Biophysical characterization of measles virus fusion-inhibitory peptides: a focus on membrane interactions and self-assembly

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017O vírus do Sarampo é um dos vírus patogénicos mais contagiosos, que infeta anualmente 20 milhões de pessoas por todo o mundo, apesar da existência de uma vacina eficaz. É, mundialmente, uma das principais causas de morte infantil. O vírus do Sarampo é transmitido através de gotículas de aerossol que entram no trato respiratório ou por contato direto com secreções respiratórias infetadas, causando uma doença infeciosa aguda, a doença do Sarampo, caracterizada por febre e erupção cutânea maculopapular, muitas vezes combinado com tosse, coriza e conjuntivite. As primeiras células a serem infetadas pelo vírus são os macrófagos e células dendríticas que expressam o recetor CD150, presentes no trato respiratório. Após a migração das células infetadas para os tecidos linfáticos, o vírus infecta e prolifera em linfócitos B e T CD150+, com a consequente disseminação sistémica para os restantes órgãos e tecidos, causando uma profunda supressão do sistema imunitário, o que pode levar ao aparecimento de infeções secundárias fatais. O recetor nectina-4 é também reconhecido pelo vírus do Sarampo em células epiteliais, e está associado à transmissão viral em fases posteriores da infeção. Em casos raros de infeção persistente do vírus do Sarampo, podem desenvolver-se doenças neurológicas fatais, nomeadamente encefalomielite disseminada aguda, encefalite por Sarampo com corpos de inclusão e panencefalite esclerosante subaguda. A ação coordenada das proteínas hemaglutina (H) e de fusão (F) do invólucro viral é essencial para a entrada do vírus nas células alvo. Previamente ao contacto com as células hospedeiras, a proteína F do vírus encontra-se numa estrutura trimérica prefusogénica metaestável. Com a ligação da proteína H do vírus aos recetores, CD150 ou nectina-4 da célula hospedeira, esta sofre uma mudança conformacional que insere o péptido de fusão da proteína F na membrana celular da célula hospedeira. A energia resultante da ativação por parte da proteína H, provoca uma mudança conformacional na estrutura prefusogénica da proteína F, induzindo a reorientação dos trímeros numa estrutura posfusogénica, que aproxima e funde as membranas viral e celular, levando à formação de um poro de fusão. Os componentes do vírus são introduzidos no interior da célula hospedeira, iniciando a replicação viral. O vírus do Sarampo foi declarado eliminado dos Estados Unidos da América em 2000, contudo, o ressurgimento deste vírus em países desenvolvidos tem vindo a ser verificado, devendo-se principalmente ao aumento de propaganda anti-vacinação, com consequente decréscimo na cobertura de vacinação, que resulta na acumulação de populações suscetíveis à infeção e transmissão deste vírus. O aumento dos casos de infeção pelo vírus do Sarampo e a inexistência de tratamentos para infeções agudas e persistentes do vírus exigem a procura por novas terapias. Na última década, os avanços tecnológicos nas técnicas de síntese de péptidos permitiram o desenvolvimento de uma nova geração de péptidos terapêuticos. Estes péptidos terapêuticos são capazes de se ligar com alta especificidade aos seus alvos in vivo, sendo bastante eficientes e com fracos efeitos secundários. Uma das classes destes péptidos são os antivirais inibidores de entrada, que são direcionados para a fase primária de infeção, atuando sobre o reconhecimento, acoplamento e entrada do vírus na célula alvo. Uma vez que inibem o avanço do ciclo viral antes da invasão celular, estes inibidores possuem claras vantagens perante outros antivirais que atuam em estágios tardios. Um dos casos de sucesso desta classe de antivirais é o enfuvirtide, o primeiro péptido sintético a ser aprovado para o tratamento do VIH. Estes péptidos são derivados da região heptad repeat do terminal C (HRC) das proteínas de fusão gp41 do VIH, atuando sobre a região heptad repeat do terminal N (HRN), impedindo a mudança conformacional que leva à fusão das membranas viral e celular. O desenvolvimento de inibidores de fusão com um modo de ação semelhante ao enfuvertide, que atuam sobre outros vírus, tem demonstrado resultados promissores. Péptidos HRC, derivados da região HRC da proteína F do vírus do Sarampo, inibem com eficácia o processo de fusão do vírus. O modo de ação proposto para os péptidos HRC consiste em bloquear as mudanças conformacionais fusogénicas da proteína F do vírus do Sarampo, mimetizando as interacções naturais do HRN e HRC durante a infeção. A estes péptidos foram aplicadas estratégias de dimerização e de conjugação com domínios lipófilos (colesterol e tocoferol) de modo a melhorar a sua eficácia antiviral. Estudos biológicos e biofísicos com estes péptidos demonstraram que a presença dos domínios lipófilos nos péptidos provoca a sua agregação em solução, enquanto que a dimerização aumenta o tamanho e diminui a compactação dos agregados, aumentando a sua