Chemical characterization and bioactivity of commercial essential oils obtained from Portuguese logging residues and thinnings

Tese de mestrado, Biologia dos Recursos Vegetais, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2022Nowadays, the demand of cosmetics with sustainable and natural origin ingredients is a common practice in the cosmetic industry. Essential oils (EOs) and hydrolates are natural sources of biologically active ingredients because of their chemical composition and broad application. In this study, national producers (mainland Portugal and Azores archipelago) EOs (11) and hydrolates (7) obtained from forest logging and thinning of Eucalyptus globulus, Pinus pinaster, Pinus pinea and Cryptomeria japonica, were chemically evaluated, and their bioactivity and sensorial properties were assessed. EOs and hydrolates volatiles (HVs) were analyzed by gas chromatography and gas chromatography mass spectrometry. 1,8-Cineole was E. globulus EOs and HVs dominant compound, while α- and β-pinene dominated P. pinaster EOs. Limonene and α-pinene were predominant in P. pinea and C. japonica EOs, respectively. P. pinaster and C. japonica HVs were dominated by α-terpineol and terpinene-4-ol, respectively. Antioxidant activity was determined by radical scavenging ability of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and intracellular ROS measurement. C. japonica EO showed the highest antioxidant activity, whereas one of E. globulus EOs showed the lowest activity. Antimicrobial activity was evaluated by the microdilution plate method determining the minimum inhibitory concentration for Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli TCC 8739, Candida albicans ATCC 10231 and Aspergillus brasiliensis ATCC 16404. Eucalyptus EOs showed the greatest efficacy against the selected strains while C. japonica EO had no antimicrobial activity against these strains. P. pinea EO had similar efficacy against B. subtilis ATCC 6633 as two of E. globulus EOs. Sensory double-blind evaluation, approved by the local Ethical Committee, was performed in human volunteers. A structured questionnaire was used to collect data about the perception and applicability of different emulsions perfumed with 0.5% of EOs. C. japonica emulsion, which has a fresh and earthy odour, was chosen as the most pleasant by 60% of the volunteers, followed by P. pinea emulsion odour with 53%. C. japonica emulsion was also the one chosen for improving the sense of well-being. Overall, 19% of the volunteers selected C. japonica and P. pinea emulsions as their favorite ones. The studied EOs and Hds showed relevant antioxidant activity and promising antimicrobial activity. Moreover, they address the demand for sustainable and responsibly sourced odour accepted by consumers.Atualmente, o interesse por cosméticos com ingredientes de origem sustentável e natural é uma realidade na indústria cosmética. Os óleos essenciais (OEs) e hidrolatos (Hds) são fontes naturais de ingredientes biologicamente ativos devido à sua composição química e ampla aplicação. Neste trabalho, os onze OEs e sete Hds de produção nacional (Portugal Continental e do arquipélago dos Açores), obtidos de sobrantes de operações de desbaste e corte de Eucalyptus globulus Labill, Pinus pinaster Aiton, Pinus pinea L. e Cryptomeria japonica D. Don, foram analisados quimicamente e avaliados quanto a bioatividade e propriedades sensoriais. Os OEs, e os respetivos voláteis dos Hds (VHs), obtidos de E. globulus, P. pinaster, P. pinea e C. japonica foram isolados das folhas, agulhas e folhagem das plantas por destilação por arrastamento de vapor, analisados por cromatografia gasosa para a quantificação dos seus componentes, e por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa para a identificação dos compostos. Os OEs isolados são complexas misturas, nas quais foram identificados entre 44 a 49 constituintes no E. globulus, entre 63 a 68 no P. pinaster, 50 no P. pinea e 79 na C. japonica. Nos VHs das amostras de E. globulus foram identificados entre 46 a 58 constituintes, 38 e 42 no P. pinaster e 44 no C. japonica. Monoterpenos oxigenados foi a classe dominante de compostos no OE e nos VHs de E. globulus, 56- 72% e 84-92%, respetivamente. Os hidrocarbonetos monoterpénicos variaram entre 24-43% neste OE e 2-14% nos VHs enquanto que os sesquiterpenos variaram de 0.2 a 6% no OE e os sesquiterpenos oxigenados entre vestigial a 1% nos VHs. Além disto, os monoterpenos oxigenados também foram a classe predominante nos VHs de P. pinaster e C. japonica, 95 e 79%, respetivamente. Os hidrocarbonetos monoterpénicos variaram de vestigial a 4% para os VHs de P. pinaster e nos VHs de C. japonica estiveram presentes em 2%. Sesquiterpenos oxigenados foram identificados nos VHs de P. pinaster e C. japonica em valores vestigiais e de 10%, respetivamente. Além disto, fenilpropanóides estavam presentes em valores vestigiais nos VHs de P. pinaster. Hidrocarbonetos diterpénicos, foram identificados nos VHs de C. japonica (5%). Os OEs de P. pinaster, P. pinea e C. japonica foram, predominantemente, compostos por hidrocarbonetos monoterpénicos (70 a 82%, 88% e 66%, respetivamente). Monoterpenos oxigenados foram identificados em menor concentração, 1-3%, 7% e 6%, respetivamente. Os sesquiterpenos variaram de 0.1 a 23% para o OE de P. pinaster, de 1 a 4% no OE de P. pinea e de 2-8% no OE C. japonica. Diterpenos e fenilpropanóides foram identificados no OE de C. japonica em 17% e em valores vestigiais, respetivamente. 