TET3 prevents terminal differentiation of adult NSCs by a non-catalytic action at Snrpn.

Ten-eleven-translocation (TET) proteins catalyze DNA hydroxylation, playing an important role in demethylation of DNA in mammals. Remarkably, although hydroxymethylation levels are high in the mouse brain, the potential role of TET proteins in adult neurogenesis is unknown. We show here that a non-catalytic action of TET3 is essentially required for the maintenance of the neural stem cell (NSC) pool in the adult subventricular zone (SVZ) niche by preventing premature differentiation of NSCs into non-neurogenic astrocytes. This occurs through direct binding of TET3 to the paternal transcribed allele of the imprinted gene Small nuclear ribonucleoprotein-associated polypeptide N (Snrpn), contributing to transcriptional repression of the gene. The study also identifies BMP2 as an effector of the astrocytic terminal differentiation mediated by SNRPN. Our work describes a novel mechanism of control of an imprinted gene in the regulation of adult neurogenesis through an unconventional role of TET3

Aberrations of Genomic Imprinting in Glioblastoma Formation

In human glioblastoma (GBM), the presence of a small population of cells with stem cell characteristics, the glioma stem cells (GSCs), has been described. These cells have GBM potential and are responsible for the origin of the tumors. However, whether GSCs originate from normal neural stem cells (NSCs) as a consequence of genetic and epigenetic changes and/or dedifferentiation from somatic cells remains to be investigated. Genomic imprinting is an epigenetic marking process that causes genes to be expressed depending on their parental origin. The dysregulation of the imprinting pattern or the loss of genomic imprinting (LOI) have been described in different tumors including GBM, being one of the earliest and most common events that occurs in human cancers. Here we have gathered the current knowledge of the role of imprinted genes in normal NSCs function and how the imprinting process is altered in human GBM. We also review the changes at particular imprinted loci that might be involved in the development of the tumor. Understanding the mechanistic similarities in the regulation of genomic imprinting between normal NSCs and GBM cells will be helpful to identify molecular players that might be involved in the development of human GBM

Papel de la impronta genómica y su regulación epigenética en células madre neurales: relación con la formación de tumores

