Aplicação de peptídeos derivados da SmATPDase1 como estratégia de diagnóstico da esquistossomose

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Efeitos de anticorpos ANTI-NTPDases na proliferação de células imunes e suas implicações na esquistossomose mansoni

Extracellular nucleotides and nucleosides may act as signaling molecules that control inflammation and immune response. In this context, NTPDases represent an important family of enzymes capable of hydrolyzing di- and tri-phosphate nucleosides which regulate purinergic signaling in most living beings. The homology between different enzymes from the NTPDase family supports new investigations about the interactions of antibodies directed against isoforms of these enzymes in parasites and the connection to their isoforms expressed in mammalian hosts. The NTPDase isoforms in Schistosoma mansoni, called SmATPDases 1 and 2 are antigenic and display a significant homology with the NTPDases isoforms found in mammalian cells. The aim of this work was to verify if anti-SmATPDase 1 antibodies from serum of animals infected with S. mansoni show cross-immunoreactivity with the NTPDase 1 isoform from immune system cells of mammalians. This cross-immunoreactivity could affect cell proliferation and cell signalization, justifying a direct modulation of the purinergic signaling developed during the progression of schistosomiasis. Through western blotting technique we verified that antibodies against SmATPDase isoforms from serum of infected animals were able to recognize NTPDase isoform 1 from homogenized splenocytes and macrophages, resulting in clear display of bands with molecular weights of approximately 53 and 58 kDa. Additionally, NTPDase 1 was identified and localized in these cells by immunofluorescence. The reactivity between preparations of cells and anti-IgG antibodies present in the serum of animals with schistosomiasis (dilutions 1:50 and 1: 100) also suggested the existence of homologous proteins between the parasite and the immune cells that could be related to NTPDases. Antibodies were also able to reduce activity enzyme in preparations of macrophages (22%) and splenocytes (58%). Anti-CD39 promoted decrease in this activity by 40% and 83%, respectively. In cell proliferation assays, there was a reduction in the proliferation of macrophages in 24 h (14%), 48 h (14%) and 72 h (11%) in cells incubated with pool infected animal sera and with anti-CD39 29%, 12% and 90%, respectively. When the splenocytes culture was incubated with anti-CD39, proliferative activity increased in 48h (45%) and 72 h (70%) and in cells maintained with immune serum of the infected animal, it observed no significant difference. The lymphocyte proliferation assay by flow cytometry there is a significant increase in the number of T lymphocytes incubated with immune serum (36%) and anti-CD39 (> 100%). In turn, there was a 44% decrease in proliferation of B cells previously treated with infected animal serum and 34% in the group treated with anti-CD39. These results suggest that inhibition of NTPDase 1 of immune cells by antibodies produced against the isoforms of the S. mansoni could be responsible for modulation of the immune response during the schistosomiasis, conducting to a Th2 response. However, more tests should be carried out to confirm this hypothesis. The NTPDases inhibition may contribute for studies of the mechanisms involved in various disorders related to defects