Aspergillosis, avian species and the one health perspective : the possible importance of birds in azole resistance

© 2020 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).The One Health context considers health based on three pillars: humans, animals, and environment. This approach is a strong ally in the surveillance of infectious diseases and in the development of prevention strategies. Aspergillus spp. are fungi that fit substantially in this context, in view of their ubiquity, as well as their importance as plant pathogens, and potentially fatal pathogens for, particularly, humans and avian species. In addition, the emergence of azole resistance, mainly in Aspergillus fumigatus sensu stricto, and the proven role of fungicides widely used on crops, reinforces the need for a multidisciplinary approach to this problem. Avian species are involved in short and long distance travel between different types of landscapes, such as agricultural fields, natural environments and urban environments. Thus, birds can play an important role in the dispersion of Aspergillus, and of special concern, azole-resistant strains. In addition, some bird species are particularly susceptible to aspergillosis. Therefore, avian aspergillosis could be considered as an environmental health indicator. In this review, aspergillosis in humans and birds will be discussed, with focus on the presence of Aspergillus in the environment. We will relate these issues with the emergence of azole resistance on Aspergillus. These topics will be therefore considered and reviewed from the “One Health” perspective.This study was supported by the International Cooperation Program financed by Brazilian Federal Agency for Support and Evaluation of Graduate Education within the Ministry of Education of Brazil (CAPES), under the Capes-Print Program and PDSE Program—Finance Code 001info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Trends on Aspergillus Epidemiology-Perspectives from a National Reference Laboratory Surveillance Program

Identification of Aspergillus to species level is important since sibling species may display variable susceptibilities to multiple antifungal drugs and also because correct identification contributes to improve the knowledge of epidemiological studies. Two retrospective laboratory studies were conducted on Aspergillus surveillance at the Portuguese National Mycology Reference Laboratory. The first, covering the period 2017-2018, aimed to study the molecular epidemiology of 256 Aspergillus isolates obtained from patients with respiratory, subcutaneous, or systemic infections and from environmental samples. The second, using our entire collection of clinical and environmental A. fumigatus isolates (N = 337), collected between 2012 and 2019, aimed to determine the frequency of azole-resistant A. fumigatus isolates. Aspergillus fumigatus sensu stricto was the most frequent species in both clinical and environmental samples. Overall, and considering all Aspergillus sections identified, a high frequency of cryptic species was detected, based on beta-tubulin or calmodulin sequencing (37% in clinical and 51% in environmental isolates). Regarding all Fumigati isolates recovered from 2012-2019, the frequency of cryptic species was 5.3% (18/337), with the identification of A. felis (complex), A. lentulus, A. udagawae, A. hiratsukae, and A. oerlinghauensis. To determine the frequency of azole resistance of A. fumigatus, isolates were screened for azole resistance using azole-agars, and 53 possible resistant isolates were tested by the CLSI microdilution reference method. Nine A. fumigatus sensu stricto and six Fumigati cryptic isolates showed high minimal inhibitory concentrations to itraconazole, voriconazole, and/or posaconazole. Real-time PCR to detect cyp51A mutations and sequencing of cyp51A gene and its promoter were performed. The overall frequency of resistance to azoles in A. fumigatus sensu stricto was 3.0%. With this retrospective analysis, we were able to detect one azole-resistant G54R mutant A. fumigatus environmental isolate, collected in 2015. The TR34/L98H mutation, linked to environmental transmission route of azole resistance, was the most frequently detected mutation (N = 4; 1.4%). Our findings underline the demand for correct identification and susceptibility testing of Aspergillus isolates.This article belongs to the Special Issue Aspergillus Infection.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

CURVA DE PARÂMETROS SANGUÍNEOS E DE PESO EM SPHENISCUS MAGELLANICUS (FOSTER, 1781) (AVES: SPHENISCIFORMES) EM REABILITAÇÃO COM ASPERGILOSE

