Hipoativação de receptores NMDA ao longo do desenvolvimento : consequências comportamentais e influência do enriquecimento ambiental

A estimulação da reserva cognitiva e encefálica (BCR), através do enriquecimento ambiental (EA), por exemplo, influencia positivamente funções cognitivas e induz alterações neuroanatômicas, sendo sugerido muitas vezes como uma terapia complementar aos tratamentos farmacológicos convencionais em pacientes com distúrbios neurológicos. A esquizofrenia é um distúrbio neurológico o qual tem sido associado a um estado de hipoativação de receptores NMDA (NMDAR). O bloqueio de NMDAR durante períodos iniciais do desenvolvimento encefálico induz alterações duradouras nas redes neurais. Estas alterações estão associadas a prejuízos no aprendizado espacial, memórias de trabalho, memórias de curta e longa duração, comportamento exploratório e emocionalidade, apresentando alta relevância para o estudo da esquizofrenia. Durante estágios precoces do desenvolvimento encefálico a subunidade GluN2 predominantemente expressa nos NMDAR é a subunidade GluN2B. Desta forma, torna-se de extrema importância investigar se a hipoativação seletiva de NMDAR contendo a subunidade GluN2B durante períodos iniciais do desenvolvimento é capaz de induzir alterações comportamentais causando um fenótipo tipo-esquizofrênico similar as induzidas pela hipoativação de toda a população de NMDAR. Na presente Tese, investigamos se o EA durante a infância é capaz de prevenir a evolução das alterações comportamentais induzidas pela hipoativação de NMDAR durante o neurodesenvolvimento. Para atingir esses objetivos, primeiramente nós propusemos a utilização de uma ferramenta estatística alternativa, a Análise de Componentes Principais (PCA), para investigar se o período do dia em que os testes eram realizados afetava o comportamento de animais naive (Capítulo I) ou submetidos ao EA (Capítulo II). No Capítulo I nós validamos a utilização da PCA para o estudo do comportamento, a qual revelou que além do padrão de atividade dos animais, o período do dia também alterou a micro estrutura do comportamento exploratório. No Capítulo II, nós mostramos que algumas alterações comportamentais induzidas pelo EA (tais como diminuição na exploração e na auto-exposição a ambientes potencialmente perigosos) são observadas durante o período diurno, mas não durante o período noturno. Contudo, o EA melhorou o desempenho dos animais em uma tarefa que avalia a formação de memórias episódicas independentemente do período em que foram testados. Após validar a PCA e estabelecer os períodos do dia ideais para o estudo dos comportamentos de interesse, nós avaliamos os efeitos do EA durante a infância e do bloqueio neonatal de NMDAR sobre o comportamento e também sobre o metabolismo encefálico de glicose em animais adultos. No Capítulo III, nós mostramos que bloquear seletivamente NMDAR contendo a subunidade GluN2B durante períodos iniciais do desenvolvimento altera o comportamento dos animais de maneira diferente do bloqueio não-seletivo de NMDAR, sugerindo diferentes funções das diferentes populações de NMDAR nesta etapa do desenvolvimento. Além disso, nós observamos que o EA durante a infância é capaz de prevenir as alterações comportamentais induzidas pelo bloqueio de NMDAR contendo a subunidade GluN2B. Resultados parciais do Capítulo IV indicam que a hipoativação neonatal de NMDAR não induz macro-alterações na captação encefálica de glicose. Contudo, alterações no padrão regional de utilização de glicose pelo encéfalo não podem ser descartados. Além disso, animais submetidos ao EA apresentaram uma tendência a aumentarem a captação de glicose encefálica, o que pode indicar um aumento de atividade encefálica. Contudo, novos estudos são necessários para melhor elucidação deste fenômeno. Como conclusões da presente tese, nossos resultados permitem sugerir que diferentes populações de NMDAR estão envolvidas em diferentes processos de maturação encefálica, e que interferências no funcionamento das distintas populações de NMDAR durante períodos críticos de desenvolvimento podem alterar o funcionamento encefálico gerando adaptações nas comunicações neurais e modificando o fenótipo comportamental de maneira duradoura. A estimulação da BCR apresenta potencial para prevenir estas alterações, contudo, novos estudos são necessários para completa elucidação deste tema.Brain and cognitive reserve (BCR) stimulation has been suggested as a complementary therapy to conventional pharmacological treatments in