Inter-molekulare Lokalisation der ATP-Bindungstasche in P2X-Rezeptoren durch Disulfid-Quervernetzung Cystein-substituierter Aminosäuren

Die trimeren P2X–Rezeptoren sind nicht–selektive Kationenkanäle, die durch Adenosintriphosphat (ATP) aktiviert werden. Es gibt sieben Untereinheiten (P2X1–7). P2X–Rezeptoren sind in nahezu jedem Gewebe exprimiert und dort an den verschiedensten physiologischen Vorgängen beteiligt. Neben den „Cys–Loop“–Rezeptoren und den ionotropen Glutamat–Rezeptoren stellen die P2X–Rezeptoren eine eigenständige Familie von Neurotransmitter–gesteuerten Rezeptoren dar. Eine Untereinheit der trimeren P2X–Rezeptoren besteht aus den intrazellulären N– und C–Termini und zwei Transmembrandomänen, die über eine große extrazelluläre Domäne verbunden sind. Da weder ein P2X–homologes lösliches Protein für Kristallisationsstudien noch ein Gewebe zur Aufreinigung großer Mengen von P2X–Rezeptorprotein zur Verfügung steht, stützen sich Struktur–Funktions–Studien auf einzelpunktmutierte Rezeptoren in heterologen Expressionsystemen. Einige Aminosäuren, die bei Austausch gegen Alanin eine deutliche Verschiebung der Dosis–Wirkungs–Kurve von ATP bewirken und von denen daher vermutet wird, dass sie an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, wurden bereits identifiziert. Ob sich die Agonisten–Bindungstasche der P2X–Rezeptoren zwischen zwei Untereinheiten, wie bei den nikotinischen Acetylcholin–Rezeptoren, oder innerhalb einer Untereinheit, vergleichbar mit den ionotropen Glutamat–Rezeptoren, befindet, ist weitgehend ungeklärt. Um die Lokalisation der ATP–Bindungstasche zu bestimmen, wurden, basierend auf vorhandener Literatur, potenziell an der ATP–Bindung beteiligte Aminosäuren des P2X1–Rezeptors durch zielgerichtete Mutagenese gegen Cysteine ausgetauscht und die P2X–Rezeptormutanen in Xenopus laevis–Oozyten exprimiert. Das Ziel dabei war, quervernetzte Cystein–Mutanten durch Disulfidbrückenbildung zwischen den substituierten Cysteinen zu identifizieren und so die Distanz von Aminosäure–Seitenketten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, zu bestimmen. Für die biochemischen Untersuchungen wurden entweder alle neu gebildeten Proteine der Oozyten metabolisch durch Inkubation mit radioaktivem [35S]–Methionin oder selektiv die Plasmamembran– ständigen Proteine mit Sulfo–NHS–Fluoreszenz–Farbstoffen markiert. Die Rezeptormutanten wurden affinitätschromatographisch über ein N–terminales Hexahystidyl–Motiv unter nicht–denaturierenden Bedingungen aufgereinigt und mit nicht–reduzierender SDS–Polyacrylamid–Gelelektrophorese (PAGE) auf Expression sowie mit Blauer–Nativer–PAGE auf korrekte Trimerisierung überprüft. Darüber hinaus wurden homologe Cystein–Substitutionen einer P2X2–1–Chimäre, welche dieselben Bindungseigenschaften des P2X1–Rezeptors besitzt, mittels der Zwei–Elektroden–Spannungsklemme charakterisiert (TEVC). Die Koexpression der verschiedenen P2X–Mutanten ergab eine spontane Quervernetzung über Disulfidbrücken zwischen den P2X1 K68C– und F291C–Mutanten, die in nicht–reduzierenden SDS–PAGE–Gelen über eine Dimerbildung nachgewiesen werden konnte. Dies deutet auf eine geringe Distanz zwischen diesen Cystein–substituierten Aminosäuren hin. Die Ausbildung der Disulfidbrücke konnte nach Reduktion der Quervernetzung während der Aufreinigung und durch Zugabe von ATP verhindert werden. In funktionellen Studien der P2X2–1 K68C/F291C–Doppelmutante war es entsprechend möglich die Disulfidbrücke reversibel zu reduzierenden. In den Mutantenkanäle exprimierenden Xenopus–Oozyten wurde der geringe Rezeptorstrom durch Reduktion mit DTT ca. 60fach potenziert und dadurch überhaupt messbar gemacht. Die Reoxidation durch H2O2 wurde wie in den biochemischen Experimenten in Anwesenheit von ATP ebenfalls verhindert. Da die Aminosäuren K68 und F291 des P2X1–Rezeptors möglicherweise an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, sind diese Ergebnisse die ersten direkten experimentellen Hinweise auf die Aposition von Domänen benachbarter Untereinheiten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind. Demnach befindet sich die ATP–Bindungstasche an der Grenzfläche zwischen zwei Untereinheiten der P2X–Rezeptoren. Die Koexpression homologer Cystein–substituierter P2X2–, P2X3– und P2X4–Rezeptoren zeigte analog zu den P2X1–Experimenten eine spontane Dimerisierung der P2X2 K69C– und F289C–Mutanten. Eine mäßige Quervernetzung von zwei Untereinheiten der P2X3 K63C– und F280C– sowie der P2X4 K67C– und F294C–Mutanten konnte nach Anwendung einer ca. 0,5 nm langen Cystein–spezifischen quervernetzenden Substanz erreicht werden. Die paarweise Kombination der P2X1–, P2X2–, P2X3–und P2X4–Cystein–Mutanten zeigte selbst nach Anwendung quervernetzender Substanzen nur in der Kombination von P2X1–K68C und P2X2–F289C eine Quervernetzung von zwei unterschiedlichen Untereinheiten eines heteromeren P2X1/2–Rezeptors. Diese Kombination konnte in elektrophysiologischen Messungen durch Reduktion der Disulfidbrücke spezifisch messbar gemacht und somit die Heteromerisierung dieser Untereinheiten eindeutig aufgezeigt werden. Zusammenfassend deutet die geringe Distanz der an der Quervernetzung beteiligten Cystein–Mutationen der P2X1–, P2X2– und homomeren P2X1/2–Rezeptoren auf ein konserviertes strukturelles Motiv dieser P2X–Subtypen hin, welches in P2X3– und P2X4–Rezeptoren nicht konserviert zu sein scheint. Diese Ergebnisse liefern wichtige Hinweise auf die generelle Struktur der P2X–Rezeptoren und werden maßgeblich zur Interpretation einer zukünftigen Kristallstruktur beitragen