INTRODUCCIÓN Del zigoto a la célula madre adulta La formación de un organismo se inicia con la aparición del zigoto, una célula totipotente capaz de formar el resto de estructuras embrionarias y extraembrionarias (Sobhani et al., 2017). Este potencial de diferenciación se va perdiendo durante el desarrollo, de manera que en el estadío de blastocisto, las células de la masa interna (ICM) son capaces de formar células de las tres capas germinales, pero no de las extraembrionarias, pasando a ser células pluripotentes. En el organismo adulto, esta capacidad pluripotente desaparece; sin embargo, existen poblaciones discretas de células situadas en los diferentes tejidos con capacidad de auto-renovación y diferenciación hacia un determinado linaje o multipotentes, llamadas células madre adultas. Estas células son esenciales para mantener la homeostasis del tejido mediante el aporte celular o la reparación en caso de daño (Cheung and Rando, 2013; Wagers and Weissman, 2004). Células madre neurales y neurogénesis adulta Las células madre adultas situadas en el cerebro son conocidas como células madre neurales (NSCs) y suponen un reservorio de células multipotentes responsables de la formación de nuevas neuronas a lo largo de la vida del organismo, proceso conocido como neurogénesis (Kempermann et al., 2015). Este complejo y estrechamente regulado proceso queda restringido a dos regiones cerebrales en los mamíferos adultos, la zona subventricular (SVZ) en la pared lateral de los ventrículos, y la zona subgranular (SGZ) en el giro dentado del hipocampo (Kempermann et al., 2015; Lim and Alvarez-Buylla, 2014). La SVZ, el nicho neurogénico más activo en los roedores, y contiene célula madre llamadas células B1, que al activarse, generan células progenitoras de amplificación rápida o células tipo C, que a su vez, producen células tipo A o neuroblastos, que migran a través de la vía rostral migratoria (RMS) hasta alcanzar los bulbos olfativos (OBs) donde se integran y diferencian en interneuronas (Giachino et al., 2014; Lagace et al., 2007). En la SGZ, las células madre conocidas como células radiales o tipo I, forman progenitores de tipo II, que a su vez, generan neuroblastos o células tipo III. Estos neuroblastos migran a la capa granular del giro dentado y se diferencian en células granulares, que se integran en los circuitos neuronales (Ghosh, 2019; van Praag et al., 2002). Debido a la falta de marcadores definitorios de las células madre neurales, los principales conocimientos sobre estas células han sido posibles gracias a su cultivo in vitro (Ming and Song, 2011). Sin embargo, en los últimos años, se han desarrollado estrategias de detección y aislamiento de estas células gracias a la identificación de combinaciones de marcadores presentes en las diferentes subpoblaciones celulares mediante citometría de flujo (Belenguer et al., 2020; Llorens-Bobadilla et al., 2015). Regulación epigenética de la neurogénesis adulta La neurogénesis adulta en ambos nichos es un proceso dinámico que se encuentra altamente regulado por factores intrínsecos y extrínsecos (Gage, 2000; Lim and Alvarez-Buylla, 2016). Los mecanismos epigenéticos que regulan la actividad de las NSCs implican modificaciones que afectan a la expresión génica sin alterar la secuencia de nucleótidos (Bird, 2007; Jaenisch and Bird, 2003). La metilación del DNA se trata de uno de los mecanismos más comunes de regulación de la expresión génica e implica la actividad de enzimas que incorporan el grupo metilo, las DNA metiltransferasas (DNMTs), y enzimas encargadas de la desmetilación activa del DNA, las deoxigenasas TET (Ito et al., 2011). Precisamente la enzima TET3 es el único miembro de la familia que mantiene sus niveles de expresión en el organismo adulto, y su función ha demostrado ser clave en la regulación de las NSCs adultas (Montalban-Loro et al., 2019). La metilación del DNA participa de forma esencial en multitud de procesos tanto fisiológicos como patológicos. Impronta genómica y regulación de la dosis génica La impronta genómica es el mecanismo epigenético responsable de la expresión monoalélica de algunos genes, los genes improntados (Ferguson-Smith, 2011; Ishida and Moore, 2013). Este proceso es regulado por metilación en regiones concretas del DNA llamadas región de control de impronta (ICR) donde se sitúan las regiones