patients with neurological disorders since BCR stimulation, through environmental enrichment (EE) for instance, positively influences cognitive functions and induces neuroanatomical changes. Schizophrenia is a neurological disorder which has been associated with a NMDA receptor (NMDAR) hypoactivation state. NMDAR hypoactivation during early periods of brain development induces long-lasting changes in neural networks. These brain alterations are associated with impairments in spatial learning, working memory, short- and long-term memories besides exploration and emotionality, presenting high relevance to schizophrenia. Since GluN2B subunit is the predominant GluN2 subunit expressed during early stages of brain development, it becomes of extreme importance to investigate whether GluN2B-containing NMDAR hypoactivation during early periods of brain development is sufficient to induce schizophrenic-like behavioral changes similar to those induced by the entire NMDAR population hypoactivation. In the present Thesis, we investigated whether early life EE may prevent the evolution of schizophrenic-like behavioral changes induced by NMDAR hypoactivation during early periods of brain development. In order to reach these objectives, we first proposed the use of an alternative statistical tool, the Principal Component Analysis (PCA), to investigate whether the time-of-day in which tests were performed affected the behavior of naive animals (Chapter I) or EE submitted animals (Chapter II). In Chapter I, we validated the use of PCA to study animal behavior. PCA revealed that time-of-day influenced activity pattern of animals and altered the micro structure of exploratory behavior. In Chapter II, we have shown that some behavioral changes induced by EE (such as decreased exploitation and self-exposure to potentially dangerous places) are observed during the light period but not during the dark period of light/dark photoperiod cycle. However, EE improved the performance of animals in a task that evaluates the formation of episodic memories regardless of the time-of-day they were tested. After validating PCA and establishing the ideal time-of-day for investigation of the behaviors of interest, we evaluated the effects of neonatal NMDAR blockade and early life EE on behavior and brain glucose metabolism in adult animals. In Chapter III, we showed that selectively blocking GluN2B-containing NMDAR during early periods of brain development alters animals’ behavior differently from neonatal non-selective NMDAR blockade, suggesting different functions for the different NMDAR populations at this stage of development. In addition, we have observed that early life EE is able to prevent the behavioral changes induced by neonatal GluN2B-containing NMDAR blockade. Partial results from Chapter IV indicate that neonatal NMDAR hypoactivation does not induce macro-alterations in brain glucose uptake. However, changes in the regional pattern of glucose utilization by the brain cannot be ruled out. In addition, animals submitted to EE presented a trend to increase the brain glucose uptake, which may indicate an increase brain activity in these animals. However, additional studies are needed to complete elucidation of this phenomenon. As conclusions of the present Thesis, our results allow us to suggest that different populations of NMDAR are involved in different processes of brain maturation. We can also suggest that interferences in the different NMDAR populations’ activity during critical periods of brain development can alter brain functioning, which can generates adaptations in the neural communications and induce long-lasting behavioral alterations. BCR stimulation presents potential to prevent these alterations. However, additional studies are necessary to complete elucidation of this theme

Participação dos receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo NMDA na morte neuronal e nas alterações comportamentais induzidas pelo modelo experimental de status epilepticus em ratos jovens