1,8-Cineole, foi o composto dominante no OE e nos VHs de E. globulus, enquanto α- e β-pineno dominaram no OE de P. pinaster. Limoneno e α-pineno foram os principais compostos presentes nos OEs de P. pinea e C. japonica, respetivamente. Nos VHs de P. pinaster e C. japonica, os compostos dominantes foram α-terpineol e terpinen-4-ol, respetivamente. A atividade antioxidante dos OEs e Hds foi determinada utilizando-se a capacidade de eliminação do radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), a capacidade de absorção do radical de oxigénio (ORAC) e a medição intracelular de espécies reativas de Oxigénio (ROS). No ensaio DPPH os OEs apresentaram fraca atividade antioxidante, exceto o de C. japonica que apresentou o menor valor de IC50, seguindo se de uma das amostra de OE de P. pinaster. A atividade antioxidante demonstrada pelo OE de C. japonica pode ser justificada pela presença, em menores quantidades, de compostos antioxidantes como o sabineno, β-mirceno e γ-terpineno. Por outro lado, a atividade antioxidante contra o radical DPPH, apresentada pelo OE de C. japonica, pode dever-se à presença de compostos como o terpinen-4-ol, β pineno e limoneno, conhecidos pelas suas propriedades antioxidantes. Os Hds da C. japonica não apresentaram atividade contra o radical DPPH. A atividade antioxidante contra o radical DPPH, apresentada pela amostra de OE de P. pinaster pode dever-se a uma elevada concentração de β-mirceno, anteriormente descrito como tendo atividade antioxidante. No método do ORAC os OEs apresentaram maior capacidade antioxidante, com ênfase para uma amostra de P. pinaster e para o OE de C. japonica. A atividade antioxidante determinada por esta metodologia foi demonstrada por uma das amostras de OE de P. pinaster o que poderá ser justificado pela presença de compostos antioxidantes, em menores quantidades, como o β-cariofileno. Por outro lado, os Hds demonstraram ter atividade antioxidante, embora menor. Uma das amostras de Hd de E. globulus foi a que apresentou maior capacidade antioxidante, devido provavelmente à presença do limoneno, presente numa maior percentagem quando comparado com as restantes amostras. No ensaio de medição intracelular de ROS, os OEs apresentaram baixa capacidade de redução da percentagem de ROS quando comparados com as amostras de Hds. Contudo, o OE de C. japonica apresentou uma maior atividade antioxidante de redução de % de ROS, comparativamente aos restantes e, por outro lado, uma das amostras de OE de E. globulus foi a que teve a menor atividade. Relativamente aos hidrolatos, o Hd de C. japonica apresentou a melhor capacidade antioxidante provavelmente devido ao seu principal componente, o terpinen-4-ol, que revelou capacidades antioxidantes noutros estudos. Os valores da concentração inibitória mínima (MIC) para os OEs e respetivos Hds permitiu determinar a atividade antimicrobiana pelo método da microdiluição em placa. Utilizaram-se as estirpes de Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Escherichia coli ATCC 8739, Candida albicans ATCC 10231 e Aspergillus brasiliensis ATCC 16404. Em relação às bactérias gram-positivas e negativas, observou-se que o Staphylococcus aureus apresentou uma maior resistência contra a maioria dos OEs; Bacillus subtilis mostrou-se bastante suscetível aos OEs, sobretudo para uma das amostras de E. globulus; Pseudomonas aeruginosa foi extremamente resistente aos OEs e, finalmente, Escherichia coli foi a mais suscetível sobretudo às amostras de OE de E. globulus. As amostras de OE de E. globulus foram mais eficazes contra leveduras, apresentando melhor atividade anti-levedura que P. pinaster e P. pinea. Os OEs não demonstraram atividade antifúngica contra a estirpe Aspergillus brasiliensis. O OE de C. japonica, e uma amostra de OE de P. pinaster, não apresentaram propriedades antimicrobianas, anti-leveduras e antifúngicas contra nenhuma das estirpes selecionadas. Por outro lado, nenhum dos Hds apresentou atividade antimicrobiana. Assim, os OEs de eucalipto apresentaram maior eficácia contra as estirpes selecionadas, enquanto o OE de C. japonica não apresentou atividade antimicrobiana contra essas estirpes. O OE de P. pinea teve eficácia idêntica a dois OEs de E. globulus contra a B. subtilis o que pode estar relacionado com o conteúdo em 1,8-cineol. A avaliação sensorial de emulsões de aplicação cutânea com 0.5% de cada um dos OEs foi realizada em 100 voluntários após aprovação do estudo pelo Comité de Ética local. Um questionário estruturado foi usado para avaliar a perceção e a aplicabilidade de diferentes emulsões perfumadas. A emulsão de C. japonica, caracterizada por apresentar um odor fresco e terroso, foi escolhida como a mais agradável por 60% dos voluntários, seguida da emulsão de P. pinea responsável por 53% das respostas. Por outro lado, a emulsão de E. globulus foi considerada como tendo o odor mais intenso, em comparação com as restantes, e tendo sido identificada como sendo a menos agradável (36%). A emulsão perfumada com C. japonica também foi a escolhida por dar a melhor a sensação de bem-estar. No geral, 19% dos voluntários selecionaram as emulsões contendo OEs de C. japonica e P. pinea como as suas favoritas. Estes resultados estão relacionados com a composição química dos OEs. De uma forma resumida, e perante os resultados obtidos, pode-se concluir que os OEs e Hds avaliados possuem atividade antioxidante relevante e atividade antimicrobiana promissora. Além disto, foram bem aceites pelo painel de voluntários o que permite a sua utilização como ingredientes naturais e sustentáveis em produtos cosméticos

