Onkogene Signalwege bei der Infektion mit Adenoviren

Konditional replizierende Viren werden derzeit hinsichtlich ihrer Einsetzbarkeit in der Krebstherapie untersucht, mit dem Ziel der spezifischen, Virus-vermittelten Onkolyse. Ein vielversprechender onkolytischer Ansatz beruht auf der Beobachtung, dass aktiviertes Ras, wie es in 30 % aller malignen Tumoren vorkommt, möglicherweise die Aktivität der PKR, einer zentralen Kinase der wirtszelleigenen Virusabwehr, beeinträchtigt. Auf diese Weise könnten PKR-sensitive Viren selektiv in Ras-transformierten Tumorzellen replizieren, während das umliegende Gewebe verschont bleibt. Nach aussichtsreichen Versuchen mit Reoviren und Vesikulären Stomatitis Viren, die eine natürliche Sensitivität gegenüber der PKR-Wirkung besitzen, folgten Versuche mit PKR-sensitiven Virusmutanten, wie z. B. Influenza Virus dNS1 und Herpes Simplex Virus R3616. Nachteile all dieser onkolytischen Viren sind zum einen die schlechte genetische Manipulierbarkeit und zum anderen die hohe Pathogenität der Parentalviren. Adenoviren hingegen verursachen weitgehend ungefährliche Krankheiten und dienen als gut charakterisiertes System schon lange als Vektoren in der Gentherapie. In dieser Doktorarbeit ist es gelungen, das Prinzip der Ras-abhängigen Onkolyse auf Adenoviren zu übertragen. Durch gezielte Mutationen konnten PKR-sensitive Adenoviren (Ad dVA) hergestellt werden, und ihre selektive Replikationsfähigkeit konnte in verschiedenen Ras-transformierten Tumorzellen bestätigt werden. Mechanistische Untersuchungen ließen allerdings Zweifel an der Allgemeingültigkeit des molekularen Konzepts der Ras-abhängigen Replikation onkolytischer Viren aufkommen. Zum einen war mutiertes Ras nicht in der Lage, direkt mit der PKR-Aktivität zu interferieren. Zum anderen aktivierten Adenoviren gezielt Ras-abhängige Signalwege, um eine effiziente Translation zu gewährleisten. Wir vermuten deshalb indirekte Einflüsse der Ras-abhängigen Transformation auf PKR-Effektor-mechanismen als Urache für die erhöhte Permissivität von Ras-mutierten Tumor-zellen für PKR-sensitive Viren. In Übereinstimmung damit war die Fähigkeit zur PKR-vermittelten Apoptose in Ad dVA-permissiven Zellen stark eingeschränkt. Unsere Ergebnisse befürworten grundsätzlich den Einsatz PKR-sensitiver Adenoviren in der Virus-vermittelten Onkolyse, unterstreichen aber zugleich die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen zur Aufklärung der zugrundeliegenden Mechanismen