O status epilepticus (SE) é caracterizado por uma crise epiléptica com duração maior que 30 minutos ou crises sucessivas nas quais os níveis de consciência do paciente não são recuperados entre elas. O SE, quando ocorrido durante a infância, pode induzir morte neuronal e levar a alterações comportamentais e cognitivas na idade adulta. O dano cerebral induzido pelo SE têm sido frequentemente relacionado à excitotoxicidade glutamatérgica, principalmente através da hiperestimulação de receptores do tipo NMDA (NMDAR), levando a um excessivo influxo de íons Ca+2 no neurônio, podendo causar morte celular. No presente estudo, investigamos os efeitos de antagonistas de NMDAR sobre a morte neuronal e as alterações comportamentais em animais submetidos ao modelo de SE induzido por LiCl-pilocarpina durante períodos iniciais do desenvolvimento cerebral. Ratos Wistar de 16 dias de vida (P16) receberam uma injeção de pilocarpina (60 mg/kg i.p.) 12-18 h após terem recebido LiCl (3 mEq/kg i.p.). Animais controle receberam salina 0,9%. Na primeira parte deste trabalho, nós investigamos o efeito do antagonista não competitivo e não seletivo de NMDAR, cetamina, administrado após o início das crises, sobre a morte neuronal e as alterações comportamentais induzidas pelo SE. Neste trabalho, observou-se que o SE induzido no início da vida leva a uma expressiva perda neuronal na região CA1 do hipocampo, na habenula, na amigdala e no tálamo 24 após a convulsão. O tratamento com cetamina foi capaz de interromper as convulsões, prevenindo, também, a neurodegeneração. Além disso, o SE induzido em P16 causou aumento nos níveis de ansiedade durante o período adulto, e a intervenção com cetamina foi capaz de reduzir o efeito ansiogênico do SE. Além disso, observou-se um efeito ansiogênico da administração de cetamina per se em animais que não foram submetidos ao SE. Na segunda parte deste estudo, após identificar que o bloqueio de NMDAR é capaz de prevenir os danos a curto e longo prazo induzidos pelo SE, investigamos qual o papel dos NMDAR contendo a subunidade GluN2B na neurodegeneração induzida pelo SE. Neste trabalho, observamos que, diferentemente do bloqueio dos NMDAR através do uso da cetamina, a administração dos antagonistas específicos de NMDAR contendo a subunidade GluN2B, CP-101606 (taxoprodil) e CI-1041 (besonprodil), não foi capaz de terminar as crises convulsivas do SE. No entanto foi eficaz na redução da mortalidade em comparação com os animais SE. Observou-se ainda que diferentemente da cetamina, o bloqueio de NMDAR contendo a subunidade GluN2B não foi capaz de reverter totalmente o dano cerebral induzido pelo SE. Animais que sofreram SE e receberam CI-1041 durante as convulsões apresentaram uma redução na neurodegeneração somente em algumas regiões como hipocampo e amígdala, indicando um efeito neuroprotetor deste composto. No entanto, animais que receberam CP-101606 durante o SE não apresentaram redução na degeneração neuronal nas regiões analisadas. Nossos resultados sugerem, portanto, que o sistema glutamatérgico é um alvo em potencial para o tratamento da neurodegeneração induzida por crises epilépticas prologadas, e que o antagonismo de NMDAR pode servir, pelo menos, como terapia farmacológica complementar em pacientes que sofrem SE durante a infância. Além disso, nossos dados sugerem existir o envolvimento de outras subunidades do NMDAR, além da GluN2B, no dano neuronal induzido pelo SE.Status epilepticus (SE) is characterized as a prolonged seizure activity or repeated seizures lasting more than 30 min. For immature brains, SE is associated with cellular and behavioral alterations such as neuronal loss and behavioral impairment during adulthood. Brain damage induced by SE has frequently been related to glutamatergic excitotoxicity, mainly through NMDA receptors overstimulation (NMDAR), which can lead to neurodegeneration. In the present study, we investigated the effects of NMDAR antagonists on short- (neuronal death) and long-term (behavioral changes) alterations in animals subjected to SE early in life. Rat pups were injected with LiCl (3 mEq/kg i.p.) 12-18 h prior to pilocarpine (60 mg/kg i.p. - SE group) or saline (0.9%) administration on 16th postnatal day (P16). In the first part of this study, we administered the noncompetitive and non-selective NMDAR antagonist, ketamine, after SE onset to investigate the effect NMDAR blocking on neuronal death and behavioral changes induced SE. We observed that SE induced caused a significant neuronal loss in the CA1 region of the hippocampus, habenula, amygdala and thalamus 24 h after seizures. Treatment with ketamine was able to terminate seizures and to prevent neurodegeneration induced by SE. Moreover, young animal treated with LiCl-pilocarpine presented elevated levels of anxiety at adulthood. Treatment with ketamine prevented this ansiogenic effect of SE. In addition, administration of ketamine alone also induced an increase in anxiety levels in adulthood. In the second part of the study, we investigate