Prática de ensino supervisionada em educação pré-escolar: desenvolver a capacidade de lidar com dados

O presente relatório transpõe a intervenção realizada no âmbito das unidades curriculares da PES, inserida no Mestrado em Educação Pré-Escolar da Universidade de Évora. A intervenção decorreu em dois contextos, primeiramente numa sala de Creche e posteriormente numa sala de Jardim de Infância. Os objetivos, neste estudo, são compreender, analisar e refletir sobre como é possível e como desenvolvem as crianças a capacidade de lidar com dados. Assim, nesta investigação são exploradas questões como: i)recolha, organização e registo de dados; ii)representação dos dados; iii)análise dos dados. No decorrer da intervenção realizei uma investigação que consistiu na implementação de atividades que permitiram às crianças lidar com dados e que possibilitaram a minha recolha de dados acerca do tema. Na análise dos dados tive em conta os referenciais teóricos consultados e os objetivos da investigação, para perceber e transmitir a capacidade de lidar com dados, desenvolvida nas crianças de educação pré-escolar; Supervised Teaching Practice in Preschool Education: Develop the ability to handle data ABSTRACT: This report transposes the intervention carried out in the course of PES, part of the Master in Preschool Education, University of Évora. The intervention took place in two contexts: firstly in a Nursery room and later in a kindergarten room. The objectives in this study are understand, analyze and reflect on how to do it and how to develop children's ability to handle data. This research explored questions such as: i) collection, compilation and data set; ii) representation of the data; iii) data analysis. During was intervention realized an investigation that consisted on the implementation of activities that allow children handle data and helped collecting information about the subject. When analyzing data were consulted the theoretical framework and the objectives of the investigation, in order to realize and transmit the capacity to handle data developed by children in pre-school education

