreid herpesvirus 1: demonstration of oyster spat susceptibility

In 2008 and 2009, acute mortalities occurred in France among Pacific cupped oyster, Crassostrea gigas, spat. Different hypothesis including the implication of environmental factors, toxic algae and/or pathogens have been explored. Diagnostic tests indicated that OsHV-1 including a particular genotype, termed OsHV-1 μVar, was detected in most of samples and especially in moribund oysters with the highlighting of virus particles looking like herpes viruses by TEM examination. In this study, an experimental protocol to reproduce OsHV-1 infection in laboratory conditions was developed. This protocol was based on the intramuscular injection of filtered (0.22 μm) tissue homogenates prepared from naturally OsHV-1 infected spat collected on French coasts during mortality outbreaks in 2008. Results of the experimental trials showed that mortalities were induced after injection. Moreover, filtered tissue homogenates induced mortalities whereas the same tissue homogenates exposed to an ultraviolet (UV) treatment did not induce any mortality suggesting that oyster spat mortalities require the presence of a UV sensitive agent. Furthermore, analysis of injected oyster spat revealed the detection of high amounts of OsHV-1 DNA by real-time quantitative PCR. Finally, TEM analysis demonstrated the presence of herpes virus particles. The developed protocol allowed to maintain sources of infective virus which can be useful for the development of further studies concerning the transmission and the development of OsHV-1 infection

The homing flight method to assess the effect of sublethal doses of plant protection products on the honey bee in field conditions: results of the ring tests

The evaluation of the potential effects of plants protection products on honeybee behavior is considered as part of the risk assessment according to Regulation (EC) No 1107/2009 and the EFSA Guidance document (EFSA 2013). But no standardized and validated method is still available. With current revisions of plant protection product risk assessment on the honeybee, a European ring test is conducted since 2015 with 11 voluntary laboratories to test a methodology assessing the effects of sublethal doses of a plant protection product administered in controlled conditions on the homing capacity of forager bees in the field. Homing success is measured by monitoring free-ranging honey bees with radio-frequency identification (RFID) tagging technology

Study of interactions between infection Ostreid herpesvirus 1, immunity, autophagy and pesticides in the Pacific oyster, Crassostrea gigas

Le travail de thèse s’inscrit dans la problématique très actuelle des mortalités massives de naissain et de juvéniles d’huîtres creuses, C. gigas, et des questionnements autour de l’implication des pesticides dans ce phénomène. La première partie de la thèse a été consacrée à l’étude des effets de pesticides sur les capacités hémocytaires de l’huître creuse (in vitro et in vivo). L’effet immuno-modulateur des xénobiotiques sélectionnés (seul ou en mélange) a été exploré principalement au travers de la cytométrie en flux. La deuxième partie de la thèse a concerné l’étude des effets d’un mélange de pesticides sélectionnés sur le virus OsHV-1 et l’infection qu’il induit chez l’huître creuse. Les effets des pesticides sur le virus lui-même ont été évalués. Les expériences réalisées n'ont pas permis de mettre en évidence, dans les conditions testées, de dégradation des particules virales en présence des polluants. D’autre part, leurs effets sur les huîtres elles-mêmes ont été explorés après traitement des animaux avec un mélange de pesticides lors d’essais de pathologie expérimentale. Il a ainsi pu être montré que des huîtres préalablement contaminées par un mélange de pesticides à des concentrations retrouvées dans l’environnement semblaient être plus sensibles à l’infection virale. La troisième partie de la thèse a concerné l’étude de l’autophagie chez l’huître creuse, C. gigas. La publication du génome complet de cette espèce en 2012 a ouvert de nouvelles possibilités pour étudier l'immunité innée. L’étude de l’autophagie réalisée pour la première fois chez l’huître creuse a consisté lors d’une première étape en la recherche in silico de gènes impliqués dans cette voie et des protéines correspondantes par western blotting. Puis, le rôle de ce processus important dans l’immunité innée a été exploré au travers d’essais de reproduction d’infections en présence ou non de modulateurs de l’autophagie. Les résultats obtenus semblent montrer que l’autophagie soit un processus important pouvant être impliqué dans les capacités de défense de l’huître creuse vis-à-vis d’infections virales et bactériennes.The thesis work is part of the very current issue on mass mortality outbreaks affecting Pacific oyster, C. gigas, spat and juveniles and questions about the involvement of pesticides in this phenomenon. The first part of this thesis was devoted to study the effects of pesticides on hemocyte parameters in the Pacific oyster (in vitro and in vivo). The immunomodulator effect of selected pesticides (alone or in mixture) has been explored principally through flow cytometry. The second part concerned the study of the effects of a pesticides mixture on OsHV-1 itself. No direct effects have been reported on the viral particles in presence of the pollutants. Moreover, pesticide effects on Pacific oysters were also explored through experimental pathology assays after treatment of animals with a polluant mixture. Results showed that pesticide treated oysters appeared more susceptible to the viral infection in experimental conditions. The third part concerned the study of autophagy in the Pacific oyster, C. gigas. The publication of the complete genome in 2012 has opened up new possibilities for the study of innate immunity in this species. The study of autophagy for the first time in oysters consisted in a first step in the in silico search for genes involved in this pathway and the corresponding proteins by Western blotting. Then, the role of this important process in innate immunity has been explored through reproduction infections tests with or without modulators of autophagy. Results showed that autophagy appeared as involved in defence mechanisms against viral and bacterial infection in Pacific oysters

