Estado Actual de las Investigaciones y Desarrollo de una Vacuna Anti-Caries

El objetivo de este trabajo de revisión bibliográfica es poner a disposición del lector en español, los avances realizados en el conocimiento de la caries dental y de la posibilidad de su control por medio de una vacuna. En los últimos veinte años se ha acumulado una muy vasta e importante información sobre este tema. En base a la respuesta de muchas preguntas planteadas estamos hoy en los umbrales del comienzo de pruebas clínicas dé una vacuna anti-caries, más precisamente anti-Sfrcptoeocns mutans. Se discute aquí también el papel que puede cumplir una vacuna de estas características en el futuro y los problemas médico-sociales involucrados en esto

Endoplasmic reticulum stress and ubiquitin-proteasome system impairment in natural scrapie

Chronic accumulation of misfolded proteins such as PrPSc can alter the endoplasmic reticulum homeostasis triggering the unfolded protein response (UPR). In this pathogenic event, the molecular chaperones play an important role. Several reports in humans and animals have suggested that neurodegeneration is related to endoplasmic reticulum stress in diseases caused by the accumulation of misfolded proteins. In this study, we investigated the expression of three endoplasmic reticulum stress markers: PERK (protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase), BiP (binding immunoglobulin protein), and PDI (Protein Disulfide Isomerase). In addition, we evaluated the accumulation of ubiquitin as a marker for protein degradation mediated by the proteasome. These proteins were studied in brain tissues of sheep affected by scrapie in clinical and preclinical stages of the disease. Results were compared with those observed in healthy controls. Scrapie-infected sheep showed significant higher levels of PERK, BiP/Grp78 and PDI than healthy animals. As we observed before in models of spontaneous prion disease, PDI was the most altered ER stress marker between scrapie-infected and healthy sheep. Significantly increased intraneuronal and neuropil ubiquitinated deposits were observed in certain brain areas in scrapie-affected animals compared to controls. Our results suggest that the neuropathological and neuroinflammatory phenomena that develop in prion diseases cause endoplasmic reticulum stress in brain cells triggering the UPR. In addition, the significantly higher accumulation of ubiquitin aggregates in scrapie-affected animals suggests an impairment of the ubiquitin-proteasome system in natural scrapie. Therefore, these proteins may contribute as biomarkers and/or therapeutic targets for prion diseases

Contribuciones al estudio de biomarcadores, terapia y fenómeno de cepas en las enfermedades priónicas