Conocimiento sobre voluntad anticipada en pacientes de instituciones públicas de salud de México

El capítulo pertenece al libro Educación actual. Entre el pasado y el futuro de la Colección CiECAL de Educación, Ciencias Sociales, Humanidades, Salud, Creación, Pensamiento complejo, Transdisciplinariedad y Pensamiento conjunto. Perteneciente al Centro Internacional de Estudios Comparados de América Latina (CIECAL) en conjunto con el Centro de Investigación de Estudios Comparados de América Latina; el Instituto de Estudios Histórico y Económicos, con sede académica en la Universidad Complutense de Madrid y la editorial Albahaca Publicaciones, de Madrid y en colaboración con el Programa Académico de Complejidad Social del Centro de la Complejidad de la Universidad Nacional Autónoma de México.El objetivo de esta investigación es describir el conocimiento que pacientes de consulta externa de instituciones públicas de salud tienen sobre voluntad anticipada. El estudio se realizó en cuatro instituciones ubicadas en la zona sur-oriente del Estado de México. Participaron 806 pacientes, de 18 años o más de edad. Se recabó información sociodemográfica. Se utilizaron dos cuestionarios, uno con preguntas relacionadas con definición, legislación, suscripción y disposición a redactarlo; y otro dividido en bloques temáticos. Los resultados muestran que 95.3% de los participantes desconoce qué es voluntad anticipada, 98.8% desconoce sobre la legislación correspondiente, ninguno ha tramitado un documento de voluntad anticipada y 67.0% estaría dispuesto a realizarlo. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas por institución, en la proporción de pacientes que conoce qué es voluntad anticipada. Puede concluirse que existe un desconocimiento generalizado sobre voluntad anticipada; sin embargo, existe una amplia disposición a redactar un documento de este tipo