Etude des effets des pesticides sur la sensibilité de l\u27huile creuse (carrostreas gigas) au virus OsHV1 : Mécanismes de défense et développement de l\u27infection

Les effets d\u27un mélange de pesticides représentatif des eaux des bassins ostréicoles à des concentrations proches de celles retrouvées dans l\u27environnement, ont été étudiées pour déterminer si ce mélange pouvait affecter le niveau de sensibilité des huîtres creuses vis-à-vis de l\u27infection à OsHV1

Modulation of the β3 adrenergic receptor by the protein arginine methyltransferase 5

La nature et la régulation des récepteurs adrénergiques β1 et β2 sont bien caractérisées puisque ceux-ci étaient et sont toujours le sujet d’un grand nombre d’études. L’isoforme β3, en revanche, est beaucoup moins bien connue. Contrairement aux autres isoformes, celle-ci n’est pas internalisée. Le seul mécanisme de désensibilisation connu pour ce récepteur est la diminution de l’expression du gène. Aucun mécanisme de désensibilisation rapide n’a encore été découvert. En 2018, deux publications décrivaient un nouveau mécanisme de régulation des RCPGs : la méthylation des arginines. Plus précisément, les auteurs démontraient que la méthylation par PRMT5 influence la signalisation chez trois RCPGs. Après avoir identifié PRMT5 comme partenaire d’interaction potentiel du récepteur β3 adrénergique (β3AR) en spectrométrie de masse, nous avons entrepris de tester l’implication possible de la méthylation dans la modulation de la signalisation issue de ce récepteur. Nous avons de plus testé deux variants de PRMT5, puisque ceux-ci semblent avoir des effets qui diffèrent dans certains mécanismes cellulaires. Avec des cellules HEK 293, des essais de co-immunoprecipitation ont confirmé l’interaction entre β3AR et PRMT5 observée en spectrométrie de masse et ce, pour les deux variants de PRMT5. En microscopie confocale, nous démontrons que l’isoforme courte de PRMT5, PRMT5S, co-localise avec β3AR au niveau cytoplasmique et à la membrane plasmique, alors que l’isoforme longue, PRMT5L, montre une localisation agrégée dans la région juxtanucléaire. PRMT5 ne semble pas affecter l’expression de surface du récepteur et ne change pas la capacité d’internalisation de celui-ci. L’expression des deux variants de PRMT5 promeut l’activation de la voie ERK1/2 médiée par la stimulation par agoniste de β3AR. À l’inverse, la déplétion de PRMT5 diminue l’activation ERK1/2 β3AR-dépendante. Des essais GST-pulldown nous révèlent que PRMT5S interagit avec la boucle intracellulaire 3 ainsi que la première moitié de la queue C-terminale du récepteur. Finalement, des expériences d’immunobuvardage réalisées avec un anticorps dirigé contre la diméthylation symétrique des arginines ont révélé que PRMT5L produit une méthylation de protéines encore non identifiées de manière temps-dépendante, lors de la stimulation de β3AR. Cela semble indiquer que la stimulation de β3AR peut induire l’activité méthyltransférase de PRMT5. Tous ces résultats nous permettent de proposer un nouveau mécanisme de régulation du récepteur β3 adrénergique, via la méthylation de résidus arginine du récepteur ou de protéines impliquées dans sa signalisation, soit une modification post-traductionnelle encore très peu connue pour cette famille de récepteurs.Abstract: The nature and regulation of β1 and β2 adrenergic receptors are well characterized as they were and still are the subject of many studies. The β3 isoform, however, is far less understood. Contrary to the other isoforms, it does not internalize. The only known desensitization mechanism known for this receptor is the downregulation of its expression. No short-term desensitization mechanism for the β3 isoform has been described as of now. In 2018, two publications described a new regulation mechanism for GPCRs (G protein-coupled receptors): arginine methylation. More precisely, the authors described how methylation by PRMT5 influences the signaling of three distinct GPCRs. Having identified PRMT5 as a potential interaction partner of the β3 adrenergic receptor (β3AR) using mass spectrometry, we set out to investigate the possible implication of arginine methylation in the modulation of signaling by this receptor. We have also tested two variants of PRMT5, as they have previously shown opposing effects in various cellular mechanisms. In HEK 293 cells, co-immunoprecipitation assays confirmed the observed interaction between the β3AR and PRMT5 by mass spectrometry, for both PRMT5 variants. Using confocal microscopy, we demonstrate that the shorter variant of PRMT5, PRMT5S, co-localizes with β3AR in the cytoplasm as well as at the plasma membrane, whereas PRMT5L shows a clustered localization in the juxtanuclear region. PRMT5 does not seem to affect the surface expression of the receptor and has no effect on its internalization. The expression of both PRMT5 variants promotes activation of the ERK1/2 pathway mediated by β3AR agonist stimulation. Conversely, PRMT5 depletion downregulates β3AR-derived ERK1/2 activation. GST-pulldown assays reveal that PRMT5S directly interacts with the third intracellular loop as well the C-terminal tail of the β3AR. Finally, western blot analyses using symmetric dimethylation-specific antibodies reveal that PRMT5L methylates unidentified proteins in a time-dependent manner, upon stimulation of the receptor. This indicates that stimulation of the β3AR can induce arginine methyltransferase activity by PRMT5. Together, our results suggest a new regulation mechanism of the β3 adrenergic receptor, involving methylation of arginine residues of the receptor or proteins involved in its signaling, a poorly understood type of post-translational modification for this family of receptors