Las enfermedades priónicas son trastornos neurodegenerativos mortales que no se pueden prevenir o tratar, por lo que actualmente muchas de las investigaciones en torno a estas enfermedades se centran en el desarrollo de tratamientos específicos. Se considera que parte de la muerte neuronal que ocurre en las enfermedades priónicas se debe a la activación de la apoptosis y la alteración de la homeostasis de mecanismos autofágicos. El fragmento C-terminal no tóxico de la toxina tetánica (TTC) se ha descrito como una molécula neuroprotectora que se une a los receptores Trk desencadenando vías de supervivencia neuronal, inhibiendo la apoptosis y regulando la autofagia. Debido a esto, en el estudio número 1 de esta tesis, se presenta un estudio piloto para probar el potencial terapéutico del TTC en las enfermedades priónicas. Ratones wild type de la línea C57BL6 y ratones transgénicos Tg338, que sobreexpresan la PrPC ovina en su variante VRQ/VRQ, se inocularon intracerebralmente con el agente priónico del scrapie y luego fueron tratados mediante la inyección intramuscular de TTC. Los resultados de este estudio muestran, en el grupo tratado de ambos modelos murinos, una disminución de las proteínas caspasa-3 y p62 y un aumento de LC3B y NeuN a nivel encefálico. Además, los ratones wild type tratados mostraron diferencias en la regulación de la expresión génica de Atg5, Becn1 y Fbxw7. Así, se observa que la inyección de TTC generó efectos neuroprotectores en ambos modelos murinos de enfermedad priónica a través de la reducción de la apoptosis y de la regulación de la autofagia, lo que resultó en un aumento de la supervivencia neuronal, pese a no aumentar el tiempo de supervivencia. Estos hallazgos refuerzan el papel del TTC como regulador de la apoptosis y la autofagia en enfermedades neurodegenerativas y, lo que es más importante, como molécula neuroprotectora. Otro de los principales focos de las investigaciones actuales en enfermedades priónicas está en la búsqueda de biomarcadores que permitan detectar la enfermedad en fases preclínicas. La neurogranina (Ng) y la cadena ligera del neurofilamento (NfL) son proteínas que reflejan el daño sináptico y axonal y se postulan como buenos biomarcadores para trastornos neurodegenerativos. En el estudio número 2, se evalúan Ng y NfL como posibles biomarcadores preclínicos en la enfermedad de scrapie. Para esto, se estudia tanto su concentración proteica como su nivel de expresión génica en el sistema nervioso central (SNC) de ovejas afectadas por scrapie en estadios preclínico y clínico, en comparación con controles sanos. Además, se evalúan también sus niveles en líquido cefalorraquídeo (LCR) y su correlación con los principales eventos neuropatológicos en las enfermedades priónicas, el depósito de PrPSc y la espongiosis. Los resultados muestran una disminución en los niveles de expresión proteica y génica de Ng y NfL a medida que avanza la enfermedad, y cambios significativos entre los animales del grupo control y preclínico. Por el contrario, los niveles de LCR de NfL aumentaron a lo largo de la progresión de la enfermedad. Además, se encontró una correlación negativa entre los marcadores neuropatológicos de enfermedad priónica y la concentración de las proteínas estudiadas. Así, en este estudio se corrobora que la concentración en el tejido nervioso de Ng y NfL, marcadores de daño sináptico y axonal, se ve afectada por la acumulación de priones, y que esta condición es detectable incluso en etapas preclínicas enfermedad priónica. Por lo tanto, los resultados obtenidos respaldan la utilidad de ambas proteínas como biomarcadores preclínicos para enfermedades priónicas. Los priones son patógenos exclusivamente proteicos cuya estructura terciaria y cuaternaria puede diferir, dando lugar a la aparición de diferentes cepas, que se manifiestan a través de variabilidad fenotípica. Además, la capacidad de transmisión de los priones a las diferentes especies está íntimamente ligada con sus características de cepa. Ampliar el conocimiento y la caracterización de las cepas priónicas es crucial para evaluar el potencial de los priones para infectar distintas especies, y para el control y la erradicación de las enfermedades priónicas. En el scrapie, se ha visto que varias cepas pueden propagarse a partir de un mismo aislado, por lo que se considera que, en ciertos casos, distintas cepas coexisten en el aislado original. Por esto, en el estudio número 3, se evalúa, mediante la técnica de Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA), la presencia de cepas de scrapie asociadas a un perfil de 21kDa en aislados de origen ovino y su evolución durante su transmisión seriada en un bioensayo en ratones que expresan la PrPC ovina. Para esto, se utilizó la PMCA en diferentes condiciones para evaluar la cantidad y proporción de subcomponentes contenidos en distintas muestras del bioensayo. Los resultados muestran que la PMCA se puede utilizar en determinadas condiciones en las que el fenotipo de 19kDa, asociado a una cepa de scrapie, no es amplificable. Bajo estas mismas condiciones, la PMCA es capaz de amplificar el subcomponente de 21kDa del scrapie, asociado a varias cepas distintas de esta enfermedad. A partir del método de PMCA establecido en este estudio, además, se detecta el componente de 21kDa en aislados de scrapie ovino que mostraban en un inicio un perfil de glicosilación de 19kDa. Por tanto, los resultados demuestran, por un lado, que la PMCA se puede utilizar para detectar cepas de 21kDa en homogeneizados que muestran una firma de 19kDa, y también que es capaz de detectar la selección diferencial dependiente del tejido que ocurre en los bioensayos. Por otro lado, y de forma más importante, los resultados sugieren que algunos aislados naturales de scrapie ovino utilizados en el estudio contenían mezclas de cepas y que la coinfección con varias cepas podría ocurrir de forma frecuente en la naturaleza. La generación in vitro de priones recombinantes infecciosos fue un gran logro en la investigación de las enfermedades priónicas ya que permite la producción de PrP recombinante de alta pureza para su uso en futuras investigaciones. Sin embargo, estos priones recombinantes pueden existir y propagarse en muchas conformaciones que pueden diferir en su patogenicidad y ser desde absolutamente inocuas hasta letales, lo que limita su uso como buenos modelos de priones. La generación de priones recombinantes que retengan las características de los priones de mamífero es de crucial importancia, ya que el conocimiento obtenido de los estudios con priones recombinantes podría ayudar a comprender los aspectos desconocidos de la patogénesis de las enfermedades priónicas. En el estudio número 4 de esta tesis, se analizan comparativamente las características de distintas cepas priónicas de mamífero y de sus homólogas recombinantes tras su bioensayo en el modelo TgVole, con el fin de determinar cómo varían sus propiedades biológicas tras propagarse in vitro sobre una proteína recombinante y posteriormente in vivo. Tras la inoculación de las cepas de mamífero de scrapie 22L, RML, 263K y ME7, así como de cepas recombinantes homólogas de éstas en el modelo transgénico TgVole, que expresa la PrPC 109I del bank vole, todas fueron capaces de producir enfermedad en los animales. Además, las cepas recombinantes 22L-PMSA-2 y RML-PMSA-1, obtenidas tras la replicación in vitro de las cepas naturales 22L y RML respectivamente, mostraron una gran similitud con sus homólogas naturales en las características neuropatológicas asociadas a la infección por priones (espongiosis y depósito de PrPSc). Aunque este estudio se completará en el futuro con el análisis de las propiedades bioquímicas de estas cepas, los resultados obtenidos implican que estas dos cepas de scrapie mantienen sus propiedades neuropatológicas tras su propagación en proteína recombinante, y que por lo tanto podrían ser buenos modelos para posteriores estudios. Los cuatro estudios desarrollados en esta tesis han cumplido los objetivos de la misma, ampliando el conocimiento actual tanto sobre la patogenia, diagnóstico y tratamiento de las enfermedades priónicas como de los priones como agentes patógenos. <br /

