Cryopreservation method and composition of the vitrification solution affect viability of in vitro bovine embryos

Summary Background: an optimal formulation for vitrifying in vitro-produced (IVP) bovine embryos is currently unavailable. Objective: to estimate whether differences in composition of vitrification solutions may affect the viability of IVP embryos as compared to that of embryos cryopreserved by a conventional slow-freezing method. Methods: bovine IVP embryos were cryopreserved by two methods: 1) a slow controlled-rate (1.5 M ethylene glycol (EG)), or 2) vitrification by using two different vitrification and thawing/warming solutions: (1) Protocol V1: commercial vitrification Kit, and (2) Protocol V2: defined vitrification (20% EG; 20% dimethyl sulfoxide (DMSO); 20% fetal bovine serum (FBS)) and warming (20% FBS; 0.2 M sucrose) solutions. Embryo viability was recorded at 24, 48, and 72 h after thawing/warming by evaluating the number of embryos that re-expanded and developed to the hatching blastocyst stage. Results: embryo survival rate was affected by the method of cryopreservation, where the frequency of embryos that re-expanded at 24 h after thawing/warming was higher for embryos vitrified with protocols V1 and V2 (89.0%, 86.2%, respectively) compared to those cryopreserved by the slow-controlled rate method (73.6%, p<0.05). Similarly, higher percentage of embryos cryopreserved by vitrification hatched at 72 h, where protocol V2 resulted in higher percentage of hatched embryos (84.3%) compared to protocol V1 (64,0%, p<0.05), and both were higher compared to the slowcontrolled rate method (55.2%, p<0.05). Conclusions: the method of cryopreservation and composition of the vitrification solution have a direct effect on the viability of bovine IVP embryos.Resumo Antecedentes: não existe um meio criopreservante com uma composição perfeita para a vitrificação de embriões bovinos in vitro (PIV). Objetivo: avaliar se a composição de diferentes soluções de vitrificação afeta a viabilidade de embriões bovinos PIV, em comparação com embriões criopreservados pelo método convencional de congelação lenta. Métodos: embriões bovinos PIV foram criopreservados por dois métodos: 1) congelação lenta controlada (1,5 M etilenoglicol (EG)), 2) vitrificação com duas soluções diferentes: (1) Protocolo V1: Kit comercial de vitrificação, (2) Protocolo 2: soluções definidas de vitrificação (20% EG; 20% dimetilsulfóxido (DMSO); 20% soro fetal de bovino (FBS)) e aquecimento (20% FBS; 0,2 M sacarose). A viabilidade do embrião foi avaliada pelo número de embriões re-expandidos e desenvolvidos até o estágio de blastocisto expandido após 24, 48 e 72 h descongelamento/aquecimento. Resultados: a taxa de sobrevivência dos embriões afetou-se pelo método de criopreservação: a frequência dos embriões re-expandidos após 24 h de aquecimento/descongelamento foi maior nos embriões vitrificados com os protocolos V1 e V2 (89% e 86,2%; respectivamente), quando foi comparada com a frequência dos embriões criopreservados pelo método de congelação lenta (73,6%, p<0,05). Uma maior porcentagem de embriões criopreservados por vitrificação eclodiu após 72 h. O protocolo V2 apresentou maior porcentagem de embriões eclodidos (84,3%) quando comparado com o protocolo V1 (64%, p<0,05), ambos apresentaram maior porcentagem de eclosão quando comparados ao método de congelação lenta (55,2%; p<0,05). Conclusões: o método de criopreservação e composição da solução de vitrificação têm um impacto direto na viabilidade dos embriões bovinos PIV.Resumen Antecedentes: no existe una formula específica ideal para la congelación de embriones bovinos producidos in vitro (IVP). Objetivo: estimar si la composición de diferentes soluciones de vitrificación afecta la viabilidad de embriones bovinos IVP en comparación con embriones criopreservados mediante el método convencional de congelación lenta. Métodos: los embriones bovinos producidos in vitro se congelaron a través de los siguientes métodos: 1) congelación lenta (1,5 M de etilenglicol (EG)), 2) por vitrificación utilizando dos soluciones vitrificantes: (1) Protocolo V1: solución vitrificante comercial, (2) Protocolo V2: solución vitrificante (20% EG, 20% dimetil sulfóxido (DMSO), 20% suero fetal bovino (FBS)) y de calentamiento (20% FBS, 0,2 M sucrosa). La viabilidad embrionaria se evaluó a las 24, 48 y 72 h post-descongelación, a través de la medición del porcentaje de embriones que se expandieron y llegaron al estadio de eclosión. Resultados: el porcentaje de expansión embrionaria a 24 h fue más alto en los embriones que fueron vitrificados con los protocolos V1 y V2 (89,0%, 86,2%, respectivamente), que aquellos que fueron criopreservados con el método de congelación lenta (73,6%, p<0,05). Igualmente, un porcentaje mayor de embriones criopreservados por el método de vitrificación eclosionó a las 72 h, resultando en un mayor porcentaje en los embriones vitrificados con el protocolo V2 (84,3%), en comparación con el protocolo V1 (64,0%, p<0,05), y ambos porcentajes fueron más altos que los obtenidos con la congelación lenta (55,2%, p<0,05). Conclusiones: el método de congelación y la composición de la solución de vitrificación afectan la viabilidad post-congelación de los embriones bovinos IVP