UMA VIAGEM PELAS FUNÇÕES DO DELEGADO DE DISCIPLINA: um estudo realizado no ensino secundário de São Tomé e Príncipe

Intermediate school leaders play an important role in improving pedagogical practices and curriculum development and, in this context, pedagogical supervision emerges as an indispensable tool for the professional development of teachers. Our investigation focuses on these leaders in São Tomé and Príncipe on the subject heads of department of secondary education, stating as a general objective to know their representations regarding the required competences and functions and how these intersect with the representations of the directors of school and pedagogical supervisors in the light of legislation and literature. The study follows a mixed methodology, collecting data of a quantitative and qualitative nature. We built a questionnaire composed of closed and open questions that was applied to 130 on the subject heads of department of secondary education. Quantitative data were subjected to descriptive statistical treatment and qualitative data were subject to content analysis. The results show that the on the subject heads of department dedicate more time to bureaucratic tasks, followed by pedagogical tasks and, finally, tasks with a controlling nature, although they mentioned that they value pedagogical tasks more. They also mention support, help, collaboration, and evaluation as tasks inherent to the performance of the function, which allows us to infer that they are situated in collaborative supervision, with significant evidence of monitoring and regulation. It is perceived that the on the subject heads of department seek to increase their skills and knowledge, in terms of disciplinary and didactic content, to improve their performance and the quality of education.Los líderes de las escuelas intermedias juegan un papel importante en la mejora de las prácticas pedagógicas y el desarrollo curricular y, en este contexto, la supervisión pedagógica surge como una herramienta indispensable para el desarrollo profesional de los docentes. Nuestra investigación se centra en estos líderes en São Tomé y Príncipe, en particular, en el tema delegados de educación secundaria, planteando como objetivo general conocer sus representaciones en cuanto a las competencias y funciones requeridas y cómo estas se cruzan con las representaciones de los directores de escuela y supervisores pedagógicos a la luz de la legislación y la literatura. El estudio sigue una metodología mixta, recogiendo datos de carácter cuantitativo y cualitativo. Construimos un cuestionario compuesto por preguntas cerradas y abiertas que fue aplicado a 130 delegados de educación secundaria. Los datos cuantitativos se sometieron a tratamiento estadístico descriptivo y los datos cualitativos se sometieron a análisis de contenido. Los resultados muestran que los delegados dedican más tiempo a las tareas burocráticas, seguido de las tareas pedagógicas y, por último, las tareas con carácter de control, aunque mencionaron que valoran más las tareas pedagógicas. También mencionan el apoyo, la ayuda, la colaboración y la evaluación como tareas inherentes al desempeño de la función, lo que permite inferir que se sitúan en la supervisión colaborativa, con importantes evidencias de seguimiento y regulación. Se percibe que los delegados buscan incrementar sus habilidades y conocimientos, en cuanto a contenido disciplinar y didáctico, para mejorar su desempeño y la calidad de la educación.As lideranças intermédias na escola assumem um papel relevante na melhoria das práticas pedagógicas e no desenvolvimento curricular e, neste contexto, a supervisão pedagógica surge como ferramenta indispensável ao desenvolvimento profissional docente. A nossa investigação foca-se nestas lideranças em São Tomé e Príncipe, em particular, nos delegados de disciplina do ensino secundário, enunciando como objetivo geral conhecer as suas representações relativamente às competências requeridas e funções e como estas se cruzam com as representações dos diretores de escola e supervisores pedagógicos à luz da legislação e da literatura. O estudo segue uma metodologia mista, recolhendo-se dados de natureza quantitativa e qualitativa. Construímos um questionário composto por questões fechadas e abertas que foi aplicado aos 130 delegados de disciplina do ensino secundário. Os dados quantitativos foram sujeitos a um tratamento estatístico descritivo e os qualitativos foram alvo de análise de conteúdo. Os resultados apontam que os delegados dedicam mais tempo a tarefas burocráticas, seguidas das pedagógicas e, por fim, a tarefas com cunho controlador, embora tenham referido que valorizam mais as tarefas pedagógicas. Referem ainda o apoio, a ajuda, a colaboração e a avaliação como tarefas inerentes ao exercício da função, o que nos permite inferir situarem-se numa supervisão colaborativa, com evidências significativas de monitorização e regulação. Perceciona-se que os delegados procuram incrementar as suas competências e conhecimentos, a nível dos conteúdos disciplinares e da didática por forma a melhorar o seu desempenho e a qualidade da educação