in purinergic signaling.Nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares podem funcionar como moléculas de sinalização dos processos inflamatórios e da resposta imune. Nesse contexto, as NTPDases representam uma importante família de enzimas capazes de hidrolisar nucleosídeos di e tri-fosfatados, responsáveis por regular a sinalização purinérgica na maioria dos seres vivos. A homologia entre diferentes enzimas dessa família estimula investigações das interações dos anticorpos direcionados contra as isoformas destas enzimas presentes em parasitos e sua conexão com as isoformas expressas em seus hospedeiros mamíferos. As isoformas de NTPDases do helminto Schistosoma mansoni, denominadas SmATPDases 1 e 2 são antigênicas e exibem uma homologia significativa com as isoformas de NTPDases presentes em células de mamíferos. O objetivo do trabalho foi verificar se anticorpos anti-SmATPDase 1 presentes no soro de animal infectado com S. mansoni podem ter imunorreatividade cruzada com isoforma NTPDase 1 das células do sistema imune de mamíferos. Essa imunorreatividade pode afetar a proliferação e sinalização celular, justificando uma modulação direta da sinalização purinérgica desenvolvida durante a progressão da esquistossomose. Na primeira etapa, foi detectado que os anticorpos contra a isoforma de SmATPDase 1 presente no “pool” de soros de animais infectados foram capazes de reconhecer a isoforma NTPDase 1 em preparações de macrófagos e esplenócitos, resultando na visualização de bandas nítidas com peso molecular de aproximadamente 53 e 58 kDa. A isoforma NTPDase 1 também foi identificada na superfície destas células por imunofluorescência. A reatividade entre preparações de células e anticorpos anti-IgG presentes no soro de animais com esquistossomosse (diluições 1:50 e 1:100) também sugeriu a existência de proteínas homólogas entre o parasito e as células imunes, podendo estar relacionadas às NTPDases. Estes anticorpos utilizados foram capazes de reduzir a atividade fosfohidrolítica nas preparações de macrófagos (22%) e esplenócitos (58%), assim como os anticorpos anti-CD39 promoveram decréscimo nessa atividade em 40% e 83%, respectivamente. Em ensaios de proliferação celular, houve redução na proliferação de macrófagos em 24 h (14%), 48 h (14%) e 72 h (11%) em células incubadas com “pool” soros de animais infectados e com anti-CD39 29%, 12% e 90%, respectivamente. A atividade proliferativa de esplenócitos incubadas com anti-CD39 aumentou nos tempos de 48h (45%) e 72h (70%) e nas células mantidas com soro imune de animal infectado não foi observada nenhuma diferença significativa. Em ensaio de proliferação de linfócitos por citometria de fluxo houve um aumento significativo do número de linfócitos T nos grupos incubados com soro imune (36%) e anti-CD39 (>100%). Por sua vez, houve um decréscimo de 44% na proliferação de linfócitos B tratados previamente com soro de animal infectado e de 34% no grupo tratado com anti-CD39. Com esses resultados sugerimos que a inibição da NTPDase 1 de células imunes por anticorpos produzidos contra a isoforma da enzima do S. mansoni pode ser responsável pela modulação da resposta imune que ocorre na esquistossomose, contribuindo para um perfil Th2. Porém, outros testes são necessários para corroborar essa hipótese. A inibição das NTPDases pode contribuir para o estudo dos mecanismos envolvidos em diversas disfunções relacionadas a defeitos na sinalização purinérgica

