Papel de ALPHA-TAT1 en la dinámica del centrosoma

Los centriolos son considerados la estructura microtubular que contiene la γtubulina más altamente modificada dentro de la célula. De entre todas las modificaciones post-traduccionales que éstos presentan se encuentra la acetilación; los MTs de los centriolos aparecen altamente acetilados. Sin embargo, aún no ha sido dilucidado el papel de esta modificación post-traduccional en la integridad, dinámica y función de este orgánulo. Nuestros resultados estatuyen que esta modificación post-traduccional es un evento muy temprano en el proceso de formación del procentriolo durante la duplicación centriolar, lo que sugiere una función esencial de la acetilación en el punto de inicio de este proceso. La única enzima con actividad tubulina acetil-transferasa hasta ahora identificada, es la proteína αTAT1, no obstante, jamás ha sido realizado un análisis preciso de la distribución y el papel de la misma en este orgánulo celular. En este trabajo hemos revelado que la proteína de fusión GFP-αTAT1 se encuentra localizada en el centrosoma durante la interfase. Asimismo, los resultados presentados en esta tesis demuestran que αTAT1 es suficiente y necesaria para acetilar no sólo la αtubulina citoplasmática sino también la αtubulina centriolar, revelando que esta enzima es la responsable de esta modificación en los centriolos, siendo reclutada al centrosoma o al cuerpo basal para servir como punto de inicio y preparación para el desarrollo de otras funciones centriolares. Tres líneas argumentales demuestran un papel esencial de αTAT1 en el proceso de reclutamiento del material pericentriolar al centrosoma tanto en células HeLa como en MEFs. Primero, la inhibición de la expresión de αTAT1 en ambos tipos celulares ocasiona una evidente perturbación en la distribución de las proteínas que constituyen el material pericentriolar, sin alterar la distribución de las proteínas estrictamente centriolares. En estas condiciones, se observa un enriquecimiento significativo de las proteínas pericentriolares localizadas en la región centrosómica. Segundo, mediante experimentos de FRAP, hemos investigado si estas proteínas son inmovilizadas después de su reclutamiento al centrosoma o se encuentran en continuo intercambio con la fracción citoplásmica. Los resultados de estos experimentos indicaron que en ausencia de αTAT1, las proteínas pericentriolares no son inmovilizadas después de su reclutamiento al centrosoma sino que se encuentran en continuo intercambio con la fracción citoplásmica libre y a una tasa de difusión casi dos veces más rápida que la observada en células control, demostrando un papel de esta enzima en la estabilización de la unión de la fracción citoplásmica de estas proteínas al centrosoma y consecuentemente en el comportamiento dinámico de las mismas. Tercero, nuestros ensayos de co-inmunoprecipitación han aseverado que αTAT1 es capaz de interaccionar con las proteínas AKAP450 y γtubulina, las cuales son componentes básicos del material pericentriolar. En conjunto, estos resultados apoyan la siguiente hipótesis: αTAT1 regularía tanto el reclutamiento al centrosoma como el comportamiento y la distribución de las distintas proteínas pericentriolares mediante su interacción con AKAP450. En realidad, dado su enorme tamaño y la cantidad de interacciones que establece, descritas o por descubrir, AKAP450 puede ser considerada una “plataforma proteica” más que una simple proteína. De forma que vía esta asociación, αTAT1 sería capaz de mediar la localización centrosómica de AKAP450 y a su vez de PCNT (pues ha sido descrito que AKAP450 interacciona con PCNT y ambas son interdependientes para su localización en el centrosoma -Barr, Kilmartin, & Gergely, 2010; Buchman et al., 2010; M Takahashi, Yamagiwa, Nishimura, Mukai, & Ono, 2002-) y del resto de proteínas pericentriolares, regulando sus propiedades dinámicas y estabilizando la unión de las mismas al centrosoma. En el caso del complejo del γ-TuRC, αTAT1 podría reclutarlo al centrosoma de forma indirecta via su interacción con AKAP450, quien a su vez interacciona con los componentes GCP2/GCP3 del γ-TuRC o bien de forma directa via su interacción con γtubulina. Estos resultados revelan un papel crucial de la enzima αTAT1 en la determinación del tamaño del centrosoma definiendo la capacidad de los centriolos de unir PCM, mediante su interacción con varias proteínas pericentriolares y la regulación del reclutamiento dinámico de éstas al centrosoma. Los resultados obtenidos a partir de los experimentos de despolimerización de MTs revelaron que los MTs citoplásmicos no juegan un papel crítico en el reclutamiento de las proteínas pericentriolares mediado por αTAT1. No ha sido identificado aún el mecanismo preciso por el que las proteínas del PCM son reclutadas al centrosoma. Estas observaciones arrojan luz sobre la maquinaria molecular involucrada en este proceso, estatuyendo un papel importante de la enzima αTAT1 en la restricción y control del número de moléculas de AKAP450 y γtubulina que deben ser reclutadas e inmovilizadas en los centriolos, de forma que cuando la expresión de αTAT1 es inhibida se produce una desregulación de este proceso y se detecta una superabundancia de moléculas de estas proteínas y demás proteínas pericentriolares en la región centrosómica, las cuales se encuentran en continuo intercambio con la fracción citosólica. Nuestros ensayos de repolimerización