2021-2022 Master Class - Domingo Pagliuca (Trombone)

https://spiral.lynn.edu/conservatory_masterclasses/1236/thumbnail.jp

Effect of Bovine Plasma Protein on Autolysis and Gelation of Protein Extracted from Giant Squid (Dosidicus gigas) Mantle

The effect of bovine plasma protein (BPP) on the inhibition of autolytic activity and its effect on the gelling properties of a protein concentrate (PC) obtained from jumbo squid (Dosidicus gigas) mantle were investigated. Sols and gels were prepared from the PC by adding different amounts of BPP (0, 1, and 2%). Dynamic oscillatory measurements indicated that systems with 1% BPP had a higher elastic modulus ( ), in which hydrophobic interactions were favored. Concerning the technological and textural quality of the gels, BPP caused a greater water holding capacity (WHC), force, cohesiveness, and elasticity, probably due to improvement of the electrostatic and hydrophobic interactions during gel formation. Scanning electron microscopy (SEM) allowed visualization of the formation of more rigid and ordered gels with less porosity when BPP was added. Therefore, the addition of BPP improved the gelling capacity of proteins extracted from giant squid

Evolving Horizons in Radiation Therapy Auto-Contouring: Distilling Insights, Embracing Data-Centric Frameworks, and Moving Beyond Geometric Quantification

Historically, clinician-derived contouring of tumors and healthy tissues has been crucial for radiation therapy (RT) planning. In recent years, advances in artificial intelligence (AI), predominantly in deep learning (DL), have rapidly improved automated contouring for RT applications, particularly for routine organs-at-risk.1, 2, 3 Despite research efforts actively promoting its broader acceptance, clinical adoption of auto-contouring is not yet standard practice. Notably, within several AI communities, there has been growing enthusiasm to shift from conventional “model-centric” AI approaches (ie, improving a model while keeping the data fixed), to “data-centric” AI approaches (ie, improving the data while keeping a model fixed).4 Although balancing both approaches is typically ideal for crafting the optimal solution for specific-use cases, most research in RT auto-contouring has prioritized algorithmic modifications aimed at enhancing quantitative contouring performance based on geometric (ie, structural overlap) indices5—a clear testament to the “model-centric” AI paradigm. In this editorial, aimed at clinician end-users and multidisciplinary research teams, we harmonize key insights in contemporary RT auto-contouring algorithmic development to promote the adoption of data-centric AI frameworks for impactful future research directions that would further facilitate clinical acceptance. Of note, the discussion herein draws primarily from literature related to head and neck cancer (HNC), showcasing it as a representative example of a complex disease site. However, these insights apply broadly to auto-contouring across disease sites

Identification and Validation of Novel Small Molecule Disruptors of HuR-mRNA Interaction