Parâmetros sanguíneos básicos e peso corpóreo são rotineiramente utilizados para monitoramento do estado geral de Pinguins-de-Magalhães em reabilitação, no entanto, estudos mostrando o perfil de variação destes parâmetros durante o desenvolvimento da aspergilose nestes animais não são conhecidos. Neste sentido, este trabalho objetivou  determinar curva de peso, de hematócrito (Ht) e de proteínas plasmáticas totais (PPT) em pinguins com aspergilose. O estudo do tipo caso-controle retrospectivo foi realizado com pinguins em reabilitação no sul do Brasil, sendo o grupo caso composto por pinguins com aspergilose, e o grupo controle por pinguins sadios. Para a determinação das curvas, foram coletados dados de amostras sequenciais, realizadas em média a cada sete dias, durante um período máximo de 81 dias, sendo estes submetidos a análise de variância (ANOVA) com teste post-hoc de Bonferroni. Ao todo, 140 animais foram estudados (50% casos e 50% controles). Pinguins com aspergilose diferiram significativamente do grupo controle em todos os parâmetros analisados, apresentando ganho de peso somente nas três primeiras coletas, com estabilização ou perda de peso nas coletas posteriores até seu desfecho, bem como declínio progressivo dos valores de Ht, os quais mantiveram-se abaixo do valor de referência para a espécie desde a terceira até a nona e última coleta, e aumento progressivo dos valores de PPT ao longo das coletas, com diferença significativa a partir da sexta coleta em relação ao grupo controle. O estabelecimento desse perfil em pinguins com aspergilose pode servir como indicativo de mau prognóstico destes animais em cativeiro, e como parâmetro para início de terapia preemptiva para aspergilose ou de investigação diagnóstica mais específica.

Initial Results of the International Efforts in Screening New Agents against Candida auris

This article belongs to the Special Issue Biology, Immunology, Epidemiology, and Therapy of Fungal Infections: A Themed Issue Dedicated to Professor David A. Stevens.Background: Candida auris is an emergent fungal pathogen and a global concern, mostly due to its resistance to many currently available antifungal drugs. Objective: Thus, in response to this challenge, we evaluated the in vitro activity of potential new drugs, diphenyl diselenide (PhSe)2 and nikkomycin Z (nikZ), alone and in association with currently available antifungals (azoles, echinocandins, and polyenes) against Candida auris. Methods: Clinical isolates of C. auris were tested in vitro. (PhSe)2 and nikZ activities were tested alone and in combination with amphotericin B, fluconazole, or the echinocandins, micafungin and caspofungin. Results: (PhSe)2 alone was unable to inhibit C. auris, and antagonism or indifferent effects were observed in the combination of this compound with the antifungals tested. NikZ appeared not active alone either, but frequently acted cooperatively with conventional antifungals. Conclusion: Our data show that (PhSe)2 appears to not have a good potential to be a candidate in the development of new drugs to treat C. auris, but that nikZ is worthy of further study.his work was accomplished with support from the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Brazil, within the scope of the Capes-PrInt Program—Financing Code 001info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Anti-Aspergillus fumigatus IgG in patients with bronchiectasis and its relationship with clinical outcome

Aspergillosis is a mycosis, most commonly afecting the airways. This mycosis can worsen the clinical condition of patients with concurrent lung diseases. We assayed for the presence of serum anti-A. fumigatus IgG in bronchiectasis patients from a tertiary hospital in south Brazil and evaluated the relationship with clinical outcome. Thirty-one patients with bronchiec tasis, without cystic fbrosis, were included. Clinical and epidemiological data were collected from all participants. Positive serological tests were detected in 13% (4/31) of the patients. The mortality rate for the year following the assay was, in the seropositive group, 75% (3/4), whereas in the seronegative group, 15% (4/27). An illustrative case is also shown and discussed. Our study highlights the diagnostic challenge and the possible impact of Aspergillus infection on these patients, indicating the necessity of more and larger investigations in the feldinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio

Aspergillus in the “One Health” context: Molecular epidemiology, resistance to azoles and new compounds with antifungal activity against clinical isolates from humans and avian species

