Aspiração folicular em vacas Bos taurus e Bos indicus e vitrificação dos oócitos em condições de campo

The aim of this study was to evaluate the viability of cryopreservation of bovine oocytes from Bos taurus and Bos indicus cows, at field conditions. The average rate of oocyte recovered by Ovum Pick up (OPU) from Bos taurus taurus cows (Devon) or Bos taurus indicus cows (Nelore), and the embryo development after vitrification were determined. After 60 sessions, an average rate of 4.6 oocytes/session was obtained from Devon cows. This number was significantly lower than the 16.3 oocytes obtained from Nelore cows, in 12 sessions. Selected recovered oocytes were vitrified in 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose, in TCM 199 medium, with open pulled straws (OPS) technology, and stored in a cryogenic container. Just after warmed, oocytes were submitted to standard in vitro maturation, fertilization and culture in the laboratory. There were no differences in cleavage rates obtained from Devon cows oocytes (17.6%) and Nelore cows oocytes (29.1%). Evaluation of embryo development resulted in only one blastocyst obtained from Devon cows. Data from this study showed that Bos taurus indicus cows had higher oocytes recovery rates when compared with Bos taurus taurus, and that association of OPU with oocytes vitrification at farm conditions resulted in unsatisfactory indexes of embryo development, regardless of cow breed.Com o objetivo de avaliar a viabilidade da criopreservação de oócitos de fêmeas taurinas e zebuínas em condição de campo, este estudo determinou a taxa média de oócitos obtidos por punção folicular in vivo (OPU) de fêmeas bovinas Bos taurus taurus (Devon) e Bos taurus indicus (Nelore), bem como o desenvolvimento embrionário após a vitrificação destes oócitos. Em 60 sessões, obteve-se média de 4,6 oócitos por sessão de OPU nas vacas Devon, número significativamente inferior aos 16,3 oócitos obtidos nas vacas Nelore, em 12 sessões. Os oócitos selecionados foram vitrificados em solução de 20% de EG + 20% de DMSO + 0,5 M de sacarose, em meio TCM 199, utilizando-se palhetas estiradas (OPS). O reaquecimento foi efetuado em laboratório, seguindo-se a maturação, fecundação e cultivo in vitro. As taxas de clivagem obtidas foram 17,6% no grupo de vacas Devon e 29,1% no grupo Nelore, não havendo diferença significativa entre as mesmas. Na avaliação do desenvolvimento embrionário, obteve-se apenas um blastocisto no grupo Devon. Concluiu-se que fêmeas zebuínas (Nelore) proporcionam maior taxa de oócitos recuperados por sessão em relação às fêmeas taurinas (Devon), e que a associação da OPU com a vitrificação dos oócitos na própria fazenda não proporciona taxas aceitáveis de desenvolvimento embrionário, independente da origem dos animais

Embriões bovinos PIV vitrificados em diferentes soluções crioprotetoras com ou em o uso de nitrogênio super-resfriado

O total aproveitamento de embriões PIV ainda depende de uma metodologia eficiente de criopreservação. Este estudo avaliou a taxa de eclosão de embriões bovinos PIV, vitrificados em OPS usando três diferentes soluções crioprotetoras (Experimento 1) e o emprego de nitrogênio normal (-196°C) ou super-resfriado (-210°C) (Experimento 2). No primeiro experimento (12 repetições) 576 blastocistos expandidos (Bx) PIV foram aleatoriamente alocados em 4 grupos: G1 (20% EG + 20% DMSO), G2 (25% EG + 25% GLI), G3 (20% EG + 20% PRO) e G4 (controle não vitrificado). Após 72 horas de cultivo in vitro, a taxa de eclosão do grupo controle (84,0%) foi superior às observadas nos grupos vitrificados (