diferencialmente metiladas (DMRs) del alelo materno y paterno, y que permite regular de forma conjunta diversos genes improntados debido a que éstos se encuentran generalmente agrupados en “clusters” (Abramowitz and Bartolomei, 2012; Dindot et al., 2009). Las ICRs pueden estar metiladas en el cromosoma heredado maternalmente o metiladas en el cromosoma paterno, definiendo el patrón de expresión de los alelos improntados. La deleción de estas regiones reguladoras conlleva la pérdida de impronta genómica (LOI) en los genes situados en el “cluster”, y está asociada a diversos síndromes de impronta como el síndrome de Prader-Willis o de Angelman, o también al cáncer; la mayor parte de ellos afectando al desarrollo y al sistema nervioso central debido a la implicación de estos genes en el desarrollo del embrión y en el cerebro adulto (Cleaton et al., 2014; Eggermann et al., 2015; Ishida and Moore, 2013). La impronta genómica es establecida en los gametos y debe ser mantenida durante el desarrollo del organismo para asegurar las marcas epigenéticas que determinan el origen parental de cada alelo (Li and Sasaki, 2011). Sin embargo, este proceso puede ser selectivamente “apagado” de forma no patológica en ciertos tipos celulares y/o momentos concretos del desarrolla para permitir la expresión del alelo silenciado (Ferron et al., 2011; Ferron et al., 2015). Este fino y llamativo mecanismo de regulación de la dosis génica ha sido observado precisamente en las NSCs adultas, en las que la expresión del gen improntado de expresión paterna Dlk1, presenta expresión bialélica en las NSCs postnatales de la SVZ, siendo clave para el correcto funcionamiento del proceso de neurogénesis (Ferron et al., 2011). También el factor de nicho IGF2 se expresa de forma bialélica en los plexos coroideos, vasculatura y meninges, siendo necesario para la homeostasis de las NSCs de la SVZ; mientras que las NSCs procedentes de la SGZ mantienen de forma improntada el gen de expresión paterna Igf2 (Ferron et al., 2015). Estos ejemplos, muestran como la expresión de los genes improntados es específica y clave en el mantenimiento de las NSCs adultas. Reprogramación celular y adquisición de un estado pluripotente Las células adultas especializadas pueden ser reprogramadas a un estado previo indiferenciado equivalente a las células de la masa interna del blastocito, las célula madre pluripotentes inducidas (iPSCs), adquiriendo las capacidades de auto-renovación y potencial de diferenciación, características de las células madre (Takahashi and Yamanaka, 2006, 2016). La adquisición del estado pluripotente implica cambios de expresión génica, aumentando aquellos genes relacionados con el proceso de indiferenciación, y disminuyendo los genes específicos del linaje de la célula somática; así como alteraciones epigenéticas incluyendo la reactivación del cromosoma X inactivo en las células procedentes de hembras, hipometilación del DNA o silenciamiento de los genes exógenos (Teshigawara et al., 2017). Además, el proceso de reprogramación inducida a iPSCs se caracteriza por eventos variables de pérdida de impronta (LOI), considerándose por algunos autores como un marcador de pluripotencia (Li et al., 2019; Takikawa et al., 2013). En concreto, el locus paternalmente metilado Dlk1-Dio3, regulado por los niveles de metilación en IG-DMR, se encuentra frecuentemente alterado en las iPSCs (Li et al., 2019; Li et al., 2011). Curiosamente, las DMRs metiladas paternalmente parecen estar más afectadas por la pérdida de impronta que las metiladas maternalmente (Bar et al., 2017; Rugg-Gunn et al., 2007). La inducción de la reprogramación celular se ha llevado a cabo mediante diferentes mecanismos, tanto virales como no virales capaces de integrarse en el genoma o mantenidos de forma transitoria. Los organismos transgénicos portadores del casete OSKM que codifica para los cuatro factores transcripcionales Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, es una de la estrategias más utilizadas y que ha permitido el estudio del proceso de reprogramación en el animal vivo (Abad et al., 2013; Ohnishi et al., 2014; Rodriguez-Matellan et al., 2020). Cáncer cerebral: teoría de la célula madre cancerosa El estudio sobre el origen del cáncer continúa siendo un aspecto prioritario en la investigación de esta patología. Se han descrito