Tese de doutoramento em Microbiologia e Parasitologia - Micologia, Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas, 2020Orientação: Melissa Orzechowski Xavier; Co-orientação: Raquel Filipa Pinheiro Sabino (INSA)Tese defendida a 4 de novembro de 2020O contexto "One health" considera a saúde em três pilares: saúde animal, saúde humana e saúde do ecossistema. Nesta abordagem, evidencia-se o papel das mudanças ambientais na emergência de doenças crônicas e infecciosas, e, como forte aliada no desenvolvimento de estratégias de prevenção de doenças. Fungos do gênero Aspergillus se enquadram substancialmente nesta abordagem, tendo em vista sua ubiquidade, bem como sua importância como potenciais patógenos animais e humanos. Além da resistência intrínseca apresentada por algumas espécies, a emergência da resistência a azóis adquirida por isolados de Aspergillus fumigatus sensu stricto é uma preocupação da comunidade científica a nível global. Este trabalho teve como objetivo a avaliação da epidemiologia molecular de isolados clínicos de Aspergillus de aves e humanos do sul do Rio Grande do Sul, Brasil, e avaliar perfil de suscetibilidade e mecanismos de resistência aos azóis. Como resultados, realizamos uma ampla revisão de literatura no contexto One Health, com enfoque no papel da aves como indicador ambiental e na dispersão de cepas de Aspergillus; descrevemos pela primeira vez a aspergilose em albatrozes durante a reabilitação; e descrevemos casos de aspergilose em aves aquáticas de vida livre. Também obtivemos importantes resultados in vitro sobre a atividade antifúngica do composto disseleneto de difenila sozinho e em combinação com antifúngicos clássicos. Em relação a pesquisa de resistências aos azóis em A. fumigatus, não foram detectadas mutações relacionadas ao contexto ambiental da emergência da resistência nessa espécie fúngica na região estudada no Brasil. Além disso, a pesquisa de diversidade genética demonstrou elevada diversidade nos isolados estudados, pelo que se conclui que a técnica utilizada é de grande valia para o acompanhamento clínico dos pacientes, além de permitir confirmar que o ambiente de recuperação de animais é uma potencial fonte de infecção para aves (no caso estudado, pinguins) durante reabilitação. A detecção de um mesmo genótipo em estirpe de A. fumigatus isolado em um paciente humano e um pinguim de vida livre demonstraram a importância de uma abordagem One Health do Aspergillus e da aspergilose, uma vez que uma mesma estirpe possui potencial de colonização/infecção tanto em animais como em humanos. Por fim, como resultado da parceria internacional estabelecida durante o desenvolvimento desse trabalho, tivemos o primeiro reporte da mutação de resistência TR34/L98H em ambiente indoor em Portugal, e o resultado da vigilância em Aspergillus realizada por um laboratório de referência em Portugal, no qual encontrou-se grande prevalência de espécies crípticas de Aspergillus em isolados clínicos e ambientais, além de resistência panazol em estirpes de A. fumigatus, confirmando-se os mecanismos moleculares envolvidos com a resistência antifúngica no gene cyp51A. Os resultados obtidos neste trabalho mostram a importância da abordagem multidisciplinar do Aspergillus e da aspergilose, e a necessidade de ampliar a vigilância de Aspergillus no contexto One Health, com objetivo de entender melhor os mecanismos envolvidos na dispersão de estirpes, e na adoção de medidas mais efetivas de monitoramento da emergência da resistência, bem como para adoção de estratégias de controle do crescimento desse problema global.The "One health" context considers health on three pillars: animal health, human health and ecosystem health. In this approach, the role of environmental changes in the emergence of chronic and infectious diseases is highlighted, and as a strong ally in the development of disease prevention strategies. Fungi of the Aspergillus genus fit substantially in this approach, in view of their ubiquity, as well as their importance as potential animal and human pathogens. In addition to the intrinsic resistance presented by some species, the emergence of azole resistance acquired by isolates of Aspergillus fumigatus sensu stricto is a concern of the scientific community at a global level. This study aimed to evaluate the molecular epidemiology of clinical isolates of Aspergillus from birds and humans from the south of Rio Grande do Sul, Brazil, and to evaluate the susceptibility profile and mechanisms of azole resistance. As a result, we carried out a wide literature review in the context of One Health, focusing on the role of birds as an environmental indicator and on the dispersion of Aspergillus strains; we first described aspergillosis in albatrosses during rehabilitation; and we describe cases of aspergillosis in free-living aquatic birds. We also obtained important in vitro results on the antifungal activity of the diphenyl diselenide compound alone and in combination with classic antifungals. Regarding the search for azole resistance in A. fumigatus, no mutations related to the environmental context of the emergence of resistance in this fungal species in the region studied in Brazil were detected. In addition, genetic diversity research has shown high diversity in the isolates studied, so it is concluded that the technique used is of great value for the clinical monitoring of patients, in addition to confirming that the animal recovery environment is a potential source of infection for birds (in this case, penguins) during rehabilitation. The detection of the same genotype in A. fumigatus strain isolated in a human patient and a freeliving penguin demonstrated the importance of an Aspergillus and aspergillosis One Health approach, since the same strain has both a potential for colonization / infection in animals as in humans. Finally, as a result of the international partnership established during the development of this work, we had the first report of the resistance mutation TR34 / L98H in an indoor environment in Portugal, and the result of surveillance in Aspergillus carried out by a reference laboratory in Portugal, in which a high prevalence of cryptic species of Aspergillus was found in clinical and environmental isolates, in addition to pan-azole resistance in A. fumigatus strains, confirming the molecular mechanisms involved with antifungal resistance in the cyp51A gene. The results obtained in this work show the importance of the multidisciplinary approach of Aspergillus and aspergillosis, and the need to expand the surveillance of Aspergillus in the context of One Health, in order to better understand the mechanisms involved in the dispersion of strains, and in the adoption of more effective measures to monitoring the emergence of resistance, as well as the adoption of strategies to control the growth of this global problem.International Cooperation Program financed by Brazilian Federal Agency for Support and Evaluation of Graduate Education within the Ministry of Education of Brazil (CAPES), under the PDSE Program - Finance Code 001.N/