capacidade de integração nas membranas, e levando a uma inibição eficaz do processo de fusão do vírus do Sarampo in vitro e in vivo. Estes resultados sugerem que o equilíbrio entre a agregação e a integração nas membranas, regula a eficácia in vivo dos péptidos inibidores de fusão. Com os resultados promissores obtidos para os péptidos HRC, questionou-se a possibilidade de aumentar a eficácia antiviral dos péptidos ao introduzir mutações na cadeia peptídica. Entre os anos de 2009 e 2010, um surto do vírus do Sarampo identificado na África do Sul, levou à infeção de mais de 18 000 indivíduos, tendo vários pacientes desenvolvido encefalite por Sarampo. Uma análise sequencial do vírus do Sarampo presente nos cérebros de 2 dos pacientes que sofreram de encefalite, revela uma mutação U para G na posição 1944 do gene da proteína F do vírus, o que se traduz numa mutação nos aminoácidos de uma leucina para triptofano na posição 454 (L454W) da proteína F. Estudos posteriores revelaram que a mutação L454W na proteína F do vírus do Sarampo aumenta a destabilização do estado prefusogénico metaestável desta proteína, o que promove a sua alteração conformacional para o estado posfusogénico. Verificou-se ainda que o aumento da temperatura, mesmo na ausência de um recetor celular, era suficiente para iniciar a mudança conformacional, facilitando a fusão entre as membranas viral e celular, o que explica a neurovirulência verificada durante o surto. Dado o efeito da mutação L454W na destabilização da proteína F do vírus, aplicou-se essa mesma mutação aos péptidos HRC, sintetizando-se um novo grupo de péptidos inibidores de fusão, denominados péptidos HRC-L454W. Tal como com os péptidos HRC, os péptidos HRC-L454W foram conjugados com domínios lipófilos nas formas monoméricas e diméricas. O modo de ação proposto é semelhante ao dos péptidos HRC, contudo, colocamos a hipótese que a instabilidade adquirida pela mutação promova uma ligação melhorada dos péptidos à região HRN, tal como se verifica no vírus mutado. Estudos biológicos preliminares revelaram uma eficácia viral in vitro promissora, principalmente para o péptido HRC-L454W dimérico conjugado com colesterol. Contudo, a eficácia antiviral in vivo não apresenta diferenças significativas entre os péptidos HRC-L454W, revelando também uma eficácia antiviral reduzida em comparação aos péptidos HRC. Neste estudo, em conjunto com o anteriormente descrito para os péptidos de HRC, foram avaliadas propriedades físico-químicas, agregação e cinética de inserção de membrana dos péptidos HRC-L454W inferindo sobre seus efeitos na eficácia antiviral in vivo. Os resultados obtidos sugerem que a presença do triptofano, contribui para o aumento da instabilidade e tamanho nos agregados formados pelos péptidos HRC-L454W. Semelhante aos péptidos HRC, os agregados apresentaram dois tipos organização estrutural. Péptidos monoméricos conjugados, formam agregados menores e compactos, conectados pelos domínios lipófilos formando um núcleo hidrofóbico relativamente estável, mantendo-se em estruturas micelares em solução ao longo do tempo, apresentando uma menor afinidade para a interação com as membranas. Péptidos diméricos conjugados, formam agregados maiores e menos compactos, formados por clusters de agregação instáveis. Estes aparentam ser resultantes do aumento das restrições estéreas no seu interior, capazes de se ligar através de interações entre as moléculas dos domínios lipófilos e as cadeias peptídicas de diferentes clusters, aumentando o seu tamanho em solução ao longo do tempo, apresentando uma maior afinidade para a interação com membranas. A maior hidrofobicidade das moléculas de colesterol, em relação às moléculas de tocoferol, favorece a formação de mais interações entre clusters de agregação, resultando em agregados mais instáveis, menos compactos e maiores. Propomos que, devido ao seu tamanho e natureza química, a presença do resíduo de triptofano eleve as restrições estéreas entre as cadeias peptídicas dentro dos agregados, aumentando significativamente a sua instabilidade. O aumento da instabilidade e desordem no sistema de clusters de agregação aumenta a probabilidade de interações entre moléculas lipófílas e as cadeias peptídicas de péptidos presentes em diferentes clusters, o que contribui para o aumento do tamanho e instabilidade dos agregados. A elevada instabilidade e aumento do tamanho dos agregados em solução, principalmente para a péptido HRC-L454W dimérico conjugado com colesterol, induz a perda de suas propriedades como nanopartículas, reduzindo a biodistribuição dos péptidos, e diminuindo a sua eficácia antiviral in vivo. A análise biofísica realizada neste estudo, introduz características relativas à instabilidade na agregação peptídica, que podem ser usadas no design eficiente de péptidos antivirais inibidores de fusão. A perda do equilíbrio ideal entre agregação e interação com as membranas, devido à instabilidade elevada nos agregados formados pelos péptidos, afeta negativamente a eficácia antiviral in vivo

