Vettori virali influenzali contenenti determinanti antigenici di HIV-1 inducono immunità protettiva nei topi dopo singola immunizzazione per via mucosale

Lo sviluppo di un vaccino efficace contro il virus dell’HIV-1 è una delle più importanti sfide che la Sanità pubblica sta affrontando in questi ultimi 20 anni. Una conoscenza ancora incompleta dei correlati di protezione e la variabilità genetica del virus HIV pone sostanziali impedimenti al raggiungimento di questo obiettivo. L’infezione dal virus HIV-1 si acquisisce prevalentemente attraverso la mucosa del tratto genito-rettale, pertanto, l’induzione di un’immunità mucosale rappresenta uno degli obiettivi primari nelle strategie che mirano a definire un efficace vaccino per il virus HIV-1. In particolare, un’immunizzazione in grado di attivare una risposta sia cellulare che umorale nelle mucose coinvolte nei processi di acquisizione del virus o dei linfonodi regionali può rappresentare una strategia efficace di prevenzione o controllo della replicazione e diffusione del virus dal sito di ingresso, ai tessuti linfoidi e al sangue. Numerose osservazioni suggeriscono il ruolo importante che i linfociti T CD8+ svolgono nel contenimento dell’infezione con il virus HIV-1, tra queste l’evidenza dell’associazione temporale tra la comparsa di una risposta mediata dai linfociti T HIV-specifici in seguito all’infezione acuta e la riduzione della replicazione virale ad un livello stabile (set-point), l’associazione significativa di particolari alleli MHC I con la protezione dalla progressione della malattia, e l’aumento della replicazione virale in seguito alla deplezione dei linfociti T CD8+ in modelli di studio macachi/HIV-1. Diverse strategie vaccinali nei confronti del virus HIV-1 si basano sull’impiego di protocolli di “prime-boost” in grado di indurre un aumento selettivo di linfociti T della memoria specifici per antigeni del virus HIV trasportati da vettori. Tra i diversi sistemi di trasporto e rilascio di antigeni, i vettori virali vivi ricombinanti sono ampiamente considerati, poiché hanno la capacità di attivare una forte risposta cellulare ed anticorpale nei confronti degli antigeni che esprimono. Il virus influenzale ricombinante, che esprime antigeni estranei provenienti dal virus HIV-1, è uno strumento promettente in tal senso. Alla luce di tali premesse abbiamo ritenuto interessante valutare la capacità di un virus influenzale di tipo A che esprime un poliepitopo HIV fuso all’estremità N-terminale della emagglutinina (HA) matura, di indurre una risposta immunitaria cellulare e umorale in seguito all’infezione di topi BALB/c per via vaginale e di conferire protezione nei confronti di un’infezione secondaria con i virus Vaccinia ricombinanti che esprimono gli stessi antigeni. In particolare abbiamo generato un virus influenzale ricombinante dal fenotipo attenuato (WSN/CKG), che esprime il peptide cluster PCLUS3, derivato dalla glicoproteina gp120 di HIV-1, il peptide P18IIIB, epitopo per i linfociti T citotossici (CTL) derivato dal loop V3 della gp120 di HIV-1 IIIB, e un secondo epitopo CTL derivato dalla proteina Gag di HIV-1, nella regione N-terminale del virus A/WSN/CKG. Mediante saggi ELISPOT, abbiamo osservato che una singola somministrazione per via vaginale con il virus WSN/CKG, induce nei topi una risposta immune a lungo termine mediata da linfociti T CD8+ antigene-specifici, nei linfonodi iliaci (ILN) drenanti la mucosa genito-rettale, e nella milza dei topi infettati, con un picco intorno al settimo giorno dopo l’infezione, che viene rapidamente richiamata nella milza in seguito ad un’infezione secondaria con il virus Vaccinia esprimente la proteina Env (vPE16) o Gag (vDK1). Tali risultati sono analoghi se i topi vengono immunizzati per via intranasale. Abbiamo poi analizzato mediante saggi ELISA la produzione di anticorpi antigene-specifici nel siero di topi ad un mese dall’infezione con il virus WSN/CKG e abbiamo osservato elevati livelli di IgG P18IIIB-specifiche nei topi che sono stati infettati sia per via intranasale che vaginale. L’immunità indotta