Pacific oyster (Crassostrea gigas) hemocyte are not affected by a mixture of pesticides in short-term in vitro assays

Pesticides are frequently detected in estuaries among the pollutants found in estuarine and coastal areas and may have major ecological consequences. They could endanger organism growth, reproduction or survival. In the context of high mortality outbreaks affecting Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France since 2008, it appears of importance to determine the putative effects of pesticides on oyster susceptibility to infectious agents. Massive mortality outbreaks reported in this species, mainly in spring and summer, may suggest an important role played by the seasonal use of pesticides and freshwater input in estuarine areas where oyster farms are frequently located. To understand the impact of some pesticides detected in French waters, their effects on Pacific oyster hemocytes were studied through short-term in vitro experiments. Bivalve immunity is mainly supported by hemocytes eliminating pathogens by phagocytosis and producing compounds including lysosomal enzymes and antimicrobial molecules. In this study, oyster hemocytes were incubated with a mixture of 14 pesticides and metaldehyde alone, a molecule used to eliminate land mollusks. Hemocyte parameters including dead/alive cells, nonspecific esterase activities, intracytoplasmic calcium, lysosome number and activity and phagocytosis were monitored by flow cytometry. No significant effect of pesticides tested at different concentrations was reported on oyster hemocytes maintained in vitro for short-term periods in the present study. It could be assumed that these oyster cells were resistant to pesticide exposure in tested conditions and developing in vivo assays appears as necessary to better understand the effects of polluants on immune system in mollucks

In vivo effects of metaldehyde on Pacific oyster, Crassostrea gigas: comparing hemocyte parameters in two oyster families.

Pollutants via run-off into the ocean represent a potential threat to marine organisms, especially bivalves such as oysters living in coastal environments. These organisms filter large volumes of seawater and may accumulate contaminants within their tissues. Pesticide contamination in water could have a direct or indirect toxic action on tissues or cells and could induce alteration of immune system. Bivalve immunity is mainly supported by hemocytes and participates directly by phagocytosis to eliminate pathogens. Some studies have shown that pesticides can reduce immune defences and/or modify genomes in vertebrates and invertebrates. Metaldehyde is used to kill slugs, snails and other terrestrial gastropods. Although metaldehyde has been detected in surface waters, its effects on marine bivalves including the Pacific oyster, Crassostrea gigas, have never been studied. Given the mode of action of this molecule and its targets (molluscs), it could be potentially more toxic to oysters than other pesticides (herbicides, fungicides, insecticides, etc.). Effects of metaldehyde on oyster hemocyte parameters were thus monitored through in vivo experiments based on a short-term exposure. In this work, metaldehyde at 0.1 μg/L, which corresponds to an average concentration detected in the environment, modulated hemocyte activities of Pacific oysters after an in vivo short-term contact. Individuals belonging to two families showed different behaviours for some hemocyte activities after contamination by metaldehyde. These results suggested that effects of pollutants on oysters may differ from an individual to another in relation to genetic diversity. Finally, it appears essential to take an interest in the effects of metaldehyde on a wide variety of aquatic invertebrates including those that have a significant economic impact

Morphological, calorific and nutritive characteristics of 656 freshwater invertebrates taxa

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