en numerosos tipos de cáncer la presencia de células con características de célula madre llamadas células madre cancerosas (CSCs), responsables de la formación y el mantenimiento del cáncer, así como la resistencia a tratamientos (Ayob and Ramasamy, 2018; Fabian et al., 2013; Reya et al., 2001). Debido a la multitud de características compartidas entre las células madre de tejido y estas células patológicas, diversos estudios han situado el origen de las CSCs en la transformación maligna de las células madre de tejido. Cáncer en cerebro En el cerebro humano existen diferentes tipos de tumores que difieren en el origen celular y la parte del cerebro afectada, siendo el glioblastoma (GBM) el tumor primario cerebral más común y agresivo (Claus et al., 2005). Se han descrito numerosas alteraciones genéticas y epigenéticas implicadas en el GBM. Una de las alteraciones más comúnmente encontradas en los pacientes de GBM es la amplificación de la molécula EGFR, un activador de diversas vías de señalización que incluyen proliferación, supervivencia, migración y tumorigénesis. Por ello, está alteración ha sido asociada al GBM de tipo clásico. Los glioblastomas presentan una alta heterogeneidad, ejemplo de ello es la presencia de diferentes subtipos dentro del GBM. Mientras que el subtipo clásico se caracteriza por el aumento de EGFR, un aumento de la molécula OLIG2 se asocia a un fenotipo pro-neural y menos agresivo. El subtipo más agresivo es el de tipo mesenquimal, el cual contiene elevados niveles de CD44. Sin embargo, estas moléculas, junto con otros marcadores asociados al GBM, no son exclusivas de estas células patológicas sino que también están presentes en las NSCs. Hecho que refuerza la idea de la NSC como célula de origen del GBM. Si bien, diversos genes han sido relacionados con esta patología, las alteraciones en los niveles de metilación de los promotores es la principal marca epigenética que sucede durante la transformación maligna. Precisamente, las muestras de pacientes de GBM muestran una disminución en los niveles de la marca epigenética 5hmC, coincidente con una disminución de la enzima TET3, implicada en la conversión del grupo 5mC en 5hmC. El aumento de esta enzima ha demostrado inhibir la proliferación de las células de GBM (Cui et al., 2019). Los genes improntados son susceptibles a las mutaciones que pueden ocasionar la formación de tumores debido a su expresión monoalélica y a su implicación en la regulación del crecimiento y el metabolismo. Los pacientes afectados por síndromes de impronta genómica presentan una mayor susceptibilidad a desarrollar tumores, revelando la implicación de este mecanismo epigenético en el cáncer. Precisamente, la pérdida de impronta genómica es uno de los eventos más comunes y tempranos en esta patología, siendo la LOI en el locus IGF2-H19 en el tumor de Wilms la asociación entre impronta y cáncer mejor caracterizada; si bien, alteraciones en diversos genes improntados han sido descritas (Leick et al., 2012; Uribe-Lewis et al., 2011). Con el fin de estudiar los distintos factores implicados en el origen y mantenimiento del GBM, se han desarrollado diferentes estrategias (Sampetrean and Saya, 2018). Sin embargo, resulta complicado generar modelo que formen estos tumores de forma eficiente, por ello, diversas mutaciones suelen ser requeridas. Una de las estrategias más utilizadas es el uso de xenotrasplantes o alotrasplantes. Sin embargo, esta metodología no permite abordar uno de los aspectos más interesantes del glioblastoma, su origen. OBJETIVOS El descubrimiento de células madre cancerosas (CSCs) en los tumores con semejanzas a las células madre de tejido promovieron la teoría de la célula madre cancerosa, que defiende que la transformación maligna ocurriría en estas célula madre de tejido a través de alteraciones genéticas y/o epigenéticas. En el cerebro, entender los mecanismos implicados en el mantenimiento de las NSCs y la relación con la transformación maligna es clave para el desarrollo de herramientas de diagnóstico y tratamiento de los tumores cerebrales. Precisamente, la alteración del mecanismo epigenético de impronta genómica es uno de los eventos más comunes y tempranos en el cáncer. Por ello, el principal objetivo de esta tesis es identificar el papel de la impronta genómica y su regulación epigenética en la actividad de las NSCs adultas, y su implicación en el desarrollo de tumores cerebrales. Los objetivos específicos propuestos en esta Tesis son: 4. Estudio del proceso de impronta genómica y su regulación epigenética en NSCs adultas de la SVZ. 5. Estudio del proceso de impronta genómica y su regulación epigenética en el glioblastoma. 