Mid- and Far-Infrared Marker Bands of the Metal Coordination Sites of the Histidine Side Chains in the Protein Cu,Zn-Superoxide Dismutase

International audienceVibrational spectroscopy gives important information on the properties of ligand and metal–ligand bonds in metalloenzymes. Infrared spectroscopy is appealing for the study of metal active sites that are not amenable to Raman spectroscopy. We present a combined experimental and theoretical approach to analyze the mid- and far-IR spectra of Cu,Zn-superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) as a probe of the histidine ligands. This metalloenzyme provides a unique model to identify specific IR signatures of metal–histidine coordination and to study their alterations as a function of the metal (copper/zinc), the copper valence state (+I/+II), the histidine coordination mode (Nτ and Nπ) and the histidine protonation state. DFT calculations combined with normal mode descriptions from potential energy distribution calculations were performed on two slightly different cluster models. Differences in the constraints at the side chain of one histidine Cu ligand sensibly modify the geometric parameters and vibrational properties. Electrochemically induced FTIR difference spectroscopy provided mid- and far-IR fingerprint spectra of the Cu protein in aqueous media that are sensitive to the redox state of the Cu centre at the active site. Comparisons of the DFT predictions with the experimental IR modes of the histidine ligands at the Cu,Zn-SOD active site showed that useful mid-IR markers of histidine Nτ and Nπ coordination were predicted with good accuracy. The DFT analysis further demonstrated a link between the ν(C4–C5) mode frequency of His46 and the specific properties of the His46–Cu bond in Cu,Zn-SOD. A combined theoretical and experimental approach on samples in H2O and 2H2O or 15N-labelled samples identified the contributions from the histidine side chain modes in the 669–629 cm–1 region

OhrRA functions as a redox-responsive system controlling toxinogenesis in Bacillus cereus

International audienceBacillus cereus OhrR is a member of the subgroup of the MarR (multiple antibiotic resistance) family of transcriptional regulators that use a cysteine-based redox sensing mechanism. OhrA is a thiol-dependent, peroxidase-like protein. The dual OhrRA system triggers B. cereus adaptation in response to redox changes, such as those encountered in the environment of the gastrointestinal tract. Here, we investigated the role of OhrRA in toxinogenesis. Comparative shotgun analysis of exoproteomes from ΔohrA, ΔohrR and wild-type cells revealed significant changes in the abundance levels of toxin-related proteins depending on the extracellular redox potential. We complemented these data by measuring the DNA binding activity of reduced and oxidized recombinant OhrR on toxin and putative toxin promoter regions. Furthermore, transcriptomic data and OhrRA-dependent, antiproliferative activity of the B. cereus exoproteome on Caco-2 human epithelial cells were recorded. The results indicate that OhrR controlled toxin gene expression directly or indirectly in a redox-and toxin-dependent manner, and may function as a repressor or an activator. Moreover, we found that OhrR restricts toxin-dependent antiproliferative activity of the B. cereus exoproteome whatever the growth conditions, while the restrictive impact of OhrA occurs only under low ORP anoxic conditions. Biological significance B. cereus is a notorious foodborne pathogen which causes gastroenteritis. Fatal and severe cases have been reported. The pathogenicity of B. cereus is intimately associated with the production of epithelial cell-destructive toxins in the small intestine. The small intestine poses several challenges for a pathogen because it is sliced into various niches with different oxygen concentrations and different redox potentials. We recently showed that the organic hydroperoxide resistance OhrRA system was crucial to the successful adaptation of B. cereus to extreme redox environments such as those encountered in the lumen (high reducing anoxic environment) and on the intestinal epithelium (transient oxic environment). Here we provide evidence that this bacterial system is a major virulence determinant in B. cereus in that it coordinates toxinogenesis in a redox dependent manner. Specifically, our comparative exoproteomic analyses reveal that OhrR strongly restricts B. cereus toxinogenesis under high reducing anoxic conditions while OhrA boosts toxinogenesis. Based on exoproteomic analyses, we further examined the role of OhrR and found that it functions as

Long Distance Charge Redistribution Upon Cu,Zn-Superoxide Dismutase Reduction

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Autophosphorylated Residues Involved in the Regulation of Human Chk2 In Vitro