de MTs han demostrado un papel esencial de αTAT1 en el proceso de nucleación de MTs dentro de la célula. La inhibición de la expresión de αTAT1 incrementa de forma significativa la tasa de nucleación de MTs en el centrosoma desencadenando la formación de una red microtubular completamente radial y simétrica. Esto concuerda con los resultados previamente descritos en los que se establece que la tasa de nucleación de MTs en el aparato de Golgi es proporcional a la cantidad de AKAP450 presente en esta región. Nosotros hipotetizamos que el mecanismo de regulación de la nucleación microtubular en el centrosoma es similar al detectado en el aparato de Golgi, existiendo una relación proporcional entre la cantidad de AKAP450 asociada al centrosoma y el número de MTs que son nucleados por este orgánulo. En ausencia de αTAT1, el enriquecimiento de moléculas de AKAP450 en el centrosoma desencadenaría un incremento significativo en la tasa de nucleación de MTs a partir de esta estructura subcelular. Asimismo, la morfología de los MTs nucleados por los centrosomas carentes de αTAT1 difiere significativamente de la presentada por los MTs formados a partir de centrosomas control. En ausencia de αTAT1, los MTs son mucho más rectos y de menor longitud que los observados en condiciones control, lo que sugiere que esta proteína participa en la determinación de la estructura microtubular. Adicionalmente, hemos evidenciado una labor decisiva de γTAT1 en la estabilidad centriolar y en el des-ensamblaje del cartwheel. Hemos observado que la inhibición de la expresión de αTAT1 en células bajo situaciones de estrés provoca eventos de sobreduplicación centriolar que resultan en husos mitóticos malformados, implicando un vínculo funcional entre αTAT1 y los eventos que tienen lugar en el centrosoma. La interpretación más simple es que αTAT1 es un componente de esta estructura subcelular requerido para la estabilidad centriolar vía la inmovilización de las distintas proteínas pericentriolares al centrosoma. Por otro lado, hemos patentizado que αTAT1 juega un papel crucial en la degradación centriolar de sas6 que tiene lugar en anafase. Nuestros experimentos han desvelado que la ausencia de αTAT1 impide la degradación centriolar de sas6 al final de mitosis, sugiriendo que αTAT1 es esencial para el adecuado des-ensamblaje del cartwheel en este punto del ciclo celular. Al igual que ocurre en el caso de los cuerpos basales, la permanencia del cartwheel bajo condiciones de inhibición de la expresión de αTAT1 podría servir como mecanismo para estabilizar los centriolos ya que, como mencionábamos anteriormente, la estabilidad centriolar se encuentra significativamente comprometida en las células carentes de αTAT1. En células mitóticas la cantidad de los componentes del cartwheel disminuye considerablemente para prevenir una duplicación inapropiada. Estos datos indican que los eventos de sobreduplicación centriolar y el ensamblaje de husos mitóticos multipolares que tienen lugar en células carentes de αTAT1 bajo situaciones de estrés son debidos a una reducción de la estabilidad centriolar junto con defectos importantes en el des-ensamblaje del cartwheel al final de mitosis. Curiosamente, el papel de αTAT1 tanto en la dinámica y distribución de las proteínas pericentriolares como en la estabilidad centriolar no ha sido observado en células RPE1. No se ha dilucidado aún la razón de este diferente comportamiento. Una posibilidad es que estas células carezcan de algún factor todavía no identificado necesario para la función de αTAT1 relacionada con la estabilidad y función centrosómicas, indicando que esta precisa labor de αTAT1 es dependiente del tipo celular. Por otro lado, también hemos examinado la implicación de la proteína γTAT1 en la dinámica del aparato de Golgi. La subpoblación de microtúbulos cortos que comienzan y acaban en el aparato de Golgi (incluso a veces paralelos a las cisternas de este orgánulo) y que suelen presentar modificaciones post-traduccionales, especialmente la modificación consistente en la acetilación, es una característica de la mayoría de los tipos celulares. De esta forma, se propuso que estos microtúbulos generados en el aparato de Golgi y modificados post-traduccionalmente podrían desempeñar funciones específicas en la dinámica del aparato de Golgi. Todos estos datos nos impulsaron a indagar en el papel que desempeña la acetilación de microtúbulos mediada por αTAT1 en la dinámica del aparato de Golgi. Nuestros resultados ponen de manifiesto que ni una perturbación en el nivel de acetilación de MTs ni en la expresión de la enzima αTAT1 provoca defectos en la localización pericentrosomal o en la estructura del aparato de Golgi. Estos datos indican que los MTs acetilados no juegan un papel determinante en la posición central del aparato de Golgi ni son responsables de la morfología extendida que adopta este orgánulo en células en interfase que están creciendo en un sustrato finito. Tampoco las funciones básicas del aparato de Golgi, especialmente la secreción, parecían estar seriamente afectadas. La formación de intermediarios de transporte ocurre de forma normal bajo condiciones en las que el nivel de acetilación de la tubulina se encuentra seriamente perturbado, apuntando a que si la acetilación de los MTs participa en el tráfico de membranas, será de forma indirecta, pàrticipando en la secreción polarizada pero no en los mecanismos básicos de transporte