Distinctive Toll-like receptors gene expression and glial response in different brain regions of natural scrapie

Prion diseases are chronic and fatal neurodegenerative diseases characterized by the accumula-tion of disease-specific prion protein (PrPSc), spongiform changes, neuronal loss, and gliosis. Growing evidence shows that the neuroinflammatory response is a key component of prion diseases and contributes to neurodegeneration. Toll-like receptors (TLRs) have been proposed as important mediators of innate immune responses triggered in the central nervous system in other human neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and amyotrophic lateral sclerosis. However, little is known about the role of TLRs in prion dis-eases, and their involvement in the neuropathology of natural scrapie has not been studied. We assessed gene expression of ovine TLRs in four anatomically distinct brain regions in natural scrapie-infected sheep and evaluated possible correlations between gene expression and patho-logical hallmarks of prion disease. We observed significant changes in TLR expression in scra-pie-infected sheep that correlate with the degree of spongiosis, PrPSc deposition, and gliosis in each of the regions studied. Remarkably, TLR4 was the only gene upregulated in all regions, re-gardless of the severity of neuropathology. In the hippocampus, we observed milder neuropa-thology associated with a distinct TLR gene expression profile and the presence of a peculiar microglial morphology, called rod microglia, described here for the first time in the brain of scrapie-infected sheep. The concurrence of these features suggests partial neuroprotection of the hippocampus. Finally, comparison of findings in naturally-infected sheep versus an ovinized mouse model (tg338 mice) revealed distinct patterns of TLR gene expression.This research was funded by “Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad del Conocimiento” (Aragon Government) through the project “A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vecto- riales y Zoonosis Emergentes”