attraverso l’infezione con il virus WSN/CKG è, inoltre, in grado di conferire protezione ai topi contro un’infezione secondaria con il virus Vaccinia ricombinante vPE16. I dati che abbiamo ottenuto complessivamente dal nostro studio indicano che un’immunizzazione mucosale, ed in particolare, un’immunizzazione per via vaginale, con un virus influenzale ricombinante che esprime un poliepitopo derivante dal virus HIV-1 può indurre nei topi una risposta immunitaria antigene-specifica, protettiva e a lungo termine.The development of an efficacious HIV vaccine is one of the world’s greatest public-health challenges. The poor understanding of immune correlates of protection and the widespread genetic diversity of the virus pose substantial scientific hurdles. HIV infection is a mucosal acquired disease. Therefore, mucosal immune responses might function as a first line of defense against viral infection, and the development of vaccines against HIV-1 able to elicit mucosal immunity is a high priority. In particular, immunization targeting local mucosal surfaces or the regional lymph nodes to elicit both humoral and cellular specific immune responses may present a strategy for preventing or controlling HIV-1 replication. A number of clinical and experimental observations suggest that CD8+ T cells play an important role in the containment of HIV-1 infection. These include evidence of the temporal association between the appearance of HIV-specific CD8+ T cell responses following acute infection and the reduction in viral replication to set-point, the significant association of particular MHC class I alleles with protection from HIV-1 disease progression, and the increase in viral replication following depletion of CD8+ cells in the macaque model of AIDS virus infection. Several vaccine strategies depend on prime-boost protocols that produce a selective increase of memory T cells specific for the HIV antigen carried by vectors. Among the different antigen delivery systems, live recombinant viral vectors have the capacity of inducing strong cellular immune responses and can also prime antibody responses against expressed foreign antigens. In particular, recombinant influenza viruses engineered to express HIV-1 antigens represent promising tools to elicit both mucosal and systemic immune responses against HIV-1. Therefore, we generated a recombinant Influenza A virus (WSN/CKG) expressing the peptide cluster PCLUS3, derived from the gp120 of HIV-1, the P18IIIB cytotoxic T-lymphocyte (CTL) epitope derived from the V3 loop of HIV-1 IIIB gp120, and a second CTL epitope derived from Gag of HIV-1, fused to the N-terminal end of mature HA of A/WSN/33 virus. Then, we determined the capacity of WSN/CKG virus to induce antigen-specific mucosal and systemic immune responses upon intranasal or vaginal infection of progesterone-treated mice, and to provide protection against challenge with recombinant Vaccinia viruses, expressing Env (vPE16) or Gag (vDK1) proteins from HIV-1. We observed that a single vaginal inoculation of mice with WSN/CKG virus elicited antigen-specific CD8+ T cells, in the spleen and iliac lymph nodes (ILNs) draining the genitorectal mucosa, that peaked around day 7 postinfection, and that were rapidly recalled in the spleen upon intraperitoneal challenge with the recombinant Vaccinia viruses vPE16 and vDK1. These results were similar to those observed in mice primed intranasally with WSN/CKG virus. We therefore measured V3 loop-specific antibodies in serum samples of mice at 1 month post single immunization with WSN/CKG virus, and we observed significant levels of P18IIIB-specific IgG in mice receiving virus either by vaginal or intranasal route. Finally, we provide evidence that immune responses induced by WSN/CKG virus in the mucosal and systemic lymphoid compartments result in protection against systemic vPE16 virus challenge. Overall, these results indicate that mucosal immunization and, in particular, local vaginal immunization with recombinant Influenza viruses can provide protective and durable specific immune responses in mice