Novel saliva biomarkers for stress and infection in pigs : Changes in oxytocin and procalcitonin in pigs with tail-biting lesions

There is a need for feasible and reliable measures to improve and evaluate production animal health and welfare. Oxytocin is a promising novel stress-related biomarker and procalcitonin may be a measure of sepsis. Both have potential for use in pigs and can be measured from saliva, which allows on-farm sampling with minimal impact on the animals. The current study sought to further validate these measures using a spontaneous situation that causes both stress and an increased risk for infections in pigs, namely a tail-biting outbreak. Grower pigs on a commercial farm belonging to three different phenotype groups were selected: control pigs from control pens (CC, N = 30), control pigs (CTB, N = 10), and pigs with tail lesions from pens with a tail-biting outbreak (LTB, N = 27). A single sample of saliva was collected from each pig and analysed for a range of biomarkers related to stress, infection, inflammation, and immune activation. Oxytocin tended to be higher in CC pigs than in LTB pigs, while cortisol was higher in CTB than CC pigs. Procalcitonin tended to be higher, and haptoglobin was higher in LTB than in CC pigs. Adenosine-deaminase levels were similar between phenotypes. These results provide further evidence for the link between stress and tail biting, and indicate that tail-biting lesions are potential routes for systemic spread of bacteria. Further research into saliva oxytocin as a stress biomarker and saliva procalcitonin as a sepsis biomarker in pigs is warranted.Peer reviewe

Changes in cortisol and cortisone in hair of pigs reared under heat stress conditions

Heat stress accounts for millions of dollars in losses for swine producers worldwide. The aim of the present study was to determine and evaluate cortisol and cortisone in hair as indicators of thermal stress in growing pigs reared under high environmental temperatures. The study was carried out in two independent batches of commercial crosses of Lean Duroc and Pietrain in trials 1 and 2, respectively, during the growing period (from 40 to 100 kg; 81 days in trial 1 and 77 days in trial 2) in the same commercial farm in Spain during the summers of 2020 and 2021. In both cases, four rooms were used. In Trial 1, Room 1 had cooling and 11 pigs per pen; Room 2 had no cooling and 13 pigs per pen; Room 3 had no cooling and 11 pigs per pen, and Room 4 had cooling and 13 pigs per pen. In Trial 2, Rooms 2 and 3 had cooling and rooms 1 and 4 had no cooling, and all of them had 13 pigs per pen. Mean THI value was higher (p < 0.0001) in rooms without cooling systems (75.0 trial 1; 74.9 trial 2) than with them (71.3 trial 1; 71.7 trial 2). A total of four pens per room (16 in total) was selected for analysis of hair corticoids and all pigs inside were sampled at the end of the study. Fifty percent of the pigs were males (castrated and intact in trial 1 and 2, respectively) and 50% females. In total, 44, 52, 44, and 52 pigs, respectively, were sampled in four rooms from the first trial and 52 for each of four rooms in Trial 2. Cortisol concentrations in hair did not show any significant change in relation to cooling-non-cooling in any trial. However, hair cortisone concentration was 172.3 pg./mg and 105.8 pg./ mg less (p < 0.001) in pigs housed with cooling systems compared to those without them in Trial 1 and 2, respectively. In addition, the cortisone/cortisol ratio, which is an estimator of the activity of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase (11β-HSD) type 2, was also greater in rooms without cooling than in rooms with cooling in both trials (p < 0.0001 and p = 0.0105 for Trials 1 and 2, respectively). In relation to the sex effect, the results showed greater levels in females than in castrated males both in cortisone and the cortisol/cortisone ratio while cortisol hair levels were greater in intact males than in females. Therefore, the use of cortisone and the estimation of 11β-HSD type 2 activity in hair is recommended to evaluate the chronic stress produced by high environmental conditions in pigs instead of using hair cortisol concentrations alone.This study was included in Vall Companys, S.A.U.’s project WELFARE+ 8IDI-20210216 co-funded by Centre for the Development of Industrial Technology (CDTI), a Public Business Entity, answering to the Ministry of Science and Innovation, and the European Regional Development Fund (ERDF). DE was funded by the postdoctoral contract “Generational renewal to promote research” of the University of Murcia. ML-A (FJC2021-047105-I) by means of a post-doctoral fellowship, “Juan de la Cierva Formación,” supported by the “Ministerio de Ciencia e Innovación.”info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Alpha-catenin-Dependent Recruitment of the Centrosomal Protein CAP350 to Adherens Junctions Allows Epithelial Cells to Acquire a Columnar Shape