Ovary dynamics in heifers of gir breed by ultrasonic imaging

El objetivo del presente estudio fue caracterizar, en condiciones de trópico bajo colombiano, los patrones de desarrollo folicular en seis novillas de las raza Gir a lo largo de un ciclo estral, utilizando la técnica de ultrasonografía transrectal de los ovarios con los métodos de identificación y no identificación. Las seis novillas manifestaron una proporción igual en la presentación de ciclos de dos y tres ondas de desarrollo folicular. En novillas de dos ondas (n=3), se encontraron diferencias significativas (P0,05) entre la duración de la primera onda, diez días y la segunda, nueve días. En novillas de tres ondas, se encontraron diferencias significativas (P0,05) entre la duración de la primera, la segunda y la tercera honda. En cuatro de las seis novillas la ovulación, se presentó en el ovario izquierdo.The objective of the present study was to characterize under low altitude colombian tropical conditions the fol- licular dynamic pattems in six Gir breed heifers through- out an estral cycle, using the ovary ultrasonic imaging with identification and non identification methods. An equal proportion in the exhibition of cycles of two or three waves of follicular development was observed in all six heifers. Two wave heifers (n=3) showed a signifi- cant difference (P0.05) between the length of the first wave, ten days and the second, nine days were observed. In the three wave heifers (n=3) there were significant differences (P<0 .05) in the day of máximum diameter of dominant follicle, 4.66 for the first wave, 12.33 for the second and 20.33 for the third one. The day of máximum diameter of the subordinated follicle was 2.66 for the first wave, 11.33 for the second and 18.66 for the third. No differences (P>0.05) between the waves length, 8.6 for the first and the second wave and 7.6 for the third was observed. In four of the six heifers the ovulation appeared in the left ovary.Incluye referencias bibliográfica

Evaluación de un protocolo de inseminación artificial a tiempo fijo con variaciones en los días de aplicada la dosis de prostaglandina en novillas Brahman puras y cruzadas

Los eventos reproductivos se encuentran influenciados por factores como la edad, el peso, la raza y el medio ambiente. El objetivo de la presente investigación fue determinar diferencias en la respuesta de la aplicación de un protocolo de inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) en novillas puras y cruzadas, con variaciones en los días de aplicación de la dosis de prostaglandina (PGF2α), sobre los porcentajes de preñez. El estudio se desarrolló en una finca del municipio de Barranca de Upía, Meta, Colombia. Se estableció un protocolo hormonal para realizar la IATF y las novillas se dividieron en dos grupos: el grupo 1 (n = 28), que recibió la dosis de prostaglandina en el día seis del tratamiento, y el grupo 2 (n = 24), que recibió la dosis en el día ocho. Se obtuvo un porcentaje de preñez general del 36,53 % y, por grupos, del 32,14 % y 41,67 % en los grupos 1 y 2, respectivamente. En relación con las variables edad y peso por grupo y el porcentaje de preñez obtenido, se presentaron diferencias estadísticamente significativas (p ≤ 0,05). En conclusión, bajo las condiciones de este estudio, en novillas Brahman puras y cruzadas, la administración de prostaglandina el día seis del protocolo IATF presentó una menor tasa de preñez, en comparación con la aplicación de la dosis de prostaglandina el día ocho del protocolo de sincronización, lo cual sugiere que aplicar la dosis del agente luteolítico el día seis del tratamiento no representa un aumento en la tasa de preñez