Biological screening of herbal extracts and essential oil from Plectranthus species: α-amylase and 5-lipoxygenase inhibition and antioxidant and anti-Candida potentials

The phenolic compound content, the antioxidant and α-amylase inhibition potentials of different extracts of the Plectranthus amboinicus, P. barbatus and P. ornatus were evaluated. We also evaluated the influence of plant growth and harvest time on the chemical composition of the essential oil (EO) of P. amboinicus, its antioxidant and anti-Candida activities and the α-amylase and lipoxygenase inhibitions. The turbo-extract of P. barbatus showed the greatest phenolic compound content and antioxidant activity. No α-amylase inhibition activity was observed in the analyzed extracts, but the turbo-extraction and refluxing extracts possessed high antioxidant activities. Protected cultivation and morning harvest conditions gave the best antioxidant activities, which was associated to the highest carvacrol content. P. amboinicus EO antioxidant activity could contribute to the reduction of oxidative stress in diabetes. Causal Candida strains of diabetic foot ulcers showed sensitivity to P. amboinicus EO. C. albicans and C. dubliniensis were the most sensitive of the selected Candida strains. Turbo-extracts or refluxing of the three species extracts and the EO of P. amboinicus should be considered as a potential candidate for the management the complications of type 2 diabetes

Questionário AGRASS: Avaliação da Gestão de Riscos Assistenciais em Serviços de Saúde