Epithelial morphogenesis involves a dramatic reorganisation of the microtubule cytoskeleton. How this complex process is controlled at the molecular level is still largely unknown. Here, we report that the centrosomal microtubule (MT)-binding protein CAP350 localises at adherens junctions in epithelial cells. By two-hybrid screening, we identified a direct interaction of CAP350 with the adhesion protein α-catenin that was further confirmed by co-immunoprecipitation experiments. Block of epithelial cadherin (E-cadherin)-mediated cell-cell adhesion or α-catenin depletion prevented CAP350 localisation at cell-cell junctions. Knocking down junction-located CAP350 inhibited the establishment of an apico-basal array of microtubules and impaired the acquisition of columnar shape in Madin-Darby canine kidney II (MDCKII) cells grown as polarised epithelia. Furthermore, MDCKII cystogenesis was also defective in junctional CAP350-depleted cells. CAP350-depleted MDCKII cysts were smaller and contained either multiple lumens or no lumen. Membrane polarity was not affected, but cortical microtubule bundles did not properly form. Our results indicate that CAP350 may act as an adaptor between adherens junctions and microtubules, thus regulating epithelial differentiation and contributing to the definition of cell architecture. We also uncover a central role of α-catenin in global cytoskeleton remodelling, in which it acts not only on actin but also on MT reorganisation during epithelial morphogenesis.This work was supported by Ministerio de Economia y Competitividad, Spain (BFU2012-36717 and CSD2009-00016 to RMR and BFU2011-22916 to JRM) and by Junta de Andalucia (CVI-7256 and CTS-2071), and by a funding GenHomme Network 02490-6088 to Hybrigenics and the Institut Curie. MA and AZ were supported by MEC–FPI Grants.Peer Reviewe

Reducing Stocking Densities and Using Cooling Systems for More Adapted Pigs to High Temperatures When Reared in Intensive Conditions

This study is aimed at evaluating the effect of reducing stocking density and using cooling systems to mitigate the negative effects of high temperatures in growing pigs (females and castrated males) reared in intensive conditions (from 25 to 100 kg) during summer (June to October 2020). The experimental design was a 2 × 2 factorial where pigs were provided with an evaporative cooling system and/or raised at regular or at lower stocking densities (i.e., 0.68 to 0.80 m2/animal). Treatments were distributed in four different rooms containing sex-balanced pens with either castrated males or females. Temperature and humidity were recorded throughout the experiment, and the temperature–humidity index was calculated. Heat stress (HS) on pigs was measured through changes in animals’ performance, animal-based indicators (dirtiness and activity budget) and physiological indicators (neutrophil/lymphocyte ratio and hair cortisol). The use of cooling, lowering stocking density and the combination of both strategies had positive effects on pigs’ final body weight (+5 kg, +3 kg, +9 kg, respectively; p < 0.001). The prevalence of dirtiness was similar at the stocking densities tested, and no clear effect of the cooling system was found. Both mitigation strategies lowered the physiological indicators of stress, although only hair cortisone can be considered an indicator of HS. In conclusion, both mitigation strategies are effective in improving pig welfare and performance, especially when both are combined. The severity of the stocking density effect may depend on the severity of the temperature.This study was included in Vall Companys, S.A.U.’s project WELFARE+ 8IDI-20210216 co-funded by the Centre for the Development of Industrial Technology (CDTI), a Public Business Entity, answering to the Ministry of Science and Innovation, and the European Regional Development Fund (ERDF). D.E. was funded by the postdoctoral contract “Generational renewal to promote research” of the University of Murcia. M.L.-A. (FJC2021-047105-I) by means of a post-doctoral fellowship, “Juan de la Cierva Formación”, supported by the “Ministerio de Ciencia e Innovación”.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Oxytocin changes in saliva of sows kept in different farrowing systems