HuR, an RNA binding protein, binds to adenine- and uridine-rich elements (ARE) in the 3′-untranslated region (UTR) of target mRNAs, regulating their stability and translation. HuR is highly abundant in many types of cancer, and it promotes tumorigenesis by interacting with cancer-associated mRNAs, which encode proteins that are implicated in different tumor processes including cell proliferation, cell survival, angiogenesis, invasion, and metastasis. Drugs that disrupt the stabilizing effect of HuR upon mRNA targets could have dramatic effects on inhibiting cancer growth and persistence. In order to identify small molecules that directly disrupt the HuR–ARE interaction, we established a fluorescence polarization (FP) assay optimized for high throughput screening (HTS) using HuR protein and an ARE oligo from Musashi RNA-binding protein 1 (Msi1) mRNA, a HuR target. Following the performance of an HTS of ~6000 compounds, we discovered a cluster of potential disruptors, which were then validated by AlphaLISA (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), surface plasmon resonance (SPR), ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP IP) assay, and luciferase reporter functional studies. These compounds disrupted HuR–ARE interactions at the nanomolar level and blocked HuR function by competitive binding to HuR. These results support future studies toward chemical probes for a HuR function study and possibly a novel therapy for HuR-overexpressing cancers. NA-binding proteins (RBPs) are critical trans factors that associate with specific cis elements present in mRNAs, thereby regulating the fate of target mRNAs.1 The RBP Hu antigen R (HuR, also known as HuA; Hu references the patient's initials from whom an anti-HuR, autoinflammatory antibody was first isolated2) is a member of the embryonic lethal abnormal vision-like (ELAVL) protein family that binds to adenine- and uridine-rich elements (ARE) mainly located in the mRNA 3′-untranslated region (UTR).1,3,4 HuR is elevated in a broad range of cancer tissues compared with the corresponding normal tissues.5 In early reports, upregulated HuR in brain and colon cancers was linked to the enhanced expression of COX-2, VEGF, TGF-β, IL-8, and other cancer-associated proteins,6,7 Subsequent studies revealed that HuR was broadly overexpressed in virtually all malignancies tested, including cancers of the colon,5,8,9 prostate,10,11 breast,12 brain,6 ovaries,13 pancreas,14 and lung.15 Elevated cytoplasmic accumulation of HuR correlates with high-grade malignancy and serves as a prognostic factor of poor clinical outcome in those cancers.3,4,16 HuR is proposed to play a causal role in tumor development. Cultured carcinoma cells with elevated HuR produced significantly larger tumors than those arising from control populations in a mouse xenograft model,5 while reducing HuR by siRNA or microRNA led to decreased tumor size.5,17 HuR contains three RNA recognition motifs (RRM), of which RRM1 and RRM2 are involved in RNA binding, whereas RRM3 does not contribute to RNA binding but is needed for cooperative assembly of HuR oligomers on RNA.18 Many cytokine and proto-oncogene mRNAs have been identified as containing AREs within their 3′-UTRs, which confer a short mRNA half-life.19 Cytoplasmic binding of HuR to these ARE-containing mRNAs is generally accepted as leading to mRNA stabilization and increased translation.20,21 HuR promotes tumorigenesis by interacting with cancer-associated mRNAs which encode proteins implicated in different tumor processes including cell proliferation, cell survival, angiogenesis, invasion, and metastasis.3,4,16 HuR also promotes the translation of several target mRNAs encoding proteins that are involved in cancer treatment resistance.16,22–24 Taken together, these findings suggest that HuR is an attractive target for developing novel cancer therapies. RBPs have been considered “undruggable targets” due to the lack of a well-defined binding pocket for target mRNA. Indeed, there has globally been limited success in finding small molecules that directly disrupt the HuR interaction with AREs of target mRNAs, with limited reports indicating several active hits arising from screening for HuR inhibitors.25–27 Those reported hits are structurally independent, so they cannot provide information for later structure–activity relationship (SAR) analysis to design more potent and specific HuR inhibitors. Currently, the most potent hit reported (MS-444) acts via inhibition of HuR homodimerization, leading to disruption of the HuR–ARE interaction.25 Here, we try to identify HuR inhibitors, which competitively bind to HuR and directly disrupt the HuR–ARE interaction. In this study, we optimized a fluorescent polarization-based (FP-based) binding assay using human full-length HuR protein and an ARE region of Musashi1 (Msi1) 3′-UTR mRNA. HuR binds to and stabilizes the mRNA of Msi128 allowing for oncogenic overexpression of Msi1 and negative regulation of Numb and adenomatous polyposis coli (APC), which are involved in controlling Notch and Wnt signaling pathways.29 Using this FP-based HTS, we screened a library of ~6000 compounds and identified a set of HuR–ARE disruptors, which were validated by AlphaLISA assay, SPR, RNP IP, and luciferase reporter functional studies. The discovery of these inhibitors and related inactive compounds provides the impetus for rational design of more potent and specific HuR–ARE disruptors