Panorâmica da produção de embriões bovinos in vitro

In vitro embryo production (IEP) is a reproducti- ve biotechnology that impacts livestock systems favoring breeding and which have also been uti- lized as research models for embryo development in other species. For the development of this method, oocytes in vivo are collected through laparoscopy and ultrasound guided follicular aspiration, or through ovaries collected from slaughterhouses. The oocytes are subjected to maturation processes in vitro using various cul- ture media, addition of gonadotropins and growth factors. Spermatozoids undergo in vitro sperm ca- pacitacion process, where fertilization capacity is adquired and live spermatozoids are separa- ted from the seminal components and Cryopro- tectants. The oocyte–sperm co-culture for the in vitro fertilization is carried out in a media that promotes maximum sperm activity and zona pe- llucida penetration. For in vitro fertilization is ca- rried out in a medium favorable to sperm activity and pellucid zone penetration. Subsequently, the collected embryos are subjected to culture media that contain energy sources, amino acids and growth factors in order to maintain their sur- vival and development. Currently, IEP in cattle has become large-scale and is working on stan- dardization process for other species. Through PIV, biotechnologies such as cloning and trans- genesis have been developed. The aim of this review is to describe the PIV phases and their relation with the physiological events of fertiliza- tion and early embryo development.A produção in vitro de embriões (PIV) é uma bio- tecnologia reprodutiva com efeitos nos sistemas de criação de gado favorecendo o melhoramento gené- tico e também tem sido usada como um modelo de pesquisa do desenvolvimento embrionário em outras espécies. Para o desenvolvimento desta técnica, são coletados ovócitos in vivo via laparoscopica: Para o desenvolvimento desta técnica,são coletados ovóci- tos in vivo por laparoscopiaou aspiração folicular por ultrassonografia ou atravésde ovários colhidos em abatedouro. Os ovócitos são submetidos a proces- sos de maturação in vitro, utilizando-se vários meios, adição de gonadotrofinas e fatores de crescimento. Os espermatozóides são submetidos a tratamento na capacitação espermática in vitro, onde adquirem a capacidade de fertilização e são separados os es- permatozoides vivos dos componentes seminais e crioprotetores. Para a fertilização in vitro é utilizada uma co-cultura de espermatozoides e ovócitos num meio que promove a atividade espermática e a pe- netração na zona pelúcida. Subsequentemente, os embriões são submetidos à cultura em meios con- tendo fontes de energia, aminoácidos e fatores de crescimento, a fim de manter a sua sobrevivência e crescimento. Na atualidade a técnica PIV em bovi- nos é massificada e se trabalha em processos de padronização em outras espécies. A partir do PIV foi dado o desenvolvimento de novas biotecnologias, como a clonagem e transgênese. O objetivo desta revisão é descrever as fases da PIV e sua relação com os eventos fisiológicos da fecundação e desen- volvimento embrionário inicial.La producción de embriones in vitro (PIV) es una biotecnología reproductiva que impacta los siste- mas ganaderos favoreciendo el mejoramiento ge- nético y que también se ha utilizado como modelo de investigación del desarrollo embrionario en otras especies. Para el desarrollo de ésta técnica, se co- lectan oocitos in vivo por medio de laparoscopia y aspiración folicular guiada por ultrasonografía ó a través de ovarios recolectados en plantas de sacri- ficio. Los oocitos son sometidos a procesos de ma- duración in vitro, utilizando diversos medios, adición de gonadotropinas y factores de crecimiento. Los espermatozoides son sometidos a tratamientos de capacitación espermática in vitro, donde adquieren capacidad fertilizante y se separan los espermato- zoides vivos de los componentes seminales y crio-protectores. Para la fertilización in vitro se realiza un cocultivo de espermatozoides y oocitos en un medio que favorece la actividad espermática y penetración de la zona pelúcida. Posteriormente, los embriones obtenidos son sometidos a cultivo en medios que contengan fuentes de energía, aminoácidos y fac- tores de crecimiento, con el fin de mantener su so- brevivencia y desarrollo. En la actualidad la técnica de PIV en bovinos se ha masificado y se trabaja en los procesos de estandarización en otras especies. A partir de la PIV se dio el desarrollo de nuevas bio- tecnologías como la clonación y transgénesis. El objetivo de esta revisión es describir las fases de la PIV y su relación con los eventos fisiológicos de la fertilización y desarrollo embrionario temprano.Incluye referencias bibliográfica

Generalidades de la producción de embriones bovinos in vitro

La producción de embriones in vitro (PIV) es una biotecnología reproductiva que impacta los sistemas ganaderos favoreciendo el mejoramiento genético y que también se ha utilizado como modelo de investigación del desarrollo embrionario en otras especies. Para el desarrollo de ésta técnica, se colectan oocitos in vivo por medio de laparoscopia y aspiración folicular guiada por ultrasonografía ó a través de ovarios recolectados en plantas de sacrificio. Los oocitos son sometidos a procesos de maduración in vitro, utilizando diversos medios, adición de gonadotropinas y factores de crecimiento. Los espermatozoides son sometidos a tratamientos de capacitación espermática in vitro, donde adquieren capacidad fertilizante y se separan los espermatozoides vivos de los componentes seminales y crio-protectores. Para la fertilización in vitro se realiza un cocultivo de espermatozoides y oocitos en un medio que favorece la actividad espermática y penetración de la zona pelúcida. Posteriormente, los embriones obtenidos son sometidos a cultivo en medios que contengan fuentes de energía, aminoácidos y factores de crecimiento, con el fin de mantener su sobrevivencia y desarrollo. En la actualidad la técnica de PIV en bovinos se ha masificado y se trabaja en los procesos de estandarización en otras especies. A partir de la PIV se dio el desarrollo de nuevas biotecnologías como la clonación y transgénesis. El objetivo de esta revisión es describir las fases de la PIV y su relación con los eventos fisiológicos de la fertilización y desarrollo embrionario temprano

Relationship Between Scrotal Circumference, Testicular Growth and Semen Quality Parameters in Guzerat Breed Bulls, from Puberty to 36 Months of Age

Objective: To