PLASMA RICO EM PLAQUETAS E CÉLULAS TRONCO NO TRATAMENTO DE DESMOPATIA DOS LIGAMENTOS COLATERAIS DISTAIS EM EQUINO

Horses are animals widely used in sporting events and are therefore prone to accidents that can lead to joint and bone injuries. In the clinical routine, devices such as the use of X-ray and ultrasound are of great importance for the correct diagnosis to be made and the clinical conduct can be better planned. In addition, some biomaterials such as platelet-rich plasma (PRP) and mesenchymal stem cells (MSCs) have been included in the therapeutic protocols, demonstrating great effectiveness in the treatment of this type of injury due to the large amount of growth factors present in both biomaterials. PRP is a blood derivative, characterized by high platelet concentration. It is produced from two centrifugations, the first to separate plasma from red blood cells and the second to concentrate platelets. MSCs were isolated from adipose tissue, cultured, transported and applied autologously, as well as PRP. In the present report, an 8-year-old female Brazilian equestrian horse was diagnosed with desmopathy in the collateral ligaments of the distal interphalangeal joint and was treated with PRP and MSCs in an associated and sequential manner. A significant improvement in the clinical picture was found in comparison to the data found in the literature, demonstrating great potential of the associated use of PRP and MSCs in the treatment of ligament injuries.Os equinos são animais muito utilizados em eventos esportivos, sendo, desta forma, propensos a sofrer acidentes que podem levar a lesões articulares e ósseas. Na rotina clínica, artifícios como o uso de raio X e ultrassonografia são de grande importância para que o correto diagnóstico seja feito e a conduta clínica possa ser melhor planejada. Além disso, alguns biomateriais, como o plasma rico em plaquetas (PRP) e células-tronco mesenquimais (CTMs), têm se inserido nos protocolos terapêuticos, demonstrando grande efetividade no tratamento desse tipo de lesão, devido à grande quantidade de fatores de crescimento presentes em ambos os biomateriais. O PRP é um derivado sanguíneo, caracterizado pela alta concentração plaquetária. Foi produzido a partir de duas centrifugações, a primeira para separar o plasma das hemácias e a segunda para concentrar as plaquetas. As CTMs foram isoladas de tecido adiposo, cultivadas, transportadas e aplicadas de forma autóloga, assim como o PRP.  No presente relato, um equino, fêmea, Brasileiro de Hipismo com 8 anos, foi diagnosticado com desmopatia nos ligamentos colaterais da articulação interfalângica distal e foi tratado com PRP e CTMs, de forma associada e sequencial. Foi encontrada uma melhora do quadro clínico, significativa, em comparação aos dados encontrados na literatura, demonstrando grande potencialidade do uso associado de PRP e CTMs no tratamento de lesões ligamentares

Producción in vitro y expresión génica de IGF-I e IGF-II en embriones de hembras Nelore sometidas a administraciones de somatotropina recombinante bovina