International audienceHuman checkpoint kinase 2 is a major actor in checkpoint activation through phosphorylation by ataxia telangiectasia mutated in response to DNA double-strand breaks. In the absence of de novo DNA damage, its autoactivation, reported in the event of increased Cds1/checkpoint kinase 2 (Chk2) expression, has been attributed to oligomerization. Here we report a study performed on autoactivated recombinant Chk2 proteins that aims to correlate kinase activity and phosphorylation status. Using a fluorescence-based technique to assay human checkpoint kinase 2 catalytic activity, slight differences in the ability to phosphorylate Cdc25C were observed, depending on the recombinant system used. Using mass spectrometry, the phosphorylation sites were mapped to identify sites potentially involved in the kinase activity. Five phosphorylated positions, at Ser120, Ser260, Thr225, Ser379 and Ser435, were found to be common to bacteria and insect cells expression systems. They were present in addition to the six known phosphorylation sites induced by ionizing radiation (Thr68, Thr432, Thr387, Ser516, Ser33/35 and Ser19) detected by immunoblotting. After phosphatase treatment, Chk2 regained activity via autorephosphorylation. The determination of the five common sites and ionizing-radiation-inducible positions as rephosphorylated confirms that they are potential positive regulators of Chk2 kinase activity. For Escherichia coli's most highly phosphorylated 6His-Chk2, 13 additional phosphorylation sites were assigned, including 7 novel sites on top of recently reported phosphorylation sites

Fortifier les Alpes au Moyen Âge (Ve – XVIe siècles): du Rhône à la Durance

Le PCR Fortifier les Alpes au Moyen Âge, auquel participent une dizaine de chercheurs (doctorants, archéologues, universitaires) poursuit son cours, après une année probatoire débutée en 2019, pour une programmation triennale (2020-2022). Né du constat de la raréfaction des recherches en matière de castellologie dans le quart Sud-Est, il a pour but d'une part de les redynamiser mais aussi de mettre en lien les différents chercheurs travaillant sur cette thématique. Il est l'héritier des grandes recherches et inventaires lancées à partir des années 70, comme celles portant sur les châteaux de terre, et propose d'organiser le rassemblement et la synthèse de toutes les données accumulées sur le fait castral dans l'espace alpin entre Rhône et Durance.La zone géographique concernée par le PCR correspond aux états médiévaux de Savoie et du Dauphiné ainsi que de leurs marges (Faucigny, Genevois, Valentinois, Marquisat de Provence, Dauphiné transalpin). Six départements appartenant à deux régions sont pour le moment inclus : L'Ain, la Drôme, l'Isère, la Savoie, le Haute-Savoie pour la région Auvergne-Rhône-Alpes et les Hautes-Alpes pour la région Provence-Alpes-Côte-d'Azur. Malgré un contexte sanitaire très défavorable, les opérations programmées cette année ont pu se tenir, non sans chamboulement et adaptation. Cependant certaines vérifications de terrain n’ont pu être mises en œuvre à cause de inaccessibilité des sites dans ce contexte sanitaire (distance, période où l’opération était prévue) Dans le cadre des axes de recherche définis lors de l’année probatoire, les investigations ontconsidérablement progressé.• Axe 1 : Premiers châteaux de l'espace alpin. Le renfort de David Billoin (Inrap Bourgogne-Franche-Comté) nous a permis de mettre en place une méthodologie solide et éprouvée dans l’identification et la détection de sites fortifiés du haut Moyen Âge dans notre espace. Se fondant sur son expérience méthodologique, mise en œuvre sur les sites jurassiens, nous avons établi les étapes importantes à respecter dans cette recherche qui allie à la fois dépouillement de la Carte Archéologique de la Gaule (CAG) et observations topographiques sur le terrain. L’objectif final du PCR pour cet axe sera d’établir la liste des sites du Haut Moyen Âge dans chacun des départements de notre zone de recherche. Cependant, cette méthode est grandement tributaire de la qualité des inventaires présentés dans les différents volumes de la CAG, qui est, pour le moment très inégale, tout comme les mises à jour avec les découvertes plus récentes.• Axe 2 : Terminologie et forme des édifices fortifiés. Avec l’organisation d’une journée d’étude sur les bâties (bastida), l’accent à été porté, cette année, sur le recensement de ces sites afin d’avoir une base documentaire solide pour entreprendre une synthèse concernant ce type d’édifice fortifié particulier. L’inventaire, grandement avancé pour les Hautes-Alpes, la Drôme et l’Isère (100 sites mentionnés), est en cours de constitution dans l’Ain, la Savoie et la Haute-Savoie. Des prospections de terrain ont pu se dérouler dans ce dernier département sur des sites où une bâtie est attestée soit par les textes soit par la toponymie. Ces investigations se poursuivront en 2021.• Axe 3 : Morphologie et évolution des ensembles castraux. Pour cette dernière thématique, les efforts se sont portés sur la documentation de sites qui avaient été repérés l’an dernier. Le château de Miolans (Savoie) a été l’objet de relevés photos et d’observations archéologiques tout comme la maison forte de Magland (Haute-Savoie), avec l’aide d’Auriane Lorphelin (Archéodunum), où les recherches menées ont permis de déterminer plusieurs phases de construction et d’aménagement, inconnues jusqu’alors. Des notices ont été créées d’après le modèle réalisé en 2019 à cet effet.En dehors de ces axes de recherche, l’architecture SQL de la base de données à été établie afin d’être compatible avec la base de données des châteaux haut-savoyards (AVER). Des formulaires de saisie simplifiés ont été créés pour faciliter l’enregistrement des sites en travail collaboratif sans craindre les doublons. En parallèle une solution d’hébergement a été trouvée grâce au consortium HumaNUM qui nous offre un espace pour créer, alimenter et gérer la base de données. Malheureusement, les contraintes sanitaires ont fortement ralenti le processus de demande si bienqu’il n’a pas encore été possible de débuter l’alimentation de la base. Celle-ci débutera dès le début de l’année 2021