UMA VIAGEM PELAS FUNÇÕES DO DELEGADO DE DISCIPLINA: um estudo realizado no ensino secundário de São Tomé e Príncipe

As lideranças intermédias na escola assumem um papel relevante na melhoria das práticas pedagógicas e no desenvolvimento curricular e, neste contexto, a supervisão pedagógica surge como ferramenta indispensável ao desenvolvimento profissional docente. A nossa investigação foca-se nestas lideranças em São Tomé e Príncipe, em particular, nos delegados de disciplina do ensino secundário, enunciando como objetivo geral conhecer as suas representações relativamente às competências requeridas e funções e como estas se cruzam com as representações dos diretores de escola e supervisores pedagógicos à luz da legislação e da literatura. O estudo segue uma metodologia mista, recolhendo-se dados de natureza quantitativa e qualitativa. Construímos um questionário composto por questões fechadas e abertas que foi aplicado aos 130 delegados de disciplina do ensino secundário. Os dados quantitativos foram sujeitos a um tratamento estatístico descritivo e os qualitativos foram alvo de análise de conteúdo. Os resultados apontam que os delegados dedicam mais tempo a tarefas burocráticas, seguidas das pedagógicas e, por fim, a tarefas com cunho controlador, embora tenham referido que valorizam mais as tarefas pedagógicas. Referem ainda o apoio, a ajuda, a colaboração e a avaliação como tarefas inerentes ao exercício da função, o que nos permite inferir situarem-se numa supervisão colaborativa, com evidências significativas de monitorização e regulação. Perceciona-se que os delegados procuram incrementar as suas competências e conhecimentos, a nível dos conteúdos disciplinares e da didática por forma a melhorar o seu desempenho e a qualidade da educação

TPC2 is a novel NAADP-sensitive Ca2+ release channel, operating as a dual sensor of luminal pH and Ca2+

Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) is a molecule capable of initiating the release of intracellular Ca2+ required for many essential cellular processes. Recent evidence links two-pore channels (TPCs) with NAADP-induced release of Ca2+ from lysosome-like acidic organelles; however, there has been no direct demonstration that TPCs can act as NAADP-sensitive Ca2+-release channels. Controversial evidence also proposes ryanodine receptors as the primary target of NAADP. We show that TPC2, the major lysosomal targeted isoform, is a cation channel with selectivity for Ca2+ that will enable it to act as a Ca2+ release channel in the cellular environment. NAADP opens TPC2 channels in a concentration-dependent manner, binding to high affinity activation and low affinity inhibition sites. At the core of this process is the luminal environment of the channel. The sensitivity of TPC2 to NAADP is steeply dependent on the luminal [Ca2+] allowing extremely low levels of NAADP to open the channel. In parallel, luminal pH controls NAADP affinity for TPC2 by switching from reversible activation of TPC2 at low pH to irreversible activation at neutral pH. Further evidence earmarking TPCs as the likely pathway for NAADP-induced intracellular Ca2+ release is obtained from the use of Ned-19, the selective blocker of cellular NAADP-induced Ca2+ release. Ned-19 antagonizes NAADP-activation of TPC2 in a non-competitive manner at 1 μM but potentiates NAADP activation at nanomolar concentrations. This single-channel study provides a long awaited molecular basis for the peculiar mechanistic features of NAADP signaling and a framework for understanding how NAADP can mediate key physiological events.Publisher PDFPeer reviewe

TPC: the NAADP discovery channel?