Com o presente trabalho, objetivou-se estudar a influência da somatotropina recombinante bovina (rbST) sobre a quantidade e qualidade de oócitos aspirados in vivo, produção embrionária e expressão gênica dos fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs) tipos I e II em embriões produzidos in vitro de fêmeas bovinas da raça Nelore. Cinco vacas foram tratadas com duas administrações de 2mL de solução salina como placebo, com intervalo de catorze dias entre elas, sendo a primeira administração realizada dezenove e a segunda cinco dias antes das aspirações foliculares; decorridos trintas dias destas aspirações, em sistema crossover, o mesmo protocolo foi utilizado nesses cinco animais sendo, neste caso, a solução salina substituída por 500mg de rbST, com o intuito de efetuar-se comparações entre os tratamentos. A partir dos oócitos recuperados, realizou-se a produção in vitro de embriões (PIVE), sendo todas as etapas que envolvem este processo analisadas e com posterior realização de reações em cadeia da polimerase em tempo real (qPCRs) para expressões gênicas de IGF-I e IGF-II nos blastocistos produzidos. Observou-se que a rbST, ainda que numericamente tenha influenciado positivamente sobre os parâmetros estudados, não exerceu influência significativa sobre a quantidade e qualidade de oócitos aspirados in vivo, produção embrionária e expressão gênica de IGF-I e IGF-II em embriões produzidos in vitro de fêmeas bovinas da raça Nelore.The present work aimed of studying the influence of recombinant bovine somatotropin (rbST) on quantity and quality of in vivo aspirated oocytes, embryo production and gene expression of insulin-like growth factors (IGFs) types I and II in in vitro produced embryos from bovine females of Nelore breed. Five cows were treated with two administrations of 2mL of saline solution as placebo, with an interval of 14 days between them, being the first administration held 19 and the second 5 days before follicular aspirations; within 30 days after these aspirations, in a crossover design, the same protocol was used in these five animals being, in this case, the saline solution replaced by 500mg of rbST in order to perform comparisons between treatments. From retrieved oocytes, in vitro production (IVP) was performed, being all stages involving this process evaluated with subsequent achievement of polymerase chain reactions in real time (qPCRs) for gene expression of IGF-I and IGF-II in produced blastocysts. It was observed that the rbST, although having a numerical increase, did not show significant influence, on the parameters studied, on the quantity and quality of in vivo aspirated oocytes, embryo production and gene expression of IGF-I and IGF-II in in vitro produced embryos from bovine females of Nelore breed.Este estudio tuvo como objetivo estudiar la influencia de la somatotropina recombinante bovina (rbST) en la cantidad y calidad de los ovocitos aspirados in vivo, la producción embrionaria y la expresión génica de los factores de crecimiento insulínicos (IGFs) tipos I y II en embriones producidos in vitro a partir de Nelore hembras bovinas. Se trataron cinco vacas con dos administraciones de 2mL de solución salina como placebo, con un intervalo de catorce días entre ellas, siendo la primera administración diecinueve y la segunda cinco días antes de las aspiraciones foliculares; a los treinta días de estas aspiraciones, en un sistema cruzado, se utilizó el mismo protocolo en estos cinco animales, en cuyo caso se sustituyó la solución salina por 500mg de rbST, con el fin de realizar comparaciones entre tratamientos. A partir de los ovocitos recuperados se llevó a cabo la producción de embriones in vitro (PIVE), analizándose todas las etapas de este proceso y con la posterior realización de reacciones en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCRs) para IGF-I e IGF-II en los blastocistos producidos. Se observó que la rbST, aunque numéricamente influyó positivamente en los parámetros estudiados, no tuvo una influencia significativa en la cantidad y calidad de ovocitos aspirados in vivo, producción embrionaria y expresión génica de IGF-I e IGF-II en embriones producidos in vitro de hembras bovinas Nelore

Development of caprine preantral follicles after orthotopic autotransplantation of ovarian tissue

Objective: The aim of this study was to evaluate the follicle morphology, density, development and hormone production after orthotopic autransplantation of fresh or vitrified goat ovarian tissue. Methods: Fresh and vitrified ovarian cortex was orthotopically autotransplanted for six months in two and three adults bilaterally ovariectomized goats, respectively. The animals were monitored during 196 days and blood samples collected. Results: It was observed that the percentage of morphologically normal preantral follicles (MNPF) after grafting of fresh ovarian tissue was similar to control. The follicular density in the fresh graft reduced significantly when compared to fresh control. unfortunately, after transplantation of vitrified tissue it was not possible to identified any follicles after recovery. Furthermore, the proportion of developing follicles was higher (P < 0.05) in the fresh auto-grafts than in control fragments. Moreover, progesterone plasma levels increased significantly from day 179 to day 195 of transplantation. Conclusion: In conclusion, orthotopic transplantation of fresh ovarian tissue was able to keep healthy the preantral follicles, as well as the restoration of goat endocrine function

Addition of heterologous seminal plasm as a strategy to inverse the frozen ovine semen fertility