Orthosteric Binding of ρ-Da1a, a Natural Peptide of Snake Venom Interacting Selectively with the α1A-Adrenoceptor

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Archéologie du bâti en Auvergne Rhône-Alpes

Ce volume est le fruit d’un long travail initié il y a une dizaine d’années par un collectif d’archéologues d’Auvergne-Rhône-Alpes, toutes institutions réunies, impliqués dans l’archéologie des édifices conservés en élévation. Exerçant l’archéologie du bâti dans une région française réputée pionnière en la matière, notamment dans le centre ancien de Lyon dès les années 1980, les participants souhaitaient établir un bilan scientifique régional et s’interroger sur l’état de cette spécialité près de quarante ans après ces premières opérations. La publication s’attache donc à promouvoir un champ de la recherche archéologique parfois mal compris, voire controversé, et à en valoriser les résultats de manière très concrète. Au-delà de la communauté scientifique, les auteurs ont cherché à toucher un auditoire élargi, amateurs d’architecture ou acteurs de la protection et de la restauration du patrimoine, en accueillant les exposés de divers protagonistes, architectes, conservateurs, restaurateurs, amenés à fréquenter les archéologues au cours des chantiers. L’Atlas, placé en première partie de l’ouvrage, réunit plus de quatre-vingt notices monographiques d’édifices médiévaux et modernes pour lesquels l’archéologie du bâti constitue la source prioritaire d’information. Ils se répartissent essentiellement dans la Drôme, la Loire, la Haute-Loire, le Puy-de-Dôme et le Rhône et, dans une moindre mesure, dans l’Ain et la Haute-Savoie. Suit, organisé en trois chapitres, une forme de manuel et de traité des idées établis à partir de la somme des observations, expériences et réflexions des chercheurs : méthodes d’analyse, références régionales, cadre pratique de l’archéologie du bâti. Index, glossaires et autre dispositif de renvoi entre l’atlas et les chapitres guident le lecteur à travers une abondante documentation écrite et graphique. Ce copieux volume, très attendu, contribuera de manière éminente à la diffusion des résultats de l’archéologie du bâti dans cette vaste région

Homology modelling of the ρ-Da1a binding site in the α_1A-AR and the MT7 toxin.

<p>Views from the side of the TM bundle (Panel A), and from the top of the extracellular space (Panel B). F187^5.41, F193^5.47, F281^6.44, M292^6.55, F308^7.35 in green. D106^3.32 and the double S188^5.42/S192^5.46 in orange. F86^2.64, F288^6.51 and F312^7.39 in red. Panel C :3D structure of the three-finger fold MT7 toxin (2vlw) with the four conserved disulfide bridges in red.</p

Receptor affinities for ρ-Da1a (dash lines) and HEAT (solid lines) on mutated α_1A-ARs.

<p>Binding inhibition curves for ¹²⁵I-HEAT binding to WT (200 pM, 0.2 µg, ○), D106^3.32A (200 pM, 1 µg, □) and F86^2.64A (1.3 nM, 0.8 µg, •) receptor variants. n = 3–4.</p