6. Estudio del papel de la enzima TET3 en la regulación de la impronta genómica durante la transformación maligna. MATERIAL Y MÉTODOS 1. Animales experimentales Los animales utilizados en esta tesis así como los procedimientos experimentales han sido aprobados por el comité de ética de la Universitat de València. En este trabajo se han utilizado diferentes cepas murinas: i4F (portador del transgen OSKM), GFAP-rtTA (portador del activador transcripcional bajo el promotor de Gfap), C57BL6 (cepa salvaje), CAST/EiJ (cepa salvaje utilizada para la generación de animales híbridos) y la cepa Nude (cepa inmunodeprimida). Los experimentos se llevaron a cabo en animales de entre 2-4 meses de edad generalmente, a excepción de los MEFs obtenidos de embriones E14,5 y la electroporación en animales postnatales (P2). 2. Cultivos celulares Los estudios de reprogramación llevados a cabo en este trabajo se han realizado con animales portadores el activador transcripcional rtTA y del transgén OSKM inducible por doxiciclina (Abad et al., 2013). De estos animales se han utilizado MEFs, obtenidos a partir de la disgregación con tripsina/EDTA de embriones de E14,5. En el caso de la obtención de NSCs adultas reprogramables procedentes de la SVZ, la disección y el cultivo se hicieron mediante aislamiento de la SVZ y posterior disgregación con papaína. Las células fueron sembradas para permitir el crecimiento en forma de neuroesferas y disgregadas nuevamente con Acutasa® para expandirlas. Las líneas de glioblastoma (GBM) murino, GBM-EGFR, fueron obtenidas del laboratorio de la Dra. Pilar Sánchez Gómez. Estas líneas fueron generadas a partir de la sobre-expresión de Egfr en NSCs adultas deficientes en p16 y p19 y posterior inyección en ratones inmunocomprometidos. Para su expansión, las células fueron disgregadas con AccumaxTM y cultivadas de nuevo en su medio correspondiente. 3. Reprogramación in vitro mediante el tratamiento con doxiciclina La reprogramación de los MEFs de ratones portadores del transgen OSKM se basó en el tratamiento con 1 µg/ml de doxiciclina en el medio KsR con LIF (Abad et al., 2013). La aparición de células con características pluripotentes, detectadas por la presencia del marcador SSEA1, fue indicativo del proceso de reprogramación. Estas células SSEA1+ fueron aisladas y cultivadas en ausencia de doxiciclina para la reprogramación completa en iPSCs. En cuanto a la reprogramación de las NSCs adultas, los cultivos primarios de NSCs de la SVZ procedente de ratones adultos reprogramables fueron tratados con 1 µg/ml de doxiciclina en el medio de NSCs. Tras la aparición de agregados clonales SSES1+, las células fueron cultivas en medio ES con LIF, en presencia de doxiciclina. Finalmente, las células fueron cultivadas en medio selectivo 2i con LIF, inicialmente en presencia de doxiciclina que finalmente fue retirada para permitir la reprogramación completa a iPSCs. 4. Caracterización de las iPSCs La caracterización de las iPSCs se realizó mediante la detección de marcadores asociados a pluripotencia así como el testado de dicha capacidad. La actividad fosfatasa alcalina se realizó tras la fijación de las células con metanol frío y posterior tinción con fosfato de Naftol, Dimetilformamida y Fast Red Salt en el tampón Tris-HCl. La capacidad de formar cuerpos embrioides se hizo por el método de la gota colgante y de flotación. Ambas estrategias se basaron en el cultivo de las iPSCs a baja densidad en presencia de suero. La reactivación del cromosoma X se realizó mediante el análisis de expresión de los genes Xist y Tsix, implicados en este proceso. También se analizó la expresión de Pgk1, situado en el cromosoma X. Con el fin de comprobar si la reprogramación había dado lugar a aberraciones cromosómicas se realizó un estudio del cariotipo de las iPSCs mediante inhibición de la división celular, posterior choque hipotónico y fijación con Carnoy frío. Los cromosomas se contrastaron con la tinción Giemsa y el número de cromosomas por metafase fue cuantificado. La diferenciación de las iPSCs a neuroprogenitores (NPs) se basó en la formación de cuerpos embrioides y posterior tratamiento con ácido retinoico (AR) durante 4 días, tras los cuales se analizaron las características neurales de las células. 