Onkogene Signalwege bei der Infektion mit Adenoviren

Konditional replizierende Viren werden derzeit hinsichtlich ihrer Einsetzbarkeit in der Krebstherapie untersucht, mit dem Ziel der spezifischen, Virus-vermittelten Onkolyse. Ein vielversprechender onkolytischer Ansatz beruht auf der Beobachtung, dass aktiviertes Ras, wie es in 30 % aller malignen Tumoren vorkommt, möglicherweise die Aktivität der PKR, einer zentralen Kinase der wirtszelleigenen Virusabwehr, beeinträchtigt. Auf diese Weise könnten PKR-sensitive Viren selektiv in Ras-transformierten Tumorzellen replizieren, während das umliegende Gewebe verschont bleibt. Nach aussichtsreichen Versuchen mit Reoviren und Vesikulären Stomatitis Viren, die eine natürliche Sensitivität gegenüber der PKR-Wirkung besitzen, folgten Versuche mit PKR-sensitiven Virusmutanten, wie z. B. Influenza Virus dNS1 und Herpes Simplex Virus R3616. Nachteile all dieser onkolytischen Viren sind zum einen die schlechte genetische Manipulierbarkeit und zum anderen die hohe Pathogenität der Parentalviren. Adenoviren hingegen verursachen weitgehend ungefährliche Krankheiten und dienen als gut charakterisiertes System schon lange als Vektoren in der Gentherapie. In dieser Doktorarbeit ist es gelungen, das Prinzip der Ras-abhängigen Onkolyse auf Adenoviren zu übertragen. Durch gezielte Mutationen konnten PKR-sensitive Adenoviren (Ad dVA) hergestellt werden, und ihre selektive Replikationsfähigkeit konnte in verschiedenen Ras-transformierten Tumorzellen bestätigt werden. Mechanistische Untersuchungen ließen allerdings Zweifel an der Allgemeingültigkeit des molekularen Konzepts der Ras-abhängigen Replikation onkolytischer Viren aufkommen. Zum einen war mutiertes Ras nicht in der Lage, direkt mit der PKR-Aktivität zu interferieren. Zum anderen aktivierten Adenoviren gezielt Ras-abhängige Signalwege, um eine effiziente Translation zu gewährleisten. Wir vermuten deshalb indirekte Einflüsse der Ras-abhängigen Transformation auf PKR-Effektor-mechanismen als Urache für die erhöhte Permissivität von Ras-mutierten Tumor-zellen für PKR-sensitive Viren. In Übereinstimmung damit war die Fähigkeit zur PKR-vermittelten Apoptose in Ad dVA-permissiven Zellen stark eingeschränkt. Unsere Ergebnisse befürworten grundsätzlich den Einsatz PKR-sensitiver Adenoviren in der Virus-vermittelten Onkolyse, unterstreichen aber zugleich die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen zur Aufklärung der zugrundeliegenden Mechanismen

A strategy for enrichment of claudins based on their affinity to Clostridium perfringens enterotoxin

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Claudins, a family of protein localized in tight junctions, are essential for the control of paracellular permeation in epithelia and endothelia. The interaction of several claudins with <it>Clostridium perfringens </it>enterotoxin (CPE) has been exploited for an affinity-based enrichment of CPE-binding claudins from lysates of normal rat cholangiocytes.</p> <p>Results</p> <p>Immunoblotting and mass spectrometry (MS) experiments demonstrate strong enrichment of the CPE-binding claudins -3, -4 and -7, indicating specific association with glutathione-S-transferase (GST)-CPE_116–319fusion protein. In parallel, the co-elution of (non-CPE-binding) claudin-1 and claudin-5 was observed. The complete set of co-enriched proteins was identified by MS after electrophoretic separation. Relative mass spectrometric protein quantification with stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) made it possible to discriminate specific binding from non-specific association to GST and/or matrix material.</p> <p>Conclusion</p> <p>CPE_116–319provides an efficient tool for single step enrichment of different claudins from cell lysates. Numerous proteins were shown to be co-enriched with the CPE-binding claudins, but there are no indications (except for claudins -1 and -5) for an association with tight junctions.</p

Proteome analysis of the HIV-1 Gag interactome

AbstractHuman immunodeficiency virus Gag drives assembly of virions in infected cells and interacts with host factors which facilitate or restrict viral replication. Although several Gag-binding proteins have been characterized, understanding of virus–host interactions remains incomplete. In a series of six affinity purification screens, we have identified protein candidates for interaction with HIV-1 Gag. Proteins previously found in virions or identified in siRNA screens for host factors influencing HIV-1 replication were recovered. Helicases, translation factors, cytoskeletal and motor proteins, factors involved in RNA degradation and RNA interference were enriched in the interaction data. Cellular networks of cytoskeleton, SR proteins and tRNA synthetases were identified. Most prominently, components of cytoplasmic RNA transport granules were co-purified with Gag. This study provides a survey of known Gag–host interactions and identifies novel Gag binding candidates. These factors are associated with distinct molecular functions and cellular pathways relevant in host–pathogen interactions

