Extração de DNA de Catasetum gladiatorium K. G. Lacerda (Orchidaceae) para uso em estudos moleculares

Catasetum gladiatorium is endemic to Brazil, being usually found in areas subjected to environmental disturbances that may affect its genetic diversity. Analyses of genetic diversity require extraction of pure DNA through fast and efficient protocols. We propose here an efficient protocol to extract the DNA of C. gladiatorium for use in molecular analyses. DNA was extracted from leaf tissue using eight protocols based on the CTAB method. We tested: (1) two types of plant material maceration (using STE buffer and liquid nitrogen); (2) two CTAB concentrations (2% and 5%); and (3) two concentrations of β-mercaptoethanol (0% and 2%) in the extraction buffer. We performed amplification reactions with the extracted DNA using two ISSR primers. The methods of plant material maceration influenced the quality and amount of DNA extracted from C. gladiatorium. Maceration with liquid nitrogen allowed us to obtain high-quality DNA in all other variations of the tested protocols. On the other hand, maceration with STE yielded DNA at low concentrations and highly degraded. The best results were obtained using 5% CTAB. The absence of β-mercaptoethanol did not influence the quality of the extracted DNA. PCR demonstrated that DNA extraction using the eight tested protocols allowed for amplification with both ISSR markers. The eight protocols were able to extract amplifiable C. gladiatorium DNA, and may thus all be indicated for future molecular studies on the species. Catasetum gladiatorium é endêmica do Brasil e localiza-se em regiões com perturbações ambientais que podem afetar sua diversidade genética. Análises de diversidade genética necessitam de DNA integro, obtido por meio de protocolos de extração rápidos e eficientes. Este estudo objetivou propor um protocolo eficiente para a extração de DNA de C. gladiatorium, para uso em futuras análises moleculares. O DNA foi extraído do tecido foliar com oito protocolos baseados no método CTAB. Testou-se o tipo de trituração do material vegetal (com tampão STE e nitrogênio líquido) e a concentração de CTAB (2% e 5%) e de β-mercaptoetanol (0% e 2%) no tampão de extração. O DNA extraído foi submetido a amplificação com dois primers ISSR. Os métodos de trituração do material vegetal influenciaram na qualidade e quantidade de DNA extraído de C. gladiatorium. A trituração com nitrogênio líquido permitiu a extração de DNA de boa qualidade em todas as demais variações dos protocolos testados, enquanto a trituração com STE possibilitou a extração de DNA com baixa concentração e alta taxa de degradação. Melhores resultados foram obtidos com CTAB à 5%. A ausência de β-mercaptoetanol não influenciou a qualidade do DNA extraído. A amplificação via PCR, demonstrou que o DNA extraído com base nos oito protocolos testados foi passível de amplificação utilizando os dois marcadores ISSR selecionados. Os oito protocolos de extração testados foram capazes de extrair DNA passível de amplificação de C. gladiatorium, e podem ser indicados para futuros estudos moleculares da espécie

GENETIC DIVERSITY OF Hymenaea courbaril L. IN THE MATO GROSSO AMAZON: IMPLICATIONS FOR CONSERVATION

Hymenaea courbaril L. (Fabaceae) is a tree species popularly known as 'jatobá'. Its wood is largely sold and its fruits are used as a food and medicinal resources. This species has been subjected to logging and habitat destruction. The knowledge about genetic polymorphism is important for the conservation of species affected by anthropic action. In this study, we analyzed the genetic diversity of natural populations of Hymenaea courbaril in the Mato Grosso Amazon. Seven microsatellite primers were used to genotyping of 43 individuals distributed in five populations in the north region of Mato Grosso State. All the seven primers were polymorphic, with 72 alleles detected, averaging 10.29 per locus. Expected and observed heterozygosities averaged 0.85 and 0.29 per locus, respectively. The fixation index was positive for all populations, suggesting excess homozygotes, probably due to inbreeding. Molecular analysis of variance revealed that 85.33% of genetic diversity is within the populations. Based on the UPGMA dendrogram, the individuals were divided into six groups. In the clustering provided by Structure software, four groups were formed which did not correspond to the geographic distribution of the individuals, indicating that the populations are not geographically structured. All sampled populations present elevated levels of genetic diversity, and so they can be used for conservation projects. Genetic variation is higher within the analyzed populations; therefore, several individuals must be conserved per population

Genetic diversity among Bertholletia excelsa Bonpl genotypes using ISSR molecular markers.