Vettori virali influenzali contenenti determinanti antigenici di HIV-1 inducono immunità protettiva nei topi dopo singola immunizzazione per via mucosale

Lo sviluppo di un vaccino efficace contro il virus dell’HIV-1 è una delle più importanti sfide che la Sanità pubblica sta affrontando in questi ultimi 20 anni. Una conoscenza ancora incompleta dei correlati di protezione e la variabilità genetica del virus HIV pone sostanziali impedimenti al raggiungimento di questo obiettivo. L’infezione dal virus HIV-1 si acquisisce prevalentemente attraverso la mucosa del tratto genito-rettale, pertanto, l’induzione di un’immunità mucosale rappresenta uno degli obiettivi primari nelle strategie che mirano a definire un efficace vaccino per il virus HIV-1. In particolare, un’immunizzazione in grado di attivare una risposta sia cellulare che umorale nelle mucose coinvolte nei processi di acquisizione del virus o dei linfonodi regionali può rappresentare una strategia efficace di prevenzione o controllo della replicazione e diffusione del virus dal sito di ingresso, ai tessuti linfoidi e al sangue. Numerose osservazioni suggeriscono il ruolo importante che i linfociti T CD8+ svolgono nel contenimento dell’infezione con il virus HIV-1, tra queste l’evidenza dell’associazione temporale tra la comparsa di una risposta mediata dai linfociti T HIV-specifici in seguito all’infezione acuta e la riduzione della replicazione virale ad un livello stabile (set-point), l’associazione significativa di particolari alleli MHC I con la protezione dalla progressione della malattia, e l’aumento della replicazione virale in seguito alla deplezione dei linfociti T CD8+ in modelli di studio macachi/HIV-1. Diverse strategie vaccinali nei confronti del virus HIV-1 si basano sull’impiego di protocolli di “prime-boost” in grado di indurre un aumento selettivo di linfociti T della memoria specifici per antigeni del virus HIV trasportati da vettori. Tra i diversi sistemi di trasporto e rilascio di antigeni, i vettori virali vivi ricombinanti sono ampiamente considerati, poiché hanno la capacità di attivare una forte risposta cellulare ed anticorpale nei confronti degli antigeni che esprimono. Il virus influenzale ricombinante, che esprime antigeni estranei provenienti dal virus HIV-1, è uno strumento promettente in tal senso. Alla luce di tali premesse abbiamo ritenuto interessante valutare la capacità di un virus influenzale di tipo A che esprime un poliepitopo HIV fuso all’estremità N-terminale della emagglutinina (HA) matura, di indurre una risposta immunitaria cellulare e umorale in seguito all’infezione di topi BALB/c per via vaginale e di conferire protezione nei confronti di un’infezione secondaria con i virus Vaccinia ricombinanti che esprimono gli stessi antigeni. In particolare abbiamo generato un virus influenzale ricombinante dal fenotipo attenuato (WSN/CKG), che esprime il peptide cluster PCLUS3, derivato dalla glicoproteina gp120 di HIV-1, il peptide P18IIIB, epitopo per i linfociti T citotossici (CTL) derivato dal loop V3 della gp120 di HIV-1 IIIB, e un secondo epitopo CTL derivato dalla proteina Gag di HIV-1, nella regione N-terminale del virus A/WSN/CKG. Mediante saggi ELISPOT, abbiamo osservato che una singola somministrazione per via vaginale con il virus WSN/CKG, induce nei topi una risposta immune a lungo termine mediata da linfociti T CD8+ antigene-specifici, nei linfonodi iliaci (ILN) drenanti la mucosa genito-rettale, e nella milza dei topi infettati, con un picco intorno al settimo giorno dopo l’infezione, che viene rapidamente richiamata nella milza in seguito ad un’infezione secondaria con il virus Vaccinia esprimente la proteina Env (vPE16) o Gag (vDK1). Tali risultati sono analoghi se i topi vengono immunizzati per via intranasale. Abbiamo poi analizzato mediante saggi ELISA la produzione di anticorpi antigene-specifici nel siero di topi ad un mese dall’infezione con il virus WSN/CKG e abbiamo osservato elevati livelli di IgG P18IIIB-specifiche nei topi che sono stati infettati sia per via intranasale che vaginale. L’immunità indotta