OBJECTIVE: This study aims to assess the development and the validity analysis of the Assessment of Risk Management in Health Care Questionnaire (AGRASS). METHODS: This is a validation study of a measurement instrument following the stages: 1) Development of conceptual model and items; 2) Formal multidisciplinary assessment; 3) Nominal group for validity analysis with national specialists; 4) Development of software and national pilot study in 62 Brazilian hospitals 5) Delphi for validity analysis with the users of the questionnaire. In stages 3 and 5, the items were judged based on face validity, content validity, and utility and viability, by a 1-7 Likert scale (cut-off point: median < 6). Accuracy and reliability of the questionnaire were analyzed with the Confirmatory Factor Analysis and the Cronbach’s alpha. RESULTS: The initial version of the instrument (98 items) was adapted during stages 1 to 3 for the final version with 40 items, which were considered relevant, of adequate content, useful, and viable. The instrument has 2 dimensions and 9 subdimensions, and the items have closed-ended questions (yes or no). The software for the automatic collection and analysis generates indicators, tables, and automatic graphs for the assessed institution and aggregated data. The adjustment indices confirmed a bi-dimensional model composed of structure and process (X2/gl = 1.070, RMSEA ≤ 0.05 = 0.847, TLI = 0.972), with high reliability for the AGRASS Questionnaire (α = 0.94) and process dimension (α = 0.93), and adequate for the structural dimension (α = 0.70). CONCLUSIONS: The AGRASS Questionnaire is a potentially useful instrument for the surveillance and monitoring of the risk management and patient safety in health services.OBJETIVO: O estudo objetiva descrever a construção e análise da validade do Questionário Avaliação da Gestão de Riscos Assistenciais em Serviços de Saúde (AGRASS). MÉTODOS: Trata-se de estudo de validação de um instrumento de medida nas etapas: 1. construção do modelo conceitual e itens; 2. apreciação formal multidisciplinar; 3. grupo nominal para análise da validade com especialistas da esfera nacional; 4. desenvolvimento de softwares e estudo-piloto nacional em 62 hospitais do Brasil; 5. Delphi para análise da validade com utilizadores do questionário. Nas etapas 3 e 5, os itens foram julgados quanto à validade de face e conteúdo, utilidade e viabilidade, em uma escala Likert de 1 a 7 (ponto de corte: mediana < 6). A validade de construto e a confiabilidade foram analisadas com análise fatorial confirmatória e coeficientes α de Cronbach. RESULTADOS: A versão inicial do instrumento (98 itens) foi adaptada durante as etapas 1 a 3 para a versão com 40 itens considerados relevantes, de conteúdo adequado, úteis e viáveis. O instrumento tem duas dimensões e nove subdimensões, e os itens têm opção de resposta fechada (sim ou não). Os softwares para coleta e análise automática geram indicadores, tabelas e gráficos automáticos para a instituição avaliada e conjuntos agregados. Os índices de ajuste confirmaram o modelo bidimensional de estrutura e processo (X2/gl = 1,070, RMSEA ≤ 0,05 = 0,847; TLI = 0,972), havendo confiabilidade alta para o Questionário AGRASS (α = 0,94) e a dimensão processo (α = 0,93) e aceitável para a dimensão estrutura (α = 0,70). CONCLUSÃO: O Questionário AGRASS é um instrumento potencialmente útil para a vigilância e monitoramento da gestão de riscos e segurança do paciente em serviços de saúde

A computação na sociedade palestina: Um estudo de caso

Como proposta para o presente estudo, destacamos um estudo de caso comparativo de utilização de recursos tecnológicos no sistema educacional Autoridade Nacional Palestina. O trabalho qualitativo e empírico descritivo foi desenvolvido no Departamento de Estatística e Informática da Universidade Federal Rural de Pernambuco (Brasil), no período de fevereiro a maio de 2017.

Enhanced LTP in aged rats: detrimental or compensatory?