Abstract The Ca 2 + -mobilizing second messenger, NAADP (nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate), has been with us for nearly 20 years and yet we still cannot fully agree on the identity of its target Ca 2 + -release channel. In spite of some recent robust challenges to the idea that two-pore channels (TPCs) represent the elusive "NAADP receptor", evidence continues to accumulate that TPCs are important for NAADP-mediated responses. This article will briefly outline the background and review more recent work pertaining to the TPC story. Acidic Ca 2 + stores Ca 2 + mobilization from intracellular stores is an ancient and conserved signal transduction pathway from plants to animals, and while the study of the endoplasmic reticulum (ER) Ca 2 + store has dominated this arena for decades, another organelle Ca 2 + store family -the acidic Ca 2 + stores -is stepping out from the shadow of its bigger brother and assuming an importance in its own right. The so-called acidic Ca 2 + stores encompass a spectrum of organelles with an acidic lumen such as endosomes, lysosomes, secretory vesicles and lysosome-related organelles (that include vacuoles, secretory lysosomes and yolk platelets) [1]. That these organelles are key for diverse cellular functions is without doubt, that they also store and release Ca 2 + may be less familiar but arguably just as important. How Ca 2 + is sequestered into these acidic vesicles is unclear for higher organisms but, by analogy with the better understood plants and yeast systems [2], it is anticipated to involve some form of Ca NAADP, a unique messenger The archetypal ER Ca 2 + store is mobilized by IP 3 or cADPR and, in a comparable manner, acidic Ca 2 + stores are mobilized by their own unique second messenger, NAADP (nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate) [1]. Key words: NAADP, TPC, Ca 2 + , lysosome, endosome. Abbreviations: ER, endoplasmic reticulum; NAADP, nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate; pHL, luminal pH; PI(3,5)P2, phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate; RyRs, ryanodine receptors; TPCs, two-pore channels; TRPML1, mucolipin-1. 1 To whom correspondence should be addressed (email Anthony.morgan@pharm. ox.ac.uk). Coupled to a burgeoning list of extracellular stimuli, NAADP plays a unique role and is physiologically important in contexts as broad as fertilization, immunology, angiogenesis, cardiac function and autophagy [9]. However, the identity of the Ca 2 + -release channel targeted by NAADP has long been sought and debated, with several candidate channels proposed over the years including ryanodine receptors (RyRs), mucolipin-1 (TRPML1), TRPM2 and the two-pore channel family (TPCs) [1]. TPCs have received the lion's share of recent attention owing to a substantial body of evidence linking it to NAADP, as we shall briefly discuss. . This was a tantalizing development because the vacuole is the acidic Ca 2 + store in plants, and pre-empted a cluster of papers in 2009 that proposed that the animal orthologues of TPC were endo-lysosomal Ca 2 + -release channels activated by NAADP i.e. TPCs were the long sought after "NAADP receptors" [13][14][15]. TPCs: a new channel family Building on this foundation, different laboratories subsequently appeared to confirm and extend these observations using Ca 2 + imaging and/or electrophysiology and revealed that TPCs recapitulated the properties expected of the "NAADP receptor": they were permeable to Ca 2 + (or Ca 2 + surrogates), associated with NAADP-binding sites [7] and were activated by NAADP (in mammalian cells, with the characteristic bell-shaped concentration-response curve) [16]. In view of this compelling body of evidence, it came as something of a surprise in late 2012/early 2013 when this premise was challenged by a couple of high profile papers that asserted that TPCs had nothing to do with either NAADP or Ca 2 + : TPCs were described as lipid-regulated Na + channel

Neuronal cholesterol metabolism increases dendritic outgrowth and synaptic markers via a concerted action of GGTase-I and Trk