A castanha-do-brasil pertence à família Lecythidaceae e é uma espécie nativa da Floresta Amazônica com elevado potencial econômico. O presente estudo objetivou avaliar a diversidade genética de genótipos de Bertholletia excelsa Bonpl. com ocorrência natural no norte do estado de Mato Grosso, com marcador molecular ISSR. Para tanto foram caracterizados 37 genótipos provenientes do município de Alta Floresta, MT, com oito primers com total de 52 locos amplificados em todos os genótipos, sendo 46 polimórficos. O número de fragmentos amplificados por primer variou de 5 [Di(AG)8C] a 8 [Di(GA)8YT] e [Di(CT)8RC], com média de 6 fragmentos por primer revelando um percentual médio de 88,6% de polimorfismo. O Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC) para cada marcador apresentou variação de 0,22 [Di(GA)8YG] a 0,66 [Di(AG)8T], com média de 0,46. O método de agrupamento de Tocher e o dendrograma (UPGMA), obtido a partir das 52 bandas ISSR amplificadas, revelaram seis grupos bem definidos, confirmando uma significativa diferenciação genética entre os genótipos avaliados. Os indivíduos mais similares foram 3 e 4. Os indivíduos 12, 29 e 37 foram os mais divergentes podendo ser usados como genitores para formação de híbridos em programas de melhoramento da espécie. Recomenda-se a conservação in situ dos genótipos analisados.The Brazil nut belongs to Lecythidaceae family and is a native species from the Amazon rainforest with high economic potential. This study aimed to evaluate the genetic diversity among Bertholletia excelsa Bonpl genotypes and with naturally occurring in the northern State of Mato Grosso, with ISSR molecular marker. Therefore, we characterized 37 genotypes through eight primers, with a total of 52 amplified loci in all genotypes, being 46 polymorphic. The number of fragments amplified by primer ranged from 5 [Di(AG)8C] to 8 [Di(GA)8YT] and [Di(CT)8RC], averaging 6 fragments per primer and revealing an average percentage of 88.6% polymorphism. The Polymorphic Information Content (PIC) for each marker varied to 0.22 [Di(GA)8YG] from 0.66 [Di(AG)8T], with average of 0.46. The Tocher grouping method and the dendrogram (UPGMA), obtained from 52 ISSR amplified bands revealed six well defined groups, confirming a significant genetic differentiation between the genotypes. The most similar individuals were 3 and 4. Individuals 12, 29 and 37 were the most divergent and can be used as parents for hybrid formation in the improvement programs. It is recommended to in situ conservation of analyzed genotypes

ÍNDICE MEIÓTICO E VIABILIDADE POLÍNICA DE Senna occidentalis (L.) LINK.