Development of a biodegradable microstent for minimally invasive treatment of Fallopian tube occlusions

Obstructions of the Fallopian tube represent one of the most common reasons for an unfulfilled desire to have children. Microstent technology opens up new therapeutic possibilities to restore the natural lumen of the Fallopian tube within a single treatment. Within the current work we developed a self-expandable biodegradable microstent for gynecological applications. Based on a novel microstent design, prototypes were manufactured from poly-L-lactide tubing by means of fs-laser cutting. Microstent prototypes were characterized morphologically by means of scanning electron microscopy and biaxial laser scanning. As manufactured, a microstents outside diameter of about 2.3 mm and a strut thickness/width of about 114 µm/103 µm was measured. Mechanical characterization of microstents included bending as well as crimping and release behavior. After crimping to a minimum diameter of 0.8 mm and consecutive release, a microstent recovery to a diameter of 1.8 mm was found. Therefore, proof-of-concept for the self-expandable microstent could be successfully provided. © 2020 by Walter de Gruyter Berlin/Boston 2020

The CHR promoter element controls cell cycle-dependent gene transcription and binds the DREAM and MMB complexes

Cell cycle-dependent gene expression is often controlled on the transcriptional level. Genes like cyclin B, CDC2 and CDC25C are regulated by cell cycle-dependent element (CDE) and cell cycle genes homology region (CHR) promoter elements mainly through repression in G0/G1. It had been suggested that E2F4 binding to CDE sites is central to transcriptional regulation. However, some promoters are only controlled by a CHR. We identify the DREAM complex binding to the CHR of mouse and human cyclin B2 promoters in G0. Association of DREAM and cell cycle-dependent regulation is abrogated when the CHR is mutated. Although E2f4 is part of the complex, a CDE is not essential but can enhance binding of DREAM. We show that the CHR element is not only necessary for repression of gene transcription in G0/G1, but also for activation in S, G2 and M phases. In proliferating cells, the B-myb-containing MMB complex binds the CHR of both promoters independently of the CDE. Bioinformatic analyses identify many genes which contain conserved CHR elements in promoters binding the DREAM complex. With Ube2c as an example from that screen, we show that inverse CHR sites are functional promoter elements that can bind DREAM and MMB. Our findings indicate that the CHR is central to DREAM/MMB-dependent transcriptional control during the cell cycle

Processing of Genome 5′ Termini as a Strategy of Negative-Strand RNA Viruses to Avoid RIG-I-Dependent Interferon Induction

Innate immunity is critically dependent on the rapid production of interferon in response to intruding viruses. The intracellular pathogen recognition receptors RIG-I and MDA5 are essential for interferon induction by viral RNAs containing 5′ triphosphates or double-stranded structures, respectively. Viruses with a negative-stranded RNA genome are an important group of pathogens causing emerging and re-emerging diseases. We investigated the ability of genomic RNAs from substantial representatives of this virus group to induce interferon via RIG-I or MDA5. RNAs isolated from particles of Ebola virus, Nipah virus, Lassa virus, and Rift Valley fever virus strongly activated the interferon-beta promoter. Knockdown experiments demonstrated that interferon induction depended on RIG-I, but not MDA5, and phosphatase treatment revealed a requirement for the RNA 5′ triphosphate group. In contrast, genomic RNAs of Hantaan virus, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus and Borna disease virus did not trigger interferon induction. Sensitivity of these RNAs to a 5′ monophosphate-specific exonuclease indicates that the RIG-I-activating 5′ triphosphate group was removed post-transcriptionally by a viral function. Consequently, RIG-I is unable to bind the RNAs of Hantaan virus, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus and Borna disease virus. These results establish RIG-I as a major intracellular recognition receptor for the genome of most negative-strand RNA viruses and define the cleavage of triphosphates at the RNA 5′ end as a strategy of viruses to evade the innate immune response