Curve of blood parameters and weight in (Spheniscus magellanicus) (Foster, 1781) Magellanic penguins with aspergillosis during rehabilitation

Basic blood parameters and body weight are routinely used to monitor the general condition of Magellanic penguins in rehabilitation, including being considered criteria for release in accordance with established protocols. However, studies showing the variation of these parameters during the development of aspergillosis in these animals is not known. Thus, this study aimed to determine the curve of weight, hematocrit (Ht) and total plasma proteins (PPT) in penguins with aspergillosis. The study of retrospective case-control was carried out with penguins during rehabilitation at Centro de Recuperação de Animais Marinhos (CRAM-FURG) in Rio Grande, Rio Grande do Sul, Brazil, which were classified into two groups: the case group composed by penguins with aspergillosis, confirmed post mortem from necroscopic findings associated with microbiological culture and histopathology, and the control group consisted by healthy penguins, which were released. For the determination of the curves, data were collected from nine sequential samples, performed on average every seven days for a maximum period of 81 days, which underwent to analysis of variance (ANOVA) with post-hoc Bonferroni. A total of 140 animals were studied (cases 50% and 50% control). Penguins with aspergillosis were significantly different from the control group in all analyzed parameters. The average weight in the first collection was 2.747g in the case group, and 2.875g in the control group. Animals with aspergillosis showed a lower mean weight than animals released throughout the rehabilitation. The weight gain of the animals with aspergillosis occurred only in the first three collections, with stabilization or weight loss in later collections until the last collection. Regarding the hematocrit (Ht) the average value in the first collection, was 38% and 44% in the case and control groups, respectively. In the group of penguins with aspergillosis a progressive decline was detected in the curve of Ht values throughout the rehabilitation period, which remained below of the lower reference limit for the specie (42% ± 4%) from the third until the last collection, while the control group had values within the reference for the specie in all samples. The first collection of PPT data showed a similar average value of 6.4g/dL and 6g/dL, between case and control groups, respectively. However, the analysis of the curve of the group with aspergillosis showed progressive increase of these values throughout the rehabilitation, reaching an average of 10,3g / dL in the ninth collection, unlike the control group, which remained stable since the sixth collection, values between 7.9 and 8 g / dL. In this work we can see that these parameters besides being penguins criteria for release can also be used as indicators of potentially infected animals, as a result of the curves generated from the analysis showed significant differences in penguins group with aspergillosis when compared with healthy animals. The establishment of this profile can be used as parameters for early preemptive therapy for aspergillosis or more specific diagnosis.Sem bolsaParâmetros sanguíneos básicos e peso corpóreo são rotineiramente utilizados para monitoramento do estado geral de Pinguins-de-Magalhães em reabilitação, sendo inclusive considerados critérios para liberação de acordo com protocolos estabelecidos. No entanto, estudos mostrando o perfil de variação destes parâmetros durante o desenvolvimento da aspergilose nestes animais não são conhecidos. Neste sentido, este trabalho objetivou determinar curva de peso, de hematócrito (Ht) e de proteínas plasmáticas totais (PPT) em pinguins com aspergilose. O estudo do tipo caso-controle retrospectivo foi realizado com pinguins em reabilitação no Centro de Recuperação de Animais Marinhos, (CRAM-FURG) em Rio Grande, Rio Grande do Sul, Brasil, os quais foram classificados em dois grupos, sendo o grupo caso composto por pinguins com aspergilose, confirmada post mortem a partir de achados necroscópicos associados ao cultivo microbiológico e a histopatologia, e o grupo controle composto por pinguins sadios, que foram liberados. Para a determinação das curvas, foram coletados dados de nove amostras sequenciais, realizadas em média a cada sete dias, durante um período máximo de 81 dias, sendo estes submetidos a análise de variância (ANOVA) com teste post-hoc de Bonferroni. Ao todo, 140 animais foram estudados (50% casos e 50% controles). Pinguins com aspergilose diferiram significativamente do grupo controle em todos os parâmetros analisados. O peso médio, na primeira coleta foi de 2.747g no grupo caso e 2.875g no grupo controle. Os animais com aspergilose apresentaram média de peso menor que animais liberados ao longo de toda a reabilitação. O ganho de peso dos animais com aspergilose ocorreu somente nas três primeiras coletas, com estabilização ou perda de peso nas coletas posteriores, até seu desfecho. Em relação ao hematócrito (Ht) o valor médio na primeira coleta, foi de 38% e 44% nos grupos caso e controle, respectivamente. No grupo de pinguins com aspergilose foi detectado um declínio progressivo na curva dos valores de Ht ao longo do período de reabilitação, os quais permaneceram abaixo do limite inferior de referência para a espécie (42% ± 4%) desde a terceira coleta até seu desfecho, enquanto o grupo controle apresentou valores dentro da referência para a espécie em todas as coletas. A primeira coleta de dados de PPT demonstrou um valor médio similar, de 6,4g/dL e 6g/dL, entre os grupos caso e controle, respectivamente. No entanto, na análise da curva, o grupo com aspergilose apresentou aumento progressivo desses valores durante toda a reabilitação, alcançando um valor médio de 10,3g/dL na nona coleta, diferentemente do grupo controle, que permaneceu estável a partir da sexta coleta, com valores entre 7,9 e 8g/dL. Neste trabalho podemos observar que estes parâmetros, além de serem critérios para liberação de pinguins também podem ser utilizados como indicadores de animais potencialmente infectados, uma vez que o resultado das curvas geradas a partir das análises mostraram diferenças pontuais no grupo de pinguins com aspergilose quando comparado com animais sadios. O estabelecimento desse perfil pode servir como parâmetro para início de terapia preemptiva para aspergilose ou de investigação diagnóstica mais específica