5. Reprogramación in vivo mediante el tratamiento con doxiciclina La reprogramación in vivo se llevó a cabo utilizando dos modelos basados en la expresión del transgén OSKM; un primer modelo, i4F-B, de reprogramación sistémica debido a la presencia del activador transcripcional rtTA en locus Rosa26, y un segundo modelo, GFAP-rtTA;i4F, de reprogramación específico de cerebro debido a la presencia del rtTA bajo el promotor de Gfap. Para la inducción de la expresión de OSKM, ambos modelos fueron tratados con doxiciclina en agua edulcorada con 7,5% de sacarosa. Sin embargo, el tratamiento en el modelo i4F-B se basó en 2,5 semanas con 0,2 mg/ml de doxiciclina, mientras que los animales GFAP-rtTA;i4F fueron tratados durante 4 semanas con 1 mg/ml. La obtención de células tumorales de animales GFAP-rtTA;i4F tratados con doxiciclina para inducir la reprogramación in vivo, se realizó mediante la disgregación con tripsina del cerebro de estos animales y posterior cultivo en medio de GBM. 6. Caracterización de las líneas de GBM La sobre-expresión de Tet3 en la línea GBM-EGFR se realizó mediante nucleofección con el sistema piggyBAC transposasa del vector control, el vector Tet3 y el vector Tet3 CDmut con el kit Mouse Neural Stem Cell NucleofectorTM. La posterior selección de las células nucleofectadas se realizó con el tratamiento con blasticidina. Para el análisis de ciclo celular, estas células fueron disgregadas para obtener una suspensión de células individuales que fueron teñidas utilizando BD CycletestTM Plus DNA Kit, permitiendo el análisis de las fases del ciclo celular mediante tinción con yoduro de propidio. Los porcentajes de células en cada fase del ciclo celular fueron determinados mediante citometría de flujo con FACSVerse. La detección de células en fase S del ciclo celular también se realizó mediante incorporación del análogo de timidina EdU (5-etinil-2’-deoxiuridina) y posterior revelado. Para ello, las células adheridas fueron incubadas durante 1 hora en presencia de EdU 10 µM y posteriormente fijadas con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras la fijación, se realizó la permeabilización con 0,5% de Triton® X-100 durante 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se llevó a cabo el revelado de la EdU. El porcentaje de células EdU positivas fue estimado a partir del número de células totales. En el ensayo de formación de tumoresferas, las células fueron disgregadas y sembradas a baja densidad, 2500 células en pocillos p96. El número de tumoresferas formadas fue contado manualmente utilizando un microscopio invertido de contraste de fases. La capacidad de adhesión de las líneas GBM que sobre-expresan el gen Tet3 fue medida mediante un ensayo in vitro en presencia de fibroblastos modificados para la sobre-expresión de la molécula de adhesión N-Cadherina (L-929). Un total de 1x106 células de células de GBM, disgregadas manualmente, fueron marcadas con el fluoróforo CellTraceTM Oregon GreenTM 488 Carboxylic Acid Diacetate, Succinimidyl Ester durante 8 minutos en el baño a 37 °C y protegidas de la luz. Tras lo cual, se sembraron un total de 6500 células sobre fibroblastos NC-929. Los co-cultivos de células fueron incubados durante 40 minutos para permitir la adhesión de las células de GBM. Finalmente, se realizó la fijación de las células con PFA al 2% durante 15 minutos a temperatura ambiente y tinción con DAPI. El número de células de GBM adheridas a la monocapa de fibroblastos fue estimado mediante el script “Cell Adhesion” (https://github.com/paucabar/cell_adhesion_assay), implementado como una macroinstrucción de ImageJ disponible a través del lugar de actualización de Fiji “NeuroMol Lab”, obteniéndose el número de células de GBM adheridas por mm2 a la monocapa de fibroblastos NC-929. El estudio del papel de Tet3 en la capacidad de angiogénesis se realizó mediante el análisis de la proliferación de células endoteliales humanas HUVEC tras el co-cultivo con células de GBM. Para ello, se sembraron 10.000 células GBMcontrol, GMBTet3 y GBMTet3 CDmut sobre transwells semipermeables. Tras 48 horas de condicionamient