Evidence of p75 neurotrophin receptor involvement in the central nervous system pathogenesis of classical scrapie in sheep and a transgenic mouse model

Neurotrophins constitute a group of growth factor that exerts important functions in the nervous system of vertebrates. They act through two classes of transmembrane receptors: tyrosine-kinase receptors and the p75 neurotrophin receptor (p75NTR ). The activation of p75NTR can favor cell survival or apoptosis depending on diverse factors. Several studies evidenced a link between p75NTR and the pathogenesis of prion diseases. In this study, we investigated the distribution of several neurotrophins and their receptors, including p75NTR, in the brain of naturally scrapie-affected sheep and experimentally infected ovinized transgenic mice and its correlation with other markers of prion disease. No evident changes in infected mice or sheep were observed regarding neurotrophins and their receptors except for the immunohistochemistry against p75NTR . Infected mice showed higher abundance of p75NTR immunostained cells than their non-infected counterparts. The astrocytic labeling correlated with other neuropathological alterations of prion disease. Confocal microscopy demonstrated the co-localization of p75NTR and the astrocytic marker GFAP, suggesting an involvement of astrocytes in p75NTR-mediated neurodegeneration. In contrast, p75NTR staining in sheep lacked astrocytic labeling. However, digital image analyses revealed increased labeling intensities in preclinical sheep compared with non-infected and terminal sheep in several brain nuclei. This suggests that this receptor is overexpressed in early stages of prion-related neurodegeneration in sheep. Our results confirm a role of p75NTR in the pathogenesis of classical ovine scrapie in both the natural host and in an experimental transgenic mouse model

Therapeutic Assay with the Non-toxic C-Terminal Fragment of Tetanus Toxin (TTC) in Transgenic Murine Models of Prion Disease

The non-toxic C-terminal fragment of the tetanus toxin (TTC) has been described as a neuroprotective molecule since it binds to Trk receptors and activates Trk-dependent signaling, activating neuronal survival pathways and inhibiting apoptosis. Previous in vivo studies have demonstrated the ability of this molecule to increase mice survival, inhibit apoptosis and regulate autophagy in murine models of neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Prion diseases are fatal neurodegenerative disorders in which the main pathogenic event is the conversion of the cellular prion protein (PrPC) into an abnormal and misfolded isoform known as PrPSc. These diseases share different pathological features with other neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease or Alzheimer's disease. Hitherto, there are no effective therapies to treat prion diseases. Here, we present a pilot study to test the therapeutic potential of TTC to treat prion diseases. C57BL6 wild-type mice and the transgenic mice Tg338, which overexpress PrPC, were intracerebrally inoculated with scrapie prions and then subjected to a treatment consisting of repeated intramuscular injections of TTC. Our results indicate that TTC displays neuroprotective effects in the murine models of prion disease reducing apoptosis, regulating autophagy and therefore increasing neuronal survival, although TTC did not increase survival time in these models

Cerebrospinal fluid and plasma small extracellular vesicles and mirnas as biomarkers for prion diseases

Diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), or prion diseases, is based on the detection of proteinase K (PK)-resistant PrPSc in post-mortem tissues as indication of infection and disease. Since PrPSc detection is not considered a reliable method for in vivo diagnosis in most TSEs, it is of crucial importance to identify an alternative source of biomarkers to provide useful alternatives for current diagnostic methodology. Ovine scrapie is the prototype of TSEs and has been known for a long time. Using this natural model of TSE, we investigated the presence of PrPSc in exosomes derived from plasma and cerebrospinal fluid (CSF) by protein misfolding cyclic amplification (PMCA) and the levels of candidate microRNAs (miRNAs) by quantitative PCR (qPCR). Significant scrapie-associated increase was found for miR-21-5p in plasma-derived but not in CSF-derived exosomes. However, miR-342-3p, miR-146a-5p, miR-128-3p and miR-21-5p displayed higher levels in total CSF from scrapie-infected sheep. The analysis of overexpressed miRNAs in this biofluid, together with plasma exosomal miR-21-5p, could help in scrapie diagnosis once the presence of the disease is suspected. In addition, we found the presence of PrPSc in most CSF-derived exosomes from clinically affected sheep, which may facilitate in vivo diagnosis of prion diseases, at least during the clinical stage