the role of NMDAR-containing GluN2B subunit in the neurodegeneration induced by early-life SE. In this work, we found that blocking of NMDAR containing the GluN2B subunit by the compounds CP-101606 (taxoprodil) and CI-1041 (besonprodil) was unable to terminate seizures induced by SE, in contrast to that observed for ketamine treatment. However, treatment with antagonists of NMDAR-containing GluN2B subunit was effective in reducing mortality as compared to SE animals. CP-101606 and CI-1041 treatment were not able to completely reverse the brain damage induced by SE. Animals that were underwent SE and received CI-1041 during seizures presented a reduction in neurodegeneration in some regions such as the hippocampus and amygdala. However, animals that received CP-101606 during SE did not present a reduction in neuronal degeneration in all regions analyzed. Our results therefore suggest that glutamatergic system is a potential target for the treatment of SE, and that antagonism of NMDAR could be used at least as a complementary pharmacotherapy in patients suffering SE during childhood. Furthermore, our data suggest that there is involvement of other NMDAR subunits, beyond GluN2B, in neuronal damage induced by SE

Participação dos receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo NMDA na morte neuronal e nas alterações comportamentais induzidas pelo modelo experimental de status epilepticus em ratos jovens

O status epilepticus (SE) é caracterizado por uma crise epiléptica com duração maior que 30 minutos ou crises sucessivas nas quais os níveis de consciência do paciente não são recuperados entre elas. O SE, quando ocorrido durante a infância, pode induzir morte neuronal e levar a alterações comportamentais e cognitivas na idade adulta. O dano cerebral induzido pelo SE têm sido frequentemente relacionado à excitotoxicidade glutamatérgica, principalmente através da hiperestimulação de receptores do tipo NMDA (NMDAR), levando a um excessivo influxo de íons Ca+2 no neurônio, podendo causar morte celular. No presente estudo, investigamos os efeitos de antagonistas de NMDAR sobre a morte neuronal e as alterações comportamentais em animais submetidos ao modelo de SE induzido por LiCl-pilocarpina durante períodos iniciais do desenvolvimento cerebral. Ratos Wistar de 16 dias de vida (P16) receberam uma injeção de pilocarpina (60 mg/kg i.p.) 12-18 h após terem recebido LiCl (3 mEq/kg i.p.). Animais controle receberam salina 0,9%. Na primeira parte deste trabalho, nós investigamos o efeito do antagonista não competitivo e não seletivo de NMDAR, cetamina, administrado após o início das crises, sobre a morte neuronal e as alterações comportamentais induzidas pelo SE. Neste trabalho, observou-se que o SE induzido no início da vida leva a uma expressiva perda neuronal na região CA1 do hipocampo, na habenula, na amigdala e no tálamo 24 após a convulsão. O tratamento com cetamina foi capaz de interromper as convulsões, prevenindo, também, a neurodegeneração. Além disso, o SE induzido em P16 causou aumento nos níveis de ansiedade durante o período adulto, e a intervenção com cetamina foi capaz de reduzir o efeito ansiogênico do SE. Além disso, observou-se um efeito ansiogênico da administração de cetamina per se em animais que não foram submetidos ao SE. Na segunda parte deste estudo, após identificar que o bloqueio de NMDAR é capaz de prevenir os danos a curto e longo prazo induzidos pelo SE, investigamos qual o papel dos NMDAR contendo a subunidade GluN2B na neurodegeneração induzida pelo SE. Neste trabalho, observamos que, diferentemente do bloqueio dos NMDAR através do uso da cetamina, a administração dos antagonistas específicos de NMDAR contendo a subunidade GluN2B, CP-101606 (taxoprodil) e CI-1041 (besonprodil), não foi capaz de terminar as crises convulsivas do SE. No entanto foi eficaz na redução da mortalidade em comparação com os animais SE. Observou-se ainda que diferentemente da cetamina, o bloqueio de NMDAR contendo a subunidade GluN2B não foi capaz de reverter totalmente o dano cerebral induzido pelo SE. Animais que sofreram SE e receberam CI-1041 durante as convulsões apresentaram uma redução na neurodegeneração somente em algumas regiões como hipocampo e amígdala, indicando um efeito neuroprotetor deste composto. No entanto, animais que receberam CP-101606 durante o SE não apresentaram redução na degeneração neuronal nas regiões analisadas. Nossos resultados sugerem, portanto, que o sistema glutamatérgico é um alvo em potencial para o tratamento