IgE antibodies from schistosomiasis patients to recognize epitopes in potato apyrase

Abstract INTRODUCTION: High percentages of structural identity and cross-immunoreactivity have been reported between potato apyrase and Schistosoma mansoni ATP diphosphohydrolase (SmATPDases) isoforms, showing the existence of particular epitopes shared between these proteins. METHODS: Potato apyrase was employed using ELISA, western blot, and mouse immunization methods to verify IgE reactivity. RESULTS: Most of the schistosomiasis patient’s (75%) serum was seropositive for potato apyrase and this protein was recognized using western blotting, suggesting that parasite and plant proteins share IgE-binding epitopes. C57BL/6 mice immunized with potato apyrase showed increased IgE antibody production. CONCLUSIONS: Potato apyrase and SmATPDases have IgE-binding epitopes

NTPDase 1 de Leishmaniabraziliensis como um alvo terapêutico: Estudos dos mecanismos pelos quais os ácidos alquilaminoalcanotiossulfúricos são antileishmaniais

A proteína nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1 (NTPDase 1) de Leishmania(Viannia) braziliensis(Lb) foi recentemente identificada como antigênica e está presente em formas promastigota e amastigota deste protozoário, sendo um possível alvo de drogas. Compostos pertencentes à série dos ácidos N-alquilaminoalcanotiossulfúricos (AAATs), de baixa toxicidade para mamíferos, foram caracterizados como novos antileishmaniais. O estudo de seus modos de ação foi iniciado, e neste trabalho os efeitos de AAATs sobre a atividade fosfohidrolítica da preparação de promastigotas são demonstrados. O ácido 2-(sec-butilamino)-1-octanotiossulfúrico (SSEC) inibe significativamente as atividades ATPásica e ADPásica da preparação de promastigotas (Ki 10-1000 µM), enquanto o ácido 1-(terc-butilamino)-2-etanotiossulfúrico (TBSO) foi menos efetivo. Adicionalmente, estudos preditivos de carga líquida do SSEC em função do pH foram efetuados e, em uma variação de pH de 1 a 8, o estado de ionização deste composto é identicamente mantido. A lipofilia do SSEC conferida pela cadeia carbônica, associada à carga positiva conferida pelo grupo amino, sugere a translocação do composto através de membranas atuando em organelas intracelulares, bem como interagindo com o parasito. A NTPDase 1 pode ser apontada como um novo alvo terapêutico e o SSEC poderá ser explorado em novos protocolos experimentais de leishmanioses

An antigenic domain within a catalytically active leishmania infantum nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase 1) is a target of inhibitory antibodies.

Weidentified a shared B domainwithin nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) of plants and parasites. Now, an NTPDase activity not affected by inhibitors of adenylate kinase and ATPases was detected in Leishmania infantum promastigotes. By non-denaturing gel electrophoresis of detergent-homogenized promastigote preparation, an active band hydrolyzing nucleosides di- and triphosphate was visualized and, following SDS-PAGE and silver staining was identified as a single polypeptide of 50 kDa. By Western blots, it was recognized by immune sera raised against potato apyrase (SA), r-pot B domain (SB), a recombinant polypeptide derived fromthe potato apyrase, and LbB1LJ (SC) or LbB2LJ (SD), synthetic peptides derived fromthe Leishmania NTPDase 1, and by serum samples from dogs with visceral leishmaniasis, identifying the antigenic L. infantum NTPDase 1 and, also, its conserved B domain (r83–122). By immunoprecipitation assays andWestern blots, immune sera SA and SB identified the catalytically active NTPDase 1 in promastigote preparation. In addition, the immune sera SB (44%) and SC or SD (87–99%) inhibited its activity, suggesting a direct effect on the B domain. By ELISA, 37%, 45% or 50% of 38 infected dogs were seropositive for r-pot B domain, LbB1LJ and LbB2LJ, respectively, confirming the B domain antigenicity

Purificação da nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1 (NTPDase 1) antigênica de Leishmania infantum

As NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases) são enzimas que hidrolisam nucleosídeos di- e trifosfatados sob ativação de íons bivalentes. Uma atividade NTPDásica foi caracterizada em promastigotas de Leishmania infantum, um protozoário causador de leishmaniose visceral.Neste trabalho, a NTPDase 1 foi purificada de preparação de promastigotas usando como estratégia eletroforese em gel não-desnaturante e os detergentes deoxicolato de sódio e Triton X-100, os quais preservam a atividade fosfohidrolítica desta enzima. Após eletroforese, incubação do gel com ATP e inibidor de ATPases do tipo P permitiu a visualização de uma única banda com depósito branco de fosfato de cálcio. Esta banda ativa foi isolada e por SDS-PAGE e coloração pela prata foi identificada como polipeptídeos de 50 e 47 kDa. Por Western blot, os dois polipeptídeos foram reconhecidos pelo soro imune anti-LbB1LJ, o qual reconhece especificamente a porção N-terminal do domínio B de NTPDases 1 de Leishmania. Por espectrometria de massas, a identidade da NTPDase 1 foi confirmada pela identificação de seis peptídeos trípticos coincidentes com a NTPDase 1 anotada em seu genoma (NCBI gi|134068433), uma cobertura de 19% de sua sequência primária. As atividades ATPásica (555 ± 93 nmol Pi x mg-1 x min-1) e ADPásica (644 ± 38 nmol Pi x mg-1 x min-1) revelaram um índice de purificação de aproximadamente 62 vezes e uma razão de atividade ATPase/ADPase de aproximadamente 1, confirmando a efetividade desta estratégia para o isolamento da NTPDase 1 de promastigotas de L. infantum