We are deeply thankful to Professor David W. Russell (University of Texas Southwestern Medical Center) for the kind gift of the anti-CYP46A1 antibody. This work was supported by FEDER (COMPETE Programme) and national funds from Fundacao para a Ciencia e a Tecnologia (FCT), Portugal, research grants iMed.ULisboa (UID/DTP/04138/2013), PTDC/SAU/NMC/110809/2009 (to E.R.), SFRH/BD/78041/2011 (to M.M.) SFRH/BPD/95855/2013 (to M.J.N), and, Swedish Research Council (J.L.R. and I.B.), Marie Curie Career Integration Grant and Novo Nordisk Fonden (J.L.R.) and Swedish Brain Power (I.B.).Cholesterol 24-hydroxylase (CYP46A1) is responsible for brain cholesterol elimination and therefore plays a crucial role in the control of brain cholesterol homeostasis. Altered CYP46A1 expression has been associated with several neurodegenerative diseases and changes in cognition. Since CYP46A1 activates small guanosine triphosphate-binding proteins (sGTPases), we hypothesized that CYP46A1 might be affecting neuronal development and function by activating tropomyosin-related kinase (Trk) receptors and promoting geranylgeranyl transferase-I (GGTase-I) prenylation activity. Our results show that CYP46A1 triggers an increase in neuronal dendritic outgrowth and dendritic protrusion density, and elicits an increase of synaptic proteins in the crude synaptosomal fraction. Strikingly, all of these effects are abolished by pharmacological inhibition of GGTase-I activity. Furthermore, CYP46A1 increases Trk phosphorylation, its interaction with GGTase-I, and the activity of GGTase-I, which is crucial for the enhanced dendritic outgrowth. Cholesterol supplementation studies indicate that cholesterol reduction by CYP46A1 is the necessary trigger for these effects. These results were confirmed in vivo, with a significant increase of p-Trk, pre- and postsynaptic proteins, Rac1, and decreased cholesterol levels, in crude synaptosomal fractions prepared from CYP46A1 transgenic mouse cortex. This work describes the molecular mechanisms by which neuronal cholesterol metabolism effectively modulates neuronal outgrowth and synaptic markers.publishersversionpublishe

PLCζ is the physiological trigger of the Ca2+ oscillations that induce embryogenesis in mammals but conception can occur in its absence

Activation of the egg by the sperm is the first, vital stage of embryogenesis. The sperm protein PLC zeta has been proposed as the physiological agent that triggers the Ca2+ oscillations that normally initiate embryogenesis. Consistent with this, recombinant PLC zeta induces Ca2+ oscillations in eggs and debilitating mutations in the PLCZ1 gene are associated with infertility in men. However, there has been no evidence that knockout of the gene encoding PLC. abolishes the ability of sperm to induce Ca2+ oscillations in eggs. Here, we show that sperm derived from Plcz1(-/-) male mice fail to trigger Ca2+ oscillations in eggs, cause polyspermy and thus demonstrate that PLC zeta is the physiological trigger of these Ca2+ oscillations. Remarkably, some eggs fertilized by PLC zeta-null sperm can develop, albeit at greatly reduced efficiency, and after a significant time-delay. In addition, Plcz1(-/-) males are subfertile but not sterile, suggesting that in the absence of PLC zeta, spontaneous egg activation can eventually occur via an alternative route. This is the first demonstration that in vivo fertilization without the normal physiological trigger of egg activation can result in offspring. PLC zeta-null sperm now make it possible to resolve long-standing questions in fertilization biology, and to test the efficacy and safety of procedures used to treat human infertility

Identification of a Novel Gene for Diabetic Traits in Rats, Mice, and Humans

The genetic basis of type 2 diabetes remains incompletely defined despite the use of multiple genetic strategies. Multiparental populations such as heterogeneous stocks (HS) facilitate gene discovery by allowing fine mapping to only a few megabases, significantly decreasing the number of potential candidate genes compared to traditional mapping strategies. In the present work, we employed expression and sequence analysis in HS rats (Rattus norvegicus) to identify Tpcn2 as a likely causal gene underlying a 3.1-Mb locus for glucose and insulin levels. Global gene expression analysis on liver identified Tpcn2 as the only gene in the region that is differentially expressed between HS rats with glucose intolerance and those with normal glucose regulation. Tpcn2 also maps as a cis-regulating expression QTL and is negatively correlated with fasting glucose levels. We used founder sequence to identify variants within this region and assessed association between 18 variants and diabetic traits by conducting a mixed-model analysis, accounting for the complex family structure of the HS. We found that two variants were significantly associated with fasting glucose levels, including a nonsynonymous coding variant within Tpcn2. Studies in Tpcn2 knockout mice demonstrated a significant decrease in fasting glucose levels and insulin response to a glucose challenge relative to those in wild-type mice. Finally, we identified variants within Tpcn2 that are associated with fasting insulin in humans. These studies indicate that Tpcn2 is a likely causal gene that may play a role in human diabetes and demonstrate the utility of multiparental populations for positionally cloning genes within complex loci