© 2016 Published by Elsevier Ltd.Age-dependent memory deterioration has been well documented and yet an increase in rat hippocampal LTP upon aging has been reported. This poses the question of whether the enhanced LTP is a cause or an attempt to compensate the memory deficits described in aged rats. Hippocampal slices from young, adult and aged Wistar rats were pre-incubated, with an NMDA receptor (NMDAR) antagonist, memantine (1 μM, 4 h), and hippocampal LTP was evaluated. The results show that memantine significantly decreases the larger LTP magnitude recorded in hippocampal slices from aged rats without compromising LTP recorded in slices from young and adult animals. To unveil the impact of in vivo administration of memantine, different doses (1, 5 and 10 mg/kg/day) or saline vehicle solution were intraperitoneally administered, for 15-20 days, to both young and aged animals. Memantine did not significantly affect neither the place learning of young animals, evaluated by Morris Water Maze, nor LTP recorded from hippocampal slices from the same group of animals. However, memantine (5 and 10 mg/kg/day) significantly decreased the large LTP recorded in hippocampal slices from aged animals. Moreover, aged animals treated with memantine (10 mg/kg/day) showed a significantly compromised place learning when compared to aged control animals. Overall, these results suggest that the larger LTP observed in aged animals is a compensatory phenomenon, rather than pathological. The finding that age-dependent blockade of LTP by a NMDAR antagonist leads to learning deficits, implies that the increased LTP observed upon aging may be playing an important role in the learning process.This work was supported by Bial Foundation (Grant 57/12) and the “Educação pela Ciência” Program, GAPIC/Faculty of Medicine of the University of Lisbon (201100015). LVL is an investigator FCT.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Biological screening of herbal extracts and essential oil from Plectranthus species: α-amylase and 5-lipoxygenase inhibition and antioxidant and anti-Candida potentials

Abstract The phenolic compound content, the antioxidant and α-amylase inhibition potentials of different extracts of the Plectranthus amboinicus, P. barbatus and P. ornatus were evaluated. We also evaluated the influence of plant growth and harvest time on the chemical composition of the essential oil (EO) of P. amboinicus, its antioxidant and anti-Candida activities and the α-amylase and lipoxygenase inhibitions. The turbo-extract of P. barbatus showed the greatest phenolic compound content and antioxidant activity. No α-amylase inhibition activity was observed in the analyzed extracts, but the turbo-extraction and refluxing extracts possessed high antioxidant activities. Protected cultivation and morning harvest conditions gave the best antioxidant activities, which was associated to the highest carvacrol content. P. amboinicus EO antioxidant activity could contribute to the reduction of oxidative stress in diabetes. Causal Candida strains of diabetic foot ulcers showed sensitivity to P. amboinicus EO. C. albicans and C. dubliniensis were the most sensitive of the selected Candida strains. Turbo-extracts or refluxing of the three species extracts and the EO of P. amboinicus should be considered as a potential candidate for the management the complications of type 2 diabetes

AMAZONIA CAMTRAP: A data set of mammal, bird, and reptile species recorded with camera traps in the Amazon forest

The Amazon forest has the highest biodiversity on Earth. However, information on Amazonian vertebrate diversity is still deficient and scattered across the published, peer-reviewed, and gray literature and in unpublished raw data. Camera traps are an effective non-invasive method of surveying vertebrates, applicable to different scales of time and space. In this study, we organized and standardized camera trap records from different Amazon regions to compile the most extensive data set of inventories of mammal, bird, and reptile species ever assembled for the area. The complete data set comprises 154,123 records of 317 species (185 birds, 119 mammals, and 13 reptiles) gathered from surveys from the Amazonian portion of eight countries (Brazil, Bolivia, Colombia, Ecuador, French Guiana, Peru, Suriname, and Venezuela). The most frequently recorded species per taxa were: mammals: Cuniculus paca (11,907 records); birds: Pauxi tuberosa (3713 records); and reptiles: Tupinambis teguixin (716 records). The information detailed in this data paper opens up opportunities for new ecological studies at different spatial and temporal scales, allowing for a more accurate evaluation of the effects of habitat loss, fragmentation, climate change, and other human-mediated defaunation processes in one of the most important and threatened tropical environments in the world. The data set is not copyright restricted; please cite this data paper when using its data in publications and we also request that researchers and educators inform us of how they are using these data