Senna occidentalis (L.) Link is a subshrub belonging to the Fabaceae family, popularly known as fedegoso, it is an invasive species with great biological potential for medicinal use. This study aimed to evaluate the meiotic index, pollen viability and cytochemical composition of S. occidentalis pollen grains. Flower buds were collected from 20 individuals of fedegoso in the municipality of Alta Floresta, MT. The dyes, 2% acetic carmine, Alexander's reagent, lugol and sudan IV were used to estimate the meiotic index (MI), pollen viability, and the presence of starch and lipid as a reserve substance. The MI presented an average of 93.5%, presenting triads as the most frequent abnormality. The pollen viability for both dyes used presented a percentage above 94%. The cytochemical analysis by means of colorimetric tests allowed to verify the starch and the lipid as reserve material of the pollen grain of fedegoso. The MI presented by the species was greater than 90%, which indicates meiotic stability, being corroborated by the high viability of the pollen.Senna occidentalis (L.) Link, subarbusto pertencente à família Fabaceae, conhecido popularmente como fedegoso, é uma espécie invasora com grande potencial biológico para uso medicinal. Este estudo objetivou avaliar o índice meiótico, viabilidade polínica e composição citoquímica dos grãos de pólen de S. occidentalis. Botões florais de 20 indivíduos de fedegoso foram coletados no município de Alta Floresta, MT. Os corantes, carmim acético 2%, reativo de Alexander, lugol e sudan IV, foram utilizados para estimar o índice meiótico (IM), a viabilidade polínica e a presença de amido e lipídeo como substância de reserva. O IM atingiu uma média de 93,5%, apresentado tríades como anormalidade mais frequente. A viabilidade polínica foi acima de 94% para todos os corantes utilizados. A análise citoquímica por meio de testes colorimétricos permitiu constatar o amido e o lipídeo como material de reserva do grão de pólen de fedegoso. O alto IM indica estabilidade meiótica sendo corroborado pela alta viabilidade polínica. Palavras-chave: pólen; testes colorimétricos; citoquímica.   Meiotic behavior and pollen viability of Senna occidentalis (L.) LINK   ABSTRACT: Senna occidentalis (L.) Link, a subshrub belonging to the Fabaceae family, popularly known as fedegoso, is an invasive species with great biological potential for medicinal use. This study aimed to evaluate the meiotic index, pollen viability and cytochemical composition of S. occidentalis pollen grains. Flower buds from 20 fedegoso individuals were collected in Alta Floresta, MT. The dyes, 2% acetic carmine, Alexander's reagent, lugol and sudan IV, were used to estimate the meiotic index (MI), pollen viability and the presence of starch and lipid as a reserve substance. MI reached an average of 93.5%, presenting triads as the most frequent abnormality. Pollen viability was above 94% for all dyes used. The cytochemical analysis by means of colorimetric tests allowed to verify the starch and the lipid as reserve material of the fedegoso pollen grain. The high MI indicates meiotic stability being corroborated by the high pollen viability.  Keywords: pollen; colorimetric tests; cytochemistry

AVALIAÇÃO DE MARCADORES ISSR PARA ESTUDOS MOLECULARES DE BACUPARI

The species Garcinia brasiliensis has various scientifically proven applications in folk medicine, however, the lack of dissemination of these characteristics of the species is a current problem. Among the studies that can enhance this knowledge is the genetic diversity study, for which the use of ISSR molecular markers is recommended for being reliable, rapid, and economical. Therefore, this study aimed to select and classify dominant molecular markers for studies with the G. brasiliensis species. For this, total DNA was extracted from 40 bacupari individuals. Two individuals were selected to perform ISSR primer amplification tests via PCR. 31 primers were tested, which were classified regarding their amplification quality as good, poor, or absent. Out of the 31 tested primers, 13 showed good results regarding the presence and quality of the bands, therefore, they were indicated for use in research aiming the molecular characterization and evaluation of genetic diversity of the species Garcinia brasiliensis.A espécie Garcinia brasiliensis apresenta diversas aplicações na medicina popular comprovadas cientificamente, entretanto, a falta de divulgação sobre essas características da espécie é um problema atual. Dentre os estudos que podem alavancar esse conhecimento está o da diversidade genética, para isso, o uso de marcadores moleculares ISSR é indicado por serem confiáveis, rápidos e econômicos. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo selecionar e classificar marcadores moleculares dominantes para estudos com a espécie G. brasiliensis. Para isso, foi extraído o DNA total de 40 indivíduos de bacupari, dos quais foram selecionados dois, que apresentassem bandas bem definidas e sem arraste, para realizar testes de amplificação de primers ISSR via PCR. Ao todo, foram testados 31 primers, os quais foram classificados quanto sua qualidade de amplificação, utilizando os padrões bom, ruim e ausente. Dos 31 primers testados, 13 apresentaram bons resultados quanto à presença e qualidade das bandas, portanto, indicados para o uso em pesquisas que visem à caracterização molecular e avaliação da diversidade genética da espécie Garcinia brasiliensis. Palavras-chave: Garcinia brasiliensis; marcador molecular; Pantanal.   Evaluation of ISSR markers for molecular studies of bacupari   ABSTRACT: The species Garcinia brasiliensis has various scientifically proven applications in folk medicine, however, the lack of dissemination of these species characteristics is a current problem. Among the studies that can enhance this knowledge is genetic diversity, for which ISSR molecular markers application is recommended as it is reliable, rapid, and economical. Therefore, this study aimed to select and classify dominant molecular markers for G. brasiliensis research. For this, total DNA was extracted from 40 bacupari individuals. Two individuals were selected to perform ISSR primer amplification tests by PCR. 31 primers were tested, which classified their amplification quality as good, poor, or absent. Out of the 31 tested primers, 13 showed good results regarding the presence and band quality, therefore, they were indicated for research use, aiming molecular characterization and Garcinia brasiliensis genetic diversity evaluation. Keywords: Garcinia brasiliensis; molecular marker; Pantanal