Oral session 2[EN] Farrowing systems can influence the behaviour of sows during lactation -including their interaction with piglets and ability to move around-, hence improving their welfare. Oxytocin has been associated with positive emotions, and consequently to welfare improvement. The purpose of this study was to compare the welfare of sows through salivary oxytocin concentrations in three different farrowing systems during lactation and shortly after weaning

Complementary Functions of Plant AP Endonucleases and AP Lyases during DNA Repair of Abasic Sites Arising from C:G Base Pairs

Abasic (apurinic/apyrimidinic, AP) sites are ubiquitous DNA lesions arising from spontaneous base loss and excision of damaged bases. They may be processed either by AP endonucleases or AP lyases, but the relative roles of these two classes of enzymes are not well understood. We hypothesized that endonucleases and lyases may be differentially influenced by the sequence surrounding the AP site and/or the identity of the orphan base. To test this idea, we analysed the activity of plant and human AP endonucleases and AP lyases on DNA substrates containing an abasic site opposite either G or C in different sequence contexts. AP sites opposite G are common intermediates during the repair of deaminated cytosines, whereas AP sites opposite C frequently arise from oxidized guanines. We found that the major Arabidopsis AP endonuclease (ARP) exhibited a higher efficiency on AP sites opposite G. In contrast, the main plant AP lyase (FPG) showed a greater preference for AP sites opposite C. The major human AP endonuclease (APE1) preferred G as the orphan base, but only in some sequence contexts. We propose that plant AP endonucleases and AP lyases play complementary DNA repair functions on abasic sites arising at C:G pairs, neutralizing the potential mutagenic consequences of C deamination and G oxidation, respectively

Trace Elements and Ferritin in Pig Saliva : Variations during Fattening, Time of Sampling, Effect of Dirtiness and Stability under Different Storage Conditions

Altres ajuts: The European Next Generation Funds RYC2021-033660-IThe objective of this study was to evaluate the possible changes of zinc (Zn), copper (Cu), iron (Fe) and ferritin during the entire productive cycle in fattening pigs and at different diurnal sampling times. Moreover, the possible effects of the presence of pen contaminants and storage stability at different temperature conditions were assessed. The analytes changed along the different phases of the fattening productive cycle, showing, in general, higher values at the initial phases. In addition, statistically significant variations were found in Zn and Cu measurements at different sampling times of the day. In the spectrophotometric assays, the values of all analytes significantly increased after adding high concentrations of feces or feed. However, when low concentrations of feces or feed were added, only Cu showed a significant increase. Overall, the salivary levels of Zn, Cu, Fe and ferritin in pigs can change during different fattening phases and the different hours of the day. These analytes were more stable at −80 °C and, if saliva is contaminated with feces or feed, it can lead to an increase in these analytes

Investigation of correlations between skin lesion count and concentrations of salivary biomarkers in pigs from suckling to fattening

Oral session 1[EN] ClearFarm project intends to develop a platform to monitor animal welfare continuously throughout the value chain of pigs and dairy cattle using sensor technology. This platform relies on algorithms (for each species), built up with relevant welfare indicators measured by PLF (Precision Livestock Farming) technology

Prolactin in saliva of pigs as a possible biomarker of stress: analytical validation of an immunoassay and changes at slaughterhouse

Oral session 2[EN] Prolactin (PRL) is considered a biomarker of stress response, both acute and chronic, in several species. Although the scientific literature reports divergent results, some studies suggest that prolactin secretion during stress acts to maintain homeostasis within the immune system. Several studies have investigated the possibility of measuring PRL in saliva in different species such as rats, domestic ruminants, donkeys, dogs, cattle, and sheep for diagnosis or research purposes. Results obtained in animal models have indicated that the secretion of this hormone is dependent on the type and intensity of the stress