Aberrations of Genomic Imprinting in Glioblastoma Formation

In human glioblastoma (GBM), the presence of a small population of cells with stem cell characteristics, the glioma stem cells (GSCs), has been described. These cells have GBM potential and are responsible for the origin of the tumors. However, whether GSCs originate from normal neural stem cells (NSCs) as a consequence of genetic and epigenetic changes and/or dedifferentiation from somatic cells remains to be investigated. Genomic imprinting is an epigenetic marking process that causes genes to be expressed depending on their parental origin. The dysregulation of the imprinting pattern or the loss of genomic imprinting (LOI) have been described in different tumors including GBM, being one of the earliest and most common events that occurs in human cancers. Here we have gathered the current knowledge of the role of imprinted genes in normal NSCs function and how the imprinting process is altered in human GBM. We also review the changes at particular imprinted loci that might be involved in the development of the tumor. Understanding the mechanistic similarities in the regulation of genomic imprinting between normal NSCs and GBM cells will be helpful to identify molecular players that might be involved in the development of human GBM

IGF2 interacts with the imprinted gene Cdkn1c to promote terminal differentiation of neural stem cells

Adult neurogenesis is supported by multipotent neural stem cells (NSCs) with unique properties and growth requirements. Adult NSCs constitute a reversibly quiescent cell population that can be activated by extracellular signals from the microenvironment in which they reside in vivo. Although genomic imprinting plays a role in adult neurogenesis through dose regulation of some relevant signals, the roles of many imprinted genes in the process remain elusive. Insulinlike growth factor 2 (IGF2) is encoded by an imprinted gene that contributes to NSC maintenance in the adult subventricular zone through a biallelic expression in only the vascular compartment. We show here that IGF2 additionally promotes terminal differentiation of NSCs into astrocytes, neurons and oligodendrocytes by inducing the expression of the maternally expressed gene cyclin-dependent kinase inhibitor 1c (Cdkn1c), encoding the cell cycle inhibitor p57. Using intraventricular infusion of recombinant IGF2 in a conditional mutant strain with Cdkn1c-deficient NSCs, we confirm that p57 partially mediates the differentiation effects of IGF2 in NSCs and that this occurs independently of its role in cell-cycle progression, balancing the relationship between astrogliogenesis, neurogenesis and oligodendrogenesis

Dlk1 dosage regulates hippocampal neurogenesis and cognition.

Neurogenesis in the adult brain gives rise to functional neurons, which integrate into neuronal circuits and modulate neural plasticity. Sustained neurogenesis throughout life occurs in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus in the hippocampus and is hypothesized to be involved in behavioral/cognitive processes such as memory and in diseases. Genomic imprinting is of critical importance to brain development and normal behavior, and exemplifies how epigenetic states regulate genome function and gene dosage. While most genes are expressed from both alleles, imprinted genes are usually expressed from either the maternally or the paternally inherited chromosome. Here, we show that in contrast to its canonical imprinting in nonneurogenic regions, Delta-like homolog 1 (Dlk1) is expressed biallelically in the SGZ, and both parental alleles are required for stem cell behavior and normal adult neurogenesis in the hippocampus. To evaluate the effects of maternally, paternally, and biallelically inherited mutations within the Dlk1 gene in specific behavioral domains, we subjected Dlk1-mutant mice to a battery of tests that dissociate and evaluate the effects of Dlk1 dosage on spatial learning ability and on anxiety traits. Importantly, reduction in Dlk1 levels triggers specific cognitive abnormalities that affect aspects of discriminating differences in environmental stimuli, emphasizing the importance of selective absence of imprinting in this neurogenic niche

Switching TNF antagonists in patients with chronic arthritis: An observational study of 488 patients over a four-year period

The objective of this work is to analyze the survival of infliximab, etanercept and adalimumab in patients who have switched among tumor necrosis factor (TNF) antagonists for the treatment of chronic arthritis. BIOBADASER is a national registry of patients with different forms of chronic arthritis who are treated with biologics. Using this registry, we have analyzed patient switching of TNF antagonists. The cumulative discontinuation rate was calculated using the actuarial method. The log-rank test was used to compare survival curves, and Cox regression models were used to assess independent factors associated with discontinuing medication. Between February 2000 and September 2004, 4,706 patients were registered in BIOBADASER, of whom 68% had rheumatoid arthritis, 11% ankylosing spondylitis, 10% psoriatic arthritis, and 11% other forms of chronic arthritis. One- and two-year drug survival rates of the TNF antagonist were 0.83 and 0.75, respectively. There were 488 patients treated with more than one TNF antagonist. In this situation, survival of the second TNF antagonist decreased to 0.68 and 0.60 at 1 and 2 years, respectively. Survival was better in patients replacing the first TNF antagonist because of adverse events (hazard ratio (HR) for discontinuation 0.55 (95% confidence interval (CI), 0.34-0.84)), and worse in patients older than 60 years (HR 1.10 (95% CI 0.97-2.49)) or who were treated with infliximab (HR 3.22 (95% CI 2.13-4.87)). In summary, in patients who require continuous therapy and have failed to respond to a TNF antagonist, replacement with a different TNF antagonist may be of use under certain situations. This issue will deserve continuous reassessment with the arrival of new medications. © 2006 Gomez-Reino and Loreto Carmona; licensee BioMed Central Ltd