Efeito citotóxico de extratos aquosos de Artemisia Absinthium l. Sobre o ciclo celular de Allium cepa L. / Cytotoxic effect of aqueous extracts of Artemisia Absinthium l. On the cell cycle of Allium cepa L.

As plantas medicinais são utilizadas pela humanidade desde os tempos mais remotos, o que torna necessária a realização de testes para verificar seu potencial citotóxico. A Artemisia absinthium L. é cultivada no Brasil para o tratamento de diversas enfermidades, como as relacionadas ao sistema digestório. Um dos principais testes utilizados para avaliar a citotoxicidade é o teste Allium cepa L. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial citotóxico de extratos aquosos (infuso, decocto e triturado) de A. absinthium, por meio do teste A. cepa. Para cada extrato foram utilizadas cinco concentrações, um controle positivo e um controle negativo. Foram utilizadas quatro repetições por controle e concentração, sendo que em cada uma foram colocadas 30 sementes de A. cepa para germinar. Após 96 horas de exposição aos extratos, as radículas foram coletadas, mensuradas, fixadas em solução de Carnoy e armazenadas sob refrigeração, em álcool 70%. A avaliação da citotoxicidade foi realizada por meio da análise do crescimento do sistema radicular e do índice mitótico. A análise de variância revelou que os diferentes extratos e suas concentrações tiveram efeito significativo sobre o crescimento da radícula e o índice mitótico, sendo que neste houve diferença significativa entre os extratos. O índice mitótico apresentou redução na maioria das concentrações. Os extratos de A. absinthium avaliados apresentaram efeito citotóxico sobre as células meristemáticas de A. cepa, inibindo ou estimulando a divisão celular e o crescimento da radícula, sendo o extrato do tipo triturado o que apresentou maior efeito antiproliferativo

Extração de DNA de Catasetum gladiatorium K. G. Lacerda (Orchidaceae) para uso em estudos moleculares

Catasetum gladiatorium is endemic to Brazil, being usually found in areas subjected to environmental disturbances that may affect its genetic diversity. Analyses of genetic diversity require extraction of pure DNA through fast and efficient protocols. We propose here an efficient protocol to extract the DNA of C. gladiatorium for use in molecular analyses. DNA was extracted from leaf tissue using eight protocols based on the CTAB method. We tested: (1) two types of plant material maceration (using STE buffer and liquid nitrogen); (2) two CTAB concentrations (2% and 5%); and (3) two concentrations of β-mercaptoethanol (0% and 2%) in the extraction buffer. We performed amplification reactions with the extracted DNA using two ISSR primers. The methods of plant material maceration influenced the quality and amount of DNA extracted from C. gladiatorium. Maceration with liquid nitrogen allowed us to obtain high-quality DNA in all other variations of the tested protocols. On the other hand, maceration with STE yielded DNA at low concentrations and highly degraded. The best results were obtained using 5% CTAB. The absence of β-mercaptoethanol did not influence the quality of the extracted DNA. PCR demonstrated that DNA extraction using the eight tested protocols allowed for amplification with both ISSR markers. The eight protocols were able to extract amplifiable C. gladiatorium DNA, and may thus all be indicated for future molecular studies on the species. Catasetum gladiatorium é endêmica do Brasil e localiza-se em regiões com perturbações ambientais que podem afetar sua diversidade genética. Análises de diversidade genética necessitam de DNA integro, obtido por meio de protocolos de extração rápidos e eficientes. Este estudo objetivou propor um protocolo eficiente para a extração de DNA de C. gladiatorium, para uso em futuras análises moleculares. O DNA foi extraído do tecido foliar com oito protocolos baseados no método CTAB. Testou-se o tipo de trituração do material vegetal (com tampão STE e nitrogênio líquido) e a concentração de CTAB (2% e 5%) e de β-mercaptoetanol (0% e 2%) no tampão de extração. O DNA extraído foi submetido a amplificação com dois primers ISSR. Os métodos de trituração do material vegetal influenciaram na qualidade e quantidade de DNA extraído de C. gladiatorium. A trituração com nitrogênio líquido permitiu a extração de DNA de boa qualidade em todas as demais variações dos protocolos testados, enquanto a trituração com STE possibilitou a extração de DNA com baixa concentração e alta taxa de degradação. Melhores resultados foram obtidos com CTAB à 5%. A ausência de β-mercaptoetanol não influenciou a qualidade do DNA extraído. A amplificação via PCR, demonstrou que o DNA extraído com base nos oito protocolos testados foi passível de amplificação utilizando os dois marcadores ISSR selecionados. Os oito protocolos de extração testados foram capazes de extrair DNA passível de amplificação de C. gladiatorium, e podem ser indicados para futuros estudos moleculares da espécie