PCR ESPÉCIE-ESPECÍFICO PARA O DIAGNÓSTICO DE ESPOROTRICOSE CAUSADA POR S. BRASILIENSIS

Despite thousands of sporotrichosis cases related to the zoonotic transmission of Sporothrix brasiliensis have been described, the diagnostic gold standard is still the classical culturing methods. The mycological culture results are available afterseven to 30 days of incubation. Since an early diagnosis contributes to improving thetreatment and to the spread control of this mycosis, studies evaluating faster diagnosticmethods are needed. Therefore, we aimed to evaluate the species-specific PCR for thesporotrichosis diagnosis caused by S. brasiliensis, using samples collected with a noninvasive technique. Seventy-four swabs from feline (n=64), canine (n=5), and human(n=5) suspect sporotrichosis cases were included. All samples were submitted to classicalmethods for diagnosis and to S. brasiliensis-specific PCR. Using mycological culture asthe gold standard, the diagnosis of S. brasiliensis-caused infection was confirmed in 69%(51/74) of the cases. PCR was positive in 30 out of these 51 cases, showing 59%sensitivity, 100% specificity, 72% accuracy, 100% positive predictive value, and 52%negative predictive value. Consequently, more studies are needed to elucidate theinterference factors that culminated with the high rate of false-negative results and thenoptimize this molecular test for the accurate diagnosis of infections caused by S.brasiliensis.Apesar de milhares de casos de esporotricose relacionados a transmissão zoonótica por Sporothrix brasiliensis venham sendo descritos, o diagnóstico padrão-ouro ainda é a partir do método clássico de cultura. O resultado da cultura micológica demora de sete a trinta dias para ficar disponível. Considerando que o diagnóstico precoce contribuiria para um tratamento prematuro e com isso, com o controle na disseminação desta micose, estudos avaliando um diagnóstico precoce são necessários. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar o PCR espécie-específico para o diagnóstico da esporotricose causada por S. brasiliensis, utilizando amostras coletas por uma técnica não invasiva. Foram incluídas setenta e quatro amostras de casos suspeitos de esporotricose (swabs) oriundos de felinos (n=64), caninos (n=5) e humanos (n=5). Todas as amostras foram submetidas ao método clássico de diagnóstico e ao PCR específico para S. brasiliensis. Utilizando a cultura micológica como padrão-ouro, o diagnóstico da infecção causada por S. brasiliensis foi confirmado em 69% (51/74) dos casos. O PCR foi positivo em 30 dos 51 casos, demonstrando 59% de sensibilidade, 100% de especificidade, 72% de acurácia, 100% de valor preditivo positivo e 52% de valor preditivo negativo. Consequentemente, mais estudos são necessários para elucidar os fatores de transferência que culminaram com a alta taxa de resultados falsos negativos e então otimizar este teste molecular para a acurácia diagnóstica para infecções causadas por S. brasiliensis