Evaluation of a quality improvement intervention to reduce anastomotic leak following right colectomy (EAGLE): pragmatic, batched stepped-wedge, cluster-randomized trial in 64 countries

Background Anastomotic leak affects 8 per cent of patients after right colectomy with a 10-fold increased risk of postoperative death. The EAGLE study aimed to develop and test whether an international, standardized quality improvement intervention could reduce anastomotic leaks. Methods The internationally intended protocol, iteratively co-developed by a multistage Delphi process, comprised an online educational module introducing risk stratification, an intraoperative checklist, and harmonized surgical techniques. Clusters (hospital teams) were randomized to one of three arms with varied sequences of intervention/data collection by a derived stepped-wedge batch design (at least 18 hospital teams per batch). Patients were blinded to the study allocation. Low- and middle-income country enrolment was encouraged. The primary outcome (assessed by intention to treat) was anastomotic leak rate, and subgroup analyses by module completion (at least 80 per cent of surgeons, high engagement; less than 50 per cent, low engagement) were preplanned. Results A total 355 hospital teams registered, with 332 from 64 countries (39.2 per cent low and middle income) included in the final analysis. The online modules were completed by half of the surgeons (2143 of 4411). The primary analysis included 3039 of the 3268 patients recruited (206 patients had no anastomosis and 23 were lost to follow-up), with anastomotic leaks arising before and after the intervention in 10.1 and 9.6 per cent respectively (adjusted OR 0.87, 95 per cent c.i. 0.59 to 1.30; P = 0.498). The proportion of surgeons completing the educational modules was an influence: the leak rate decreased from 12.2 per cent (61 of 500) before intervention to 5.1 per cent (24 of 473) after intervention in high-engagement centres (adjusted OR 0.36, 0.20 to 0.64; P < 0.001), but this was not observed in low-engagement hospitals (8.3 per cent (59 of 714) and 13.8 per cent (61 of 443) respectively; adjusted OR 2.09, 1.31 to 3.31). Conclusion Completion of globally available digital training by engaged teams can alter anastomotic leak rates. Registration number: NCT04270721 (http://www.clinicaltrials.gov)

The DUNE Far Detector Vertical Drift Technology, Technical Design Report

International audienceDUNE is an international experiment dedicated to addressing some of the questions at the forefront of particle physics and astrophysics, including the mystifying preponderance of matter over antimatter in the early universe. The dual-site experiment will employ an intense neutrino beam focused on a near and a far detector as it aims to determine the neutrino mass hierarchy and to make high-precision measurements of the PMNS matrix parameters, including the CP-violating phase. It will also stand ready to observe supernova neutrino bursts, and seeks to observe nucleon decay as a signature of a grand unified theory underlying the standard model. The DUNE far detector implements liquid argon time-projection chamber (LArTPC) technology, and combines the many tens-of-kiloton fiducial mass necessary for rare event searches with the sub-centimeter spatial resolution required to image those events with high precision. The addition of a photon detection system enhances physics capabilities for all DUNE physics drivers and opens prospects for further physics explorations. Given its size, the far detector will be implemented as a set of modules, with LArTPC designs that differ from one another as newer technologies arise. In the vertical drift LArTPC design, a horizontal cathode bisects the detector, creating two stacked drift volumes in which ionization charges drift towards anodes at either the top or bottom. The anodes are composed of perforated PCB layers with conductive strips, enabling reconstruction in 3D. Light-trap-style photon detection modules are placed both on the cryostat's side walls and on the central cathode where they are optically powered. This Technical Design Report describes in detail the technical implementations of each subsystem of this LArTPC that, together with the other far detector modules and the near detector, will enable DUNE to achieve its physics goals