attraverso l’infezione con il virus WSN/CKG è, inoltre, in grado di conferire protezione ai topi contro un’infezione secondaria con il virus Vaccinia ricombinante vPE16. I dati che abbiamo ottenuto complessivamente dal nostro studio indicano che un’immunizzazione mucosale, ed in particolare, un’immunizzazione per via vaginale, con un virus influenzale ricombinante che esprime un poliepitopo derivante dal virus HIV-1 può indurre nei topi una risposta immunitaria antigene-specifica, protettiva e a lungo termine.The development of an efficacious HIV vaccine is one of the world’s greatest public-health challenges. The poor understanding of immune correlates of protection and the widespread genetic diversity of the virus pose substantial scientific hurdles. HIV infection is a mucosal acquired disease. Therefore, mucosal immune responses might function as a first line of defense against viral infection, and the development of vaccines against HIV-1 able to elicit mucosal immunity is a high priority. In particular, immunization targeting local mucosal surfaces or the regional lymph nodes to elicit both humoral and cellular specific immune responses may present a strategy for preventing or controlling HIV-1 replication. A number of clinical and experimental observations suggest that CD8+ T cells play an important role in the containment of HIV-1 infection. These include evidence of the temporal association between the appearance of HIV-specific CD8+ T cell responses following acute infection and the reduction in viral replication to set-point, the significant association of particular MHC class I alleles with protection from HIV-1 disease progression, and the increase in viral replication following depletion of CD8+ cells in the macaque model of AIDS virus infection. Several vaccine strategies depend on prime-boost protocols that produce a selective increase of memory T cells specific for the HIV antigen carried by vectors. Among the different antigen delivery systems, live recombinant viral vectors have the capacity of inducing strong cellular immune responses and can also prime antibody responses against expressed foreign antigens. In particular, recombinant influenza viruses engineered to express HIV-1 antigens represent promising tools to elicit both mucosal and systemic immune responses against HIV-1. Therefore, we generated a recombinant Influenza A virus (WSN/CKG) expressing the peptide cluster PCLUS3, derived from the gp120 of HIV-1, the P18IIIB cytotoxic T-lymphocyte (CTL) epitope derived from the V3 loop of HIV-1 IIIB gp120, and a second CTL epitope derived from Gag of HIV-1, fused to the N-terminal end of mature HA of A/WSN/33 virus. Then, we determined the capacity of WSN/CKG virus to induce antigen-specific mucosal and systemic immune responses upon intranasal or vaginal infection of progesterone-treated mice, and to provide protection against challenge with recombinant Vaccinia viruses, expressing Env (vPE16) or Gag (vDK1) proteins from HIV-1. We observed that a single vaginal inoculation of mice with WSN/CKG virus elicited antigen-specific CD8+ T cells, in the spleen and iliac lymph nodes (ILNs) draining the genitorectal mucosa, that peaked around day 7 postinfection, and that were rapidly recalled in the spleen upon intraperitoneal challenge with the recombinant Vaccinia viruses vPE16 and vDK1. These results were similar to those observed in mice primed intranasally with WSN/CKG virus. We therefore measured V3 loop-specific antibodies in serum samples of mice at 1 month post single immunization with WSN/CKG virus, and we observed significant levels of P18IIIB-specific IgG in mice receiving virus either by vaginal or intranasal route. Finally, we provide evidence that immune responses induced by WSN/CKG virus in the mucosal and systemic lymphoid compartments result in protection against systemic vPE16 virus challenge. Overall, these results indicate that mucosal immunization and, in particular, local vaginal immunization with recombinant Influenza viruses can provide protective and durable specific immune responses in mice