O uso de sêmen congelado é um pré-requisito para maximizar o ganho genético oriundo da IA em ovinos. Muito embora a IA com sêmen fresco ou resfriado esteja consolidada, com sêmen congelado os resultados são inconsistentes. O uso de plasma seminal (PS) já foi demonstrado como eficaz na proteção e reversão de parte dos danos celulares causados pela criopreservação. Entretanto, o pequeno volume do ejaculado e o risco de transmissão de doenças espécie-específicas são limitações importantes nos ovinos. Uma alternativa a ser considerada é o uso de PS heterólogo, que pela escassez de informações disponíveis, justificam a execução deste estudo, cujos objetivos foram: (a) determinar a capacidade do PS eqüino (PSE) e bovino (PSB) em preservar a viabilidade do sêmen ovino descongelado, comparando-os com o PS ovino (PSO); (b) avaliar o perfil eletroforético das proteínas presentes no PSO, PSE e PSB, e adicionalmente; c) quantificar e comparar o nível de fragmentação do DNA de espermatozóides incubados ou não com PSO, PSE ou PSB. Para tanto, três experimentos foram conduzidos, sendo: Experimento 1: Sêmen descongelado diluído em meio sem PS (SPS) ou contendo 25% de PSO, PSE ou PSB, com exposição por um período de 5 min ou 6 h. Avaliou-se a motilidade, integridade de membrana plasmática e proporção de espermatozóides vivos. No Experimento 2 avaliou-se a concentração protéica total encontrada no PSO, PSE e PSB, bem como o perfil eletroforético das proteínas presentes, mediante SDS-PAGE. No Experimento 3 foi validada uma técnica para a avaliação da integridade do DNA espermático (Neutral Comet Assay - NCA), procedendo-se a avaliação de todos os tratamentos testados nos experimentos anteriores, além dos tratamentos: sêmen descongelado (SD), sêmen fresco (SF) e um controle positivo (CP). Adicionalmente foi avaliado o efeito da técnica de seleção espermática swim up sobre os achados de fragmentação de DNA pelo NCA. A análise estatística foi realizada com o pacote do SAS ou do Minitab, com nível de significância de 5%. Como resultados, observou-se que a exposição por 5 min. em PSO, PSE ou PSB teve efeito benéfico sobre os parâmetros de viabilidade avaliados. A incubação por 6 h reduziu (P<0,05) a motilidade espermática nos tratamentos PSE e PSO, em relação ao SPS e PSB. A integridade de membrana plasmática não foi afetada pelo tratamento. A concentração protéica total no PSO, PSE e PSB foi 16,8, 3,0 e 25,0 &#956;g/&#956;L, respectivamente. O PSO e PSB demonstraram padrões eletroforéticos semelhantes, enquanto o PSE apresentou um perfil distinto. A menor viii fragmentação de DNA com 1 h de incubação foi obtida com o grupo SF, não havendo diferença entre os demais grupos. Com 6 h de incubação, os grupos SPS (63%) e SD (70%) demonstraram maior fragmentação que o tratamento SF (50%), não havendo diferenças entre os tratamentos PSO (60%), PSE (52%) e PSB (55%). Não foi observado efeito da técnica de seleção swim up na fragmentação do DNA, avaliada pelo NCA. Conclui-se que o PS heterólogo pode ser utilizado em substituição ao PSO, mesmo apresentando perfil protéico distinto. Entretanto, a viabilidade espermática foi influenciada pelo tempo de incubação. Em adição, as modificações adotadas no método Neutral Comet Assay possibilitaram sua validação para o sêmen ovino. Por final, o sêmen ovino apresenta uma elevada taxa de fragmentação de DNA, que não difere entre os espermatozóides selecionados ou não pelo método swim u

Application of a cost-effective DNA extraction protocol for screening transgenic and CRISPR-edited primary goat cells.