DIVERSIDADE GENÉTICA DE DUAS ESPÉCIES DE Theobroma L. EM UM FRAGMENTO FLORESTAL NO PORTAL DA AMAZÔNIA, MT, BRASIL

O estudo objetivou analisar a diversidade genética de Theobroma speciosum e Theobroma subincanum em um fragmento florestal no município de Alta Floresta, Mato Grosso, Brasil. Foram amostrados aleatoriamente 21 indivíduos T. speciosum e 20 de T. subincanum. Sete primers ISSR foram utilizados e produziram 35 fragmentos dos quais 42,8% apresentaram polimorfismo para T. speciosum e 57,1% para T. subincanum. A diversidade genética de Nei e o Índice de Shannon foram de 0,133 e 0,201 para T. speciosum e 0,244 e 0,351 para T. subincanum respectivamente. O dendrograma UPGMA apresentou quatro grupos para T. speciosum e três grupos para T. subincanum. Os marcadores ISSR foram capazes de acessar a diversidade das duas espécies em estudo gerando informações para programas de conservação e melhoramento genético e demonstraram que a fragmentação vegetal ocasionou um efeito maior sobre a diversidade genética da espécie T. speciosum nas populações estudadas. Os níveis de diversidade encontrados no estudo indicam existência de variabilidade genética e alertam para a importância da conservação in situ destas populações como fonte de genes para o melhoramento genético do gênero Theobroma.Palavras-chave: Cacauí. Cupuí, fragmentação florestal, ISSR. GENETIC DIVERSITY OF TWO SPECIES OF Theobroma L. IN A FOREST FRAGMENT IN AMAZON PORTAL, MT, BRAZIL   ABSTRACT:This study aimed to analyze the genetic diversity of Theobroma speciosum and Theobroma subincanum in forest fragment in the municipality of Alta Floresta, Mato Grosso, Brazil. We randomly sampled twenty-one T. speciosum individuals and twenty T. subincanum individuals. The seven ISSR primers used produced 35 fragments, from which 42,8% were polymorphic for T. speciosum and 57,1 % were polymorphic for T. subincanum. The Nei’s genetic diversity and Shannon index respectively were 0,133 and 0,201 for T. speciosum and 0,244 and 0,351 for T. subincanum. The UPGMA dendrogram showed four clusters for T. speciosum and three clusters for T. subincanum. The ISSR markers were able to access the genetic diversity of the two species studied, thus they provided information for conservation and breeding programs, also demonstrated that forest fragmentation caused a greater effect on genetic diversity of the T. speciosum species in the populations studied. The levels of diversity found in the study indicate that there is genetic variability and alert to the importance of in situ conservation of these populations as a source of genes for the genetic improvement of the genus Theobroma.Keywords: Cacauí, Cupuí, Forest fragmentation, ISSR DOI: http://dx.doi.org/10.5935/2318-7670.v05nespa0