da neurodegeneração induzida por crises epilépticas prologadas, e que o antagonismo de NMDAR pode servir, pelo menos, como terapia farmacológica complementar em pacientes que sofrem SE durante a infância. Além disso, nossos dados sugerem existir o envolvimento de outras subunidades do NMDAR, além da GluN2B, no dano neuronal induzido pelo SE.Status epilepticus (SE) is characterized as a prolonged seizure activity or repeated seizures lasting more than 30 min. For immature brains, SE is associated with cellular and behavioral alterations such as neuronal loss and behavioral impairment during adulthood. Brain damage induced by SE has frequently been related to glutamatergic excitotoxicity, mainly through NMDA receptors overstimulation (NMDAR), which can lead to neurodegeneration. In the present study, we investigated the effects of NMDAR antagonists on short- (neuronal death) and long-term (behavioral changes) alterations in animals subjected to SE early in life. Rat pups were injected with LiCl (3 mEq/kg i.p.) 12-18 h prior to pilocarpine (60 mg/kg i.p. - SE group) or saline (0.9%) administration on 16th postnatal day (P16). In the first part of this study, we administered the noncompetitive and non-selective NMDAR antagonist, ketamine, after SE onset to investigate the effect NMDAR blocking on neuronal death and behavioral changes induced SE. We observed that SE induced caused a significant neuronal loss in the CA1 region of the hippocampus, habenula, amygdala and thalamus 24 h after seizures. Treatment with ketamine was able to terminate seizures and to prevent neurodegeneration induced by SE. Moreover, young animal treated with LiCl-pilocarpine presented elevated levels of anxiety at adulthood. Treatment with ketamine prevented this ansiogenic effect of SE. In addition, administration of ketamine alone also induced an increase in anxiety levels in adulthood. In the second part of the study, we investigate the role of NMDAR-containing GluN2B subunit in the neurodegeneration induced by early-life SE. In this work, we found that blocking of NMDAR containing the GluN2B subunit by the compounds CP-101606 (taxoprodil) and CI-1041 (besonprodil) was unable to terminate seizures induced by SE, in contrast to that observed for ketamine treatment. However, treatment with antagonists of NMDAR-containing GluN2B subunit was effective in reducing mortality as compared to SE animals. CP-101606 and CI-1041 treatment were not able to completely reverse the brain damage induced by SE. Animals that were underwent SE and received CI-1041 during seizures presented a reduction in neurodegeneration in some regions such as the hippocampus and amygdala. However, animals that received CP-101606 during SE did not present a reduction in neuronal degeneration in all regions analyzed. Our results therefore suggest that glutamatergic system is a potential target for the treatment of SE, and that antagonism of NMDAR could be used at least as a complementary pharmacotherapy in patients suffering SE during childhood. Furthermore, our data suggest that there is involvement of other NMDAR subunits, beyond GluN2B, in neuronal damage induced by SE

Low-intensity physical training recovers object recognition memory impairment in rats after early-life induced Status epilepticus

When it occurs early in life, Status epilepticus (SE) can cause behavioural and cognitive impairments in adulthood. Here, we evaluated the putative benefits of low-intensity treadmill training on long-standing cognitive impairment in rats submitted to SE early in life. Wistar rats were submitted to LiCl-pilocarpine-induced SE at P16. Animals from the trained group underwent a low-intensity treadmill protocol for 5 days per week for 4 weeks. At adulthood, rats subjected to early-life SE displayed impairment in long-term memory in an object recognition task, while the training protocol completely reversed this deficit. This result was associated with neither locomotor alterations nor changes in emotional behaviour; there were no differences between groups in the distance travelled, grooming or rearing in the open field test; there were also no differences between groups in the number of risk assessment, time spent in open arms in an elevated plus maze and number of entries into the open arms. These data suggest that physical exercise can ameliorate the long-standing recognition memory deficit induced by early-life SE, suggesting that it may be useful as a putative intervention for patients who suffered SE during infancy