The genotyping of genetically-modified cells is a crucial step in studies of transgenics and genomic editing with systems such as CRISPR/Cas. The detection of genome editing events can be directly related to the genotyping methodology used, which is influenced by its costs, since many experiments require the analysis of a large number of samples. The aim of this study was to compare the performance of direct lysis methods of genomic DNA (gDNA) extraction for the detection of knockins and knockouts in primary goat cells. Initially, three gDNA extraction protocols (protocol A, heat denaturation/freeze-thaw in water; protocol B, heat denaturation/proteinase K; and protocol C, CellsDirect Kit) were tested using different quantities (1,000, 5,000 and 10,000 cells) and types of goat primary cells (fibroblasts and goat mammary epithelial cells-GMECs) for subsequent validation by PCR amplification of small (GAPDH) and large amplicons (hLF transgene). All protocols were successful in the detection of the small amplicon; however, in GMECs, only protocol B resulted efficient amplification (protocol A-0%, protocol B-93%, protocol C-13.33%, P <0.05). In a proof-of-principle experiment, the TP53 gene was knocked out in GMECs by CRISPR/Cas9-mediated deletion while constructs containing the anti-VEGF monoclonal antibody (pBC-anti-VEGF) and bacterial L-Asparaginase (pBC-ASNase) transgenes were knocked-in separately in fibroblasts. Detection of successful editing was performed using protocol B and PCR. The integration rates of the pBC-ASNase and pBC-anti-VEGF transgenes were 93.6% and 72%, respectively, as per PCR. The efficiency of biallelic editing in GMECs using CRISPR/Cas9 for the TP53 deletion was 5.4%. Our results suggest that protocol B (heat denaturation/proteinase K) can be used as an inexpensive and quick methodology for detecting genetic modifications in different types of primary goat cells, with efficiency rates consistent with values previously described in the literature when using extraction kits or more complex proteinase K formulations

Uso de plasma rico em plaquetas para o tratamento de lesão traumática em região cervical cranial em equino - Relato de caso

Equinos são animais muito utilizados em eventos esportivos, sendo, desta forma, propensos a sofrer acidentes que podem que levar a lesões, como traumas na coluna vertebral. Equinos que sofrem estes acidentes podem apresentar variados sinais clínicos, incluindo sinais neurológicos, caso haja dano na medula espinhal. Para diagnóstico dessas lesões, técnicas como radiografia e ultrassonografia auxiliam na identificação da gravidade e localização do dano. No presente relato, uma fêmea equina, aos 10 anos, foi submetida a exames de raio x e diagnosticada com luxação de cervical cranial, com fratura e fragmentos ósseos dispersos pela musculatura. Aos 17 anos, passou por uma avaliação física, na qual apresentou dor e sensibilidade à palpação que se estendia da cervical a lombar e por novos exames radiográficos, indicando presença dos fragmentos ósseos e luxação da articulação C1-C2. No tratamento, foram utilizados anti-inflamatórios esteroides associados à aplicação de plasma autólogo rico em plaquetas no local da lesão, um bioproduto rico em fatores de crescimento plaquetários que intensificam o processo de cura natural do organismo. Resultando em uma melhora no quadro clínico do animal

Development of caprine preantral follicles after orthotopic autotransplantation of ovarian tissue

Objective: The aim of this study was to evaluate the follicle morphology, density, development and hormone production after orthotopic autransplantation of fresh or vitrified goat ovarian tissue. Methods: Fresh and vitrified ovarian cortex was orthotopically autotransplanted for six months in two and three adults bilaterally ovariectomized goats, respectively. The animals were monitored during 196 days and blood samples collected. Results: It was observed that the percentage of morphologically normal preantral follicles (MNPF) after grafting of fresh ovarian tissue was similar to control. The follicular density in the fresh graft reduced significantly when compared to fresh control. unfortunately, after transplantation of vitrified tissue it was not possible to identified any follicles after recovery. Furthermore, the proportion of developing follicles was higher (P < 0.05) in the fresh auto-grafts than in control fragments. Moreover, progesterone plasma levels increased significantly from day 179 to day 195 of transplantation. Conclusion: In conclusion, orthotopic transplantation of fresh ovarian tissue was able to keep healthy the preantral follicles, as well as the restoration of goat endocrine function