Structural basis of antiviral activity of peptides from MPER of FIV gp36

Feline immunodeficiency virus (FIV) is a naturally occurring Lentivirus causing acquired immunodeficiency syndrome in felines. It is considered a useful non-primate model to study HIV infection, and to test anti-HIV vaccine. Similarly to HIV, FIV enters cells via a mechanism involving a surface glycoprotein named gp36. C8 is a short synthetic peptide corresponding to the residues770WEDWVGWI777of gp36 membrane proximal external region (MPER). It elicits antiviral activity by inhibiting the fusion of the FIV and host cell membrane. C8 is endowed with evident membrane binding property, inducing alteration of the phospholipid bilayer and membrane fusion. The presence and the position of tryptophan residues in C8 are important for antiviral activity: the C8 derivative C6a, obtained by truncating the N-terminal770WE771residues, exhibits conserved antiviral activity, while the C8 derivative C6b, derived from the truncation of the C-terminal776WI777, is nearly inactive. To elucidate the structural factors that induce the different activity profiles of C6a and C6b, in spite of their similarity, we investigated the structural behaviour of the two peptides in membrane mimicking environments. Conformational data on the short peptides C6a and C6b, matched to those of their parent peptide C8, allow describing a pharmacophore model of antiviral fusion inhibitors. This includes the essential structural motifs to design new simplified molecules overcoming the pharmacokinetic and high cost limitations affecting the antiviral entry inhibitors that currently are in therapy

Saliva of patients affected by salivary gland tumour: An NMR metabolomics analysis

Cancers affecting the salivary glands have been an increasing incidence. Salivary gland cancer is not detected until it reaches an advanced stage, which would generally result in a poor prognosis and survival rate. Therefore, early detection as well as the screening of high risk populations with precancerous lesions remains an unmet medical need. In the present work, we present a NMR-based metabolomic study of the saliva of patients suffering from salivary gland tumours. Analysis of data was done using a combined approach based on PRICONA quantitative analysis and statistical multivariate analysis. Interestingly, both the analytical methods indicate that individuals affected by parotid tumour have a characteristic metabolomic profile characterized by abnormalities in the concentration of several aminoacids. Among these the most significant are those relative to Alanine and Leucine suggestive of an alteration in the metabolic pathways of glycogenic aminoacids and ketone bodies. Our data, describing the preliminary metabolomics fingerprint of parotid tumour, are consistent with the recent view that oncogenic signalling corresponds to alteration in the metabolism of nutrient pull (Vander Heiden et al., 2009), rather than to a single metabolite

NMR Structure of the FIV gp36 C-terminal Heptad Repeat and Membrane-Proximal External Region

Feline immunodeficiency virus (FIV), a lentivirus causing an immunodeficiency syndrome in cats, represents a relevant model of pre-screening therapies for human immunodeficiency virus (HIV). The envelope glycoproteins gp36 in FIV and gp41 in HIV mediate the fusion of the virus with the host cell membrane. They have a common structural framework in the C-terminal region that includes a Trp-rich membrane-proximal external region (MPER) and a C-terminal heptad repeat (CHR). MPER is essential for the correct positioning of gp36 on the lipid membrane, whereas CHR is essential for the stabilization of the low-energy six-helical bundle (6HB) that is necessary for the fusion of the virus envelope with the cell membrane. Conformational data for gp36 are missing, and several aspects of the MPER structure of different lentiviruses are still debated. In the present work, we report the structural investigation of a gp36 construct that includes the MPER and part of the CHR domain (737-786gp36 CHR–MPER). Using 2D and 3D homo and heteronuclear NMR spectra on 15N and 13C double-labelled samples, we solved the NMR structure in micelles composed of dodecyl phosphocholine (DPC) and sodium dodecyl sulfate (SDS) 90/10 M: M. The structure of 737-786gp36 CHR–MPER is characterized by a helix–turn–helix motif, with a regular α-helix and a moderately flexible 310 helix, characterizing the CHR and the MPER domains, respectively. The two helices are linked by a flexible loop regulating their orientation at a ~43° angle. We investigated the positioning of 737-786gp36 CHR–MPER on the lipid membrane using spin label-enhanced NMR and ESR spectroscopies. On a different scale, using confocal microscopy imaging, we studied the effect of 737-786gp36 CHR–MPER on 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine/1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol) (DOPC/DOPG) multilamellar vesicles (MLVs). This effect results in membrane budding and tubulation that is reminiscent of a membrane-plasticizing role that is typical of MPER domains during the event in which the virus envelope merges with the host cell membrane