Classical and atypical scrapie in sheep and goats: Review on the etiology, genetic factors, pathogenesis, diagnosis, and control measures of both diseases

Prion diseases, such as scrapie, are neurodegenerative diseases with a fatal outcome, caused by a conformational change of the cellular prion protein (PrPC), originating with the pathogenic form (PrPSc). Classical scrapie in small ruminants is the paradigm of prion diseases, as it was the first transmissible spongiform encephalopathy (TSE) described and is the most studied. It is necessary to understand the etiological properties, the relevance of the transmission pathways, the infectivity of the tissues, and how we can improve the detection of the prion protein to encourage detection of the disease. The aim of this review is to perform an overview of classical and atypical scrapie disease in sheep and goats, detailing those special issues of the disease, such as genetic fac-tors, diagnostic procedures, and surveillance approaches carried out in the European Union with the objective of controlling the dissemination of scrapie disease

BAMBI and CHGA in Prion Diseases: Neuropathological Assessment and Potential Role as Disease Biomarkers

Prion diseases affect both animals and humans. Research in the natural animal model of the disease could help in the understanding of neuropathological mechanisms and in the development of biomarkers for human pathologies. For this purpose, we studied the expression of 10 genes involved in prion propagation in vitro in the central nervous system of scrapie-infected sheep. Dysregulated genes (BAMBI and CHGA) were further analysed in a transgenic murine model (Tg338) of scrapie, and their protein distribution was determined using immunohistochemistry and Western blot. Their potential as biomarkers was finally assessed using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in cerebrospinal fluid (CSF) of scrapie sheep and Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) patients. Protein BAMBI was upregulated in highly affected brain areas and CHGA was overexpressed along the brain in both models. Moreover, BAMBI and CHGA immunostaining scores strongly correlated with spongiosis and microgliosis in mice. Finally, levels of BAMBI were significantly higher in the CSF of clinical sheep and CJD patients. In addition to their potential as biomarkers, our work confirms the role of BAMBI and CHGA in prion neuropathology in vivo, but besides prion replication, they seem to be involved in the characteristic neuroinflammatory response associated to prion infection

Glycans are not necessary to maintain the pathobiological features of bovine spongiform encephalopathy

The role of the glycosylation status of PrPC in the conversion to its pathological counterpart and on cross-species transmission of prion strains has been widely discussed. Here, we assessed the effect on strain characteristics of bovine spongiform encephalopathy (BSE) isolates with different transmission histories upon propagation on a model expressing a non-glycosylated human PrPC. Bovine, ovine and porcine-passaged BSE, and variant Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD) isolates were used as seeds/inocula in both in vitro and in vivo propagation assays using the non-glycosylated human PrPC-expressing mouse model (TgNN6h). After protein misfolding cyclic amplification (PMCA), all isolates maintained the biochemical characteristics of BSE. On bioassay, all PMCA-propagated BSE prions were readily transmitted to TgNN6h mice, in agreement with our previous in vitro results. TgNN6h mice reproduced the characteristic neuropathological and biochemical hallmarks of BSE, suggesting that the absence of glycans did not alter the pathobiological features of BSE prions. Moreover, back-passage of TgNN6h-adapted BSE prions to BoTg110 mice recovered the full BSE phenotype, confirming that the glycosylation of human PrPC is not essential for the preservation of the human transmission barrier for BSE prions or for the maintenance of BSE strain properties