El receptor nicotíco α7 y la inflamación: modulación endógena por dupα7 y vías de señalización involucradas

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Farmacología y Terapéutica. Fecha de Lectura: 17 de febrero 2014.Los receptores nicotínicos neuronales para la acetilcolina del subtipo α7 (α7 nAChR), se encuentran ampliamente distribuidos en SNC y periférico, así como en células de naturaleza no neuronal, como queratinocitos, astrocitos, linfocitos, microglía, monocitos y macrófagos. En neuronas, el α7 nAChR presináptico modula la liberación de numerosos neurotransmisores, mientras que aquél situado postsinápticamente induce impulsos excitatorios en la correspondiente neurona. Adicionalmente, la activación de este receptor se ha asociado a fenómenos de plasticidad neuronal y supervivencia celular en SNC, mientras que en células no neuronales dicha activación regula procesos relacionados con la migración, neo-angiogénesis, proliferación, muerte celular e inflamación. Las múltiples funciones asignadas al α7 nAChR permiten deducir que una deficitaria actividad y/o una reducida expresión del mismo hayan sido implicadas en la etiopatogenia de ciertas enfermedades como el Alzheimer, Parkinson, esquizofrenia, neoplasias o en aquellas que cursan con una excesiva respuesta inflamatoria/inmune. Todo lo anterior justifica nuestro interés por el estudio de mecanismos de modulación endógena de este subtipo de receptor, así como por la identificación de nuevas vías de señalización implicadas en alguna de sus funciones. En el año 2011, nuestro grupo demostró, por primera vez, el papel funcional del gen CHRFAM7A resultante de la duplicación parcial del gen CHRNA7 que codifica para la subunidad nicotínica α7. El gen duplicado, solo presente en el genoma humano, codifica para una nueva subunidad nicotínica (dupα7) que actúa como regulador endógeno negativo de la actividad del α7 nAChR en ovocitos de Xenopus. Dada la gran homología entre las secuencias peptídicas de α7 y dupα7, no existe actualmente ningún anticuerpo específico capaz de distinguir entre una u otra subunidad nicotínica. Esta limitación ha impedido conocer el mecanismo por el que dupα7 ejerce su efecto sobre el α7 nAChR en ovocitos, así como si dicho efecto también se produce en células de mamíferos y, en caso afirmativo, cual es su posible repercusión funcional en células que expresan endógenamente α7 y dupα7, como las neuronas o los macrófagos humanos. En esta tesis se ha tratado de dar respuesta a estas cuestiones mediante la preparación de diversas construcciones conteniendo los ADNc de α7 y dupα7 marcados con diferentes epítopos o proteínas de fusión, utilizando para ello técnicas de ADN recombinante. Tras expresar estas construcciones en varias líneas celulares de mamíferos, se ha recurrido a utilizar una combinación de técnicas, incluyendo las de biología celular y molecular, bioquímicas, inmunocitoquímica y de microscopía confocal, con objeto de analizar la interacción de las subunidades nicotínicas expresadas. Nuestros resultados revelan que ambas subunidades interaccionan físicamente entre sí generando receptores mixtos α7/dupα7 en la membrana celular así como en el RE. Más aún, nuestros resultados permiten constatar que la formación de estos receptores mixtos en la membrana de células inmunes transfectadas con dupα7 tiene consecuencias funcionales; así, el efecto antiinflamatorio de nicotina observado tras la activación del α7 nAChR homomérico es parcialmente revertido cuando se trata del receptor mixto α7/dupα7. Adicionalmente, en esta tesis se ha logrado identificar una nueva vía de señalización inducida por nicotina en macrófagos humanos. Esta vía, iniciada por la activación del α7 nAChR y la consiguiente señalización a través de JAK2/STAT3/PI3K, conduce a la sobreexpresión de la serina/treonina quinasa-M asociada al receptor de interleuquina-1 (IRAK-M), un regulador negativo de la respuesta inmune innata mediada por TLR. Nuestros datos demuestran que el incremento de expresión de IRAK-M está implicado en el efecto antiinflamatorio así como en la generación de un estado de “tolerancia” inducido por nicotina en macrófagos. Ambos efectos de nicotina sobre los macrófagos pueden explicar las diferencias de riesgo y evolución clínica observadas entre pacientes fumadores y no fumadores que sufren ciertas patologías infecciosas o inmunes

A Simple and Fast Method for the Formation and Downstream Processing of Cancer-Cell-Derived 3D Spheroids: An Example Using Nicotine-Treated A549 Lung Cancer 3D Spheres.

Although 2D in vitro cancer cell cultures have been used for decades as a first line-of-research tool to investigate antitumoral drugs and treatments, their use presents many drawbacks, including the poor resemblance of such cultures to the characteristics of in vivo tumors. To mitigate these drawbacks, 3D culture models have emerged as a more representative alternative. Cancer cells cultured as 3D structures have the advantage of resembling solid tumors in their architecture and in their resistance to chemotherapeutic drugs, in part because of restrained drug penetration. Additionally, these 3D structures create a more physiological environment for the study of immune cell invasion and migration, comparable to solid tumors. In this paper, we describe a fast and cost-effective step-by-step protocol for the generation of 3D spheres using ultra-low-attachment (ULA) multiwell plates, which can be incorporated into the normal workflow of any laboratory. Using this protocol, spheroids of different human cancer cell lines can be obtained and can then be characterized on the basis of their morphology, viability, and expression of specific markers

Contribution of the α5 nAChR Subunit and α5SNP to Nicotine-Induced Proliferation and Migration of Human Cancer Cells.

Nicotine in tobacco is known to induce tumor-promoting effects and cause chemotherapy resistance through the activation of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs). Many studies have associated the α5 nicotinic receptor subunit (α5), and a specific polymorphism in this subunit, with (i) nicotine administration, (ii) nicotine dependence, and (iii) lung cancer. The α5 gene CHRNA5 mRNA is upregulated in several types of cancer, including lung, prostate, colorectal, and stomach cancer, and cancer severity is correlated with smoking. In this study, we investigate the contribution of α5 in the nicotine-induced cancer hallmark functions proliferation and migration, in breast, colon, and prostate cancer cells. Nine human cell lines from different origins were used to determine nAChR subunit expression levels. Then, selected breast (MCF7), colon (SW480), and prostate (DU145) cancer cell lines were used to investigate the nicotine-induced effects mediated by α5. Using pharmacological and siRNA-based experiments, we show that α5 is essential for nicotine-induced proliferation and migration. Additionally, upon downregulation of α5, nicotine-promoted expression of EMT markers and immune regulatory proteins was impaired. Moreover, the α5 polymorphism D398N (α5SNP) caused a basal increase in proliferation and migration in the DU145 cell line, and the effect was mediated through G-protein signaling. Taken together, our results indicate that nicotine-induced cancer cell proliferation and migration are mediated via α5, adding to the characterization of α5 as a putative therapeutical target

Características sociodemográficas y su influencia en el uso de Tecnologías de Información en Chile

Este estudio examina la relación entre características sociodemográficas de las personas y su uso de Tecnologías de Información (TI) en Chile, empleando una versión abreviada del Modelo de Aceptación de Tecnología, TAM (Technology Acceptance Model, por su sigla en inglés). Los datos recolectados apoyan al TAM, mostrando que tanto la facilidad de uso percibida (FUP) como la utilidad percibida (UP) impactan positivamente en el uso de computadores (U). A su vez, la facilidad de uso favorece la utilidad percibida. Dentro de las variables sociodemográficas, el ingreso familiar (IF) y nivel educacional (NE) influyen favorablemente en FUP, UP y el uso (U) de computadores, al contario de la edad (E), la cual impacta negativamente en dichas variables. Asimismo, se advirtió que existe una correlación positiva entre ingreso familiar y nivel educacional, y una correlación negativa entre edad y NE. A diferencia de otros estudios, esta investigación recolectó datos de una muestra heterogénea con sujetos de diferentes ingresos familiares, edades y niveles educacionales, aproximándose a la población urbana chilena. Por ello, este estudio presenta una panorámica del uso de TI, de utilidad para guiar políticas gubernamentales enfocadas en la promoción del uso colectivo de TI en un país en desarrollo.This paper examines the relationship between people’s socio-demographic characteristics and their use of Information Technology (IT) in Chile, employing an abridged version of the Technology Acceptance Model (TAM). The data collected supports the TAM, showing that the perceived easiness of use (PEOU) and perceived usefulness (PU) positively impact the use of computers (U). In turn, perceived ease of use favors perceived usefulness. Regarding the socio-demographic variables, family income (FI) and educational level (EL) positively influence PEOU, PU and U, contrary to age (A), which negatively impacts those variables. Likewise, the data showed a positive correlation between FI and EL, and a negative correlation between A and EL. Unlike previous studies, this research gathered data using a heterogeneous sample, which included subjects who exhibited different income, age, and educational levels, approximating the urban Chilean population. Thus, this paper presents a picture of the use of IT, which makes it useful for guiding government policy making aimed at promoting the collective use of IT in a developing country.  Cette étude examine les relations entre caractéristiques sociodémographiques des personnes et leur recours aux Technologies de l’Information (TI) au Chili,  usant pour cela d’une version abrégée du Modèle d’Acceptation de Technologie, TAM (Technology Acceptance Model en anglais). Les données obtenues corroborent le TAM, indiquant que la facilité d’emploi perçue (FUP en espagnol) ainsi que l’utilité perçue (UP) ont un impact positif sur l’usage des ordinateurs (U). De même, la facilité d’emploi favorise l’utilité perçue. Au sein des variables sociodémographiques, le revenu familial (IF en espagnol) et le niveau d’éducation (NE) influent favorablement sur la FUP, l’UP et l’usage (U) des ordinateurs, contrairement à l’âge (E en espagnol), qui a un impact négatif sur ces variables. De cette manière, nous remarquons qu’il existe une corrélation positive entre le revenu familial et le niveau d’éducation, ainsi qu’une corrélation négative entre l’âge et le NE. Se distinguant d’autres études, cette recherche a procéder à une collecte de données d’un échantillon hétérogène incluant des sujets de revenus familiaux, d’âges et de niveaux d’éducation variés, correspondant dans son ensemble à la population urbaine chilienne. Pour cela, ce travail présente une approche panoramique de l’usage de TI, nécessaire afin d’orienter les politiques gouvernementales destinées à promouvoir l’usage collectif de TI dans un pays en voie de développement.Este estudo examina a relação entre as características sociodemográficas dos indivíduos eo uso de Tecnologia da Informação (TI) no Chile, usando uma versão abreviada do Modelo de Aceitação de Tecnologia, TAM. Os dados coletados apoiam a TAM, mostrando que tanto a facilidade de uso percebida (FUP) e utilidade percebida (PU) têm um impacto positivo sobre o uso de computadores (U). Por sua vez, facilidade de uso promove a utilidade percebida. Entre as variáveis __sócio-demográficas, a renda familiar (IF) e nível de escolaridade (NE) influenciam favoravelmente FUP, UP e use (U) de computadores, para dizer a idade (E), que tem um impacto negativo sobre essas variáveis. Também foi observado que há uma correlação positiva entre renda familiar e nível educacional e uma correlação negativa entre idade e NE. Diferentemente de outros estudos, esta pesquisa colheu dados de uma amostra heterogênea com sujeitos de renda familiar diferente, idade e níveis de ensino, aproximando-se da população chilena urbana. Portanto, este estudo apresenta uma visão geral do uso de TI, útil para orientar as políticas governamentais voltadas para a promoção do uso coletivo de TI em um país em desenvolvimento

LETTER TO THE EDITOR

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Plasma levels of mitochondrial and nuclear DNA in patients with massive pulmonary embolism in the emergency department: A prospective cohort study

Introduction: Cell-free plasma mitochondrial DNA (mt-DNA) and nuclear DNA (n-DNA) are biomarkers with prognostic utility in conditions associated with a high rate of cell death. This exploratory study aimed to determine the plasma levels of both nucleic acids in patients with massive and submassive pulmonary embolism (PE) and to compare them with other biomarkers, such as heart-type fatty acid-binding protein (H-FABP) and troponin I (Tn-I) Methods: This was a prospective observational study of 37 consecutive patients with massive PE, 37 patients with submassive PE, and 37 healthy subjects. Quantifications of plasma mt-DNA and n-DNA with real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR), and plasma H-FABP and Tn-I by commercial assays, were done on blood samples drawn within 4 hours after presentation at the emergency department. Results: Plasma mt-DNA and n-DNA concentrations were much higher in patients with massive PE (median, 2,970 GE/ml; interquartile range (IQR), 1,050 to 5,485; and 3,325 GE/ml, IQR: 1,080 to 5,790, respectively) than in patients with submassive PE (870 GE/ml and 1,245 GE/ml, respectively; P < 0.01) or controls (185 GE/ml and 520 GE/ml, respectively). Eighteen patients with massive PE died of a PE-related cause by day 15 of observation. Plasma mt- DNA and n-DNA values were 2.3-fold and 1.9-fold higher in the subgroup of nonsurviving patients than in survivors. H-FABP and Tn-I values were also higher in patients with massive PE who died (7.3 ng/ml and 0.023 ng/ml, respectively) than in those who survived (6.4 ng/ml, and 0.016 ng/ml, respectively). By receiver operating curve (ROC) analysis, the best cutoff values for predicting 15-day mortality were 3,380 GE/ml for mt-DNA, 6.8 ng/ml for H-FABP, 3,625 GE/ml for n-DNA, and 0.020 ng/ml for Tn-I, based on the calculated areas under the curve (AUCs) of 0.89 (95% confidence interval (CI), 0.78 to 0.99), 0.76 (95% CI, 0.69 to 093), 0.73 (95% CI, 0.58 to 0.91), and 0.59 (95% CI, 0.41 to 0.79), respectively. By stepwise logistic regression, a plasma mt-DNA concentration greater than 3,380 GE/ml (adjusted odds ratio (OR), 8.22; 95% CI, 1.72 to 39.18; P 6.8 ng/ml (OR, 5.36; 95% CI, 1.06 to 27.08; P < 0.01) were the only independent predictors of mortality. Conclusions: mt-DNA and H-FBAP might be promising markers for predicting 15-day mortality in massive PE, with mt-DNA having better prognostic accuracy.This work was supported partially by grants from Plan Nacional I+D+I (SAF 2008-05347 and SAF2011-23575) and from Fundación Mutua Madrileña de Investigación Biomédica (2008 and 2011) to Francisco Arnalich and Carmen Montie

Effects of Interleukin-1β in Glycinergic Transmission at the Central Amygdala

Indexación ScopusInterleukin-1β (IL-1β) is an important cytokine that modulates peripheral and central pain sensitization at the spinal level. Among its effects, it increases spinal cord excitability by reducing inhibitory Glycinergic and GABAergic neurotransmission. In the brain, IL-1β is released by glial cells in regions associated with pain processing during neuropathic pain. It also has important roles in neuroinflammation and in regulating NMDA receptor activity required for learning and memory. The modulation of glycine-mediated inhibitory activity via IL-1β may play a critical role in the perception of different levels of pain. The central nucleus of the amygdala (CeA) participates in receiving and processing pain information. Interestingly, this nucleus is enriched in the regulatory auxiliary glycine receptor (GlyR) β subunit (βGlyR); however, no studies have evaluated the effect of IL-1β on glycinergic neurotransmission in the brain. Hence, we hypothesized that IL-1β may modulate GlyR-mediated inhibitory activity via interactions with the βGlyR subunit. Our results show that the application of IL-1β (10 ng/ml) to CeA brain slices has a biphasic effect; transiently increases and then reduces sIPSC amplitude of CeA glycinergic currents. Additionally, we performed molecular docking, site-directed mutagenesis, and whole-cell voltage-clamp electrophysiological experiments in HEK cells transfected with GlyRs containing different GlyR subunits. These data indicate that IL-1β modulates GlyR activity by establishing hydrogen bonds with at least one key amino acid residue located in the back of the loop C at the ECD domain of the βGlyR subunit. The present results suggest that IL-1β in the CeA controls glycinergic neurotransmission, possibly via interactions with the βGlyR subunit. This effect could be relevant for understanding how IL-1β released by glia modulates central processing of pain, learning and memory, and is involved in neuroinflammation. © Copyright © 2021 Solorza, Oliva, Castillo, Amestica, Maldifassi, López-Cortés, Barra, Stehberg, Piesche, Sáez-Briones, González, Arenas-Salinas and Mariqueo.https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2021.613105/ful

Percepción social de la tecnología en Chile

The present study analyzes how technology is perceived and conceptualized by Chile’s adult population. A quantitative study was conducted based on a sample of 181 adult individuals resident in the region of Valparaíso, Chile. The results of the study show that the concept of technology is ascribed different meanings depending on the age, gender, and socioeconomic status of the individual. Women tend to associate the concept with the internet, while men think of complex manufacturing processes. Individuals of high and medium-high socioeconomic status tend to perceive technology more positively than other socioeconomic groups. Interestingly, in institutional terms, the Government is considered by the majority of individuals to be the leading agent within the national innovation system, seen as having the greatest responsibility in terms of generating genuine technological development, followed by private firms and universities. The analyzed results serve as a contribution to the discussion surroundingtechnological development in Chile.El presente trabajo de investigación analiza cómo es percibida y conceptualizada la tecnología por la población adulta en Chile. Con este propósito, se diseñó un estudio cuantitativo con una muestra de 181 personas adultas habitantes de la Quinta Región de Valparaíso, Chile. Los resultados de la investigación muestran que el concepto de tecnología asume distintos significados conforme a la edad, sexo y grupo socioeconómico de las personas. Las mujeres tienden a asociar el concepto a la idea de internet y los hombres a procesos productivos complejos, en tanto que personas de estratos altos y medio-altos tienden a percibir la tecnología como algo más positivo que el resto de los grupos. A su vez, el Gobierno en tanto institución, es considerado por la mayoría de las personas como el agente principal del sistema nacional de innovación y el principal responsable de la generación de un desarrollo tecnológico genuino, seguido por las empresas y las universidades. Los resultados se analizan a fin de contribuir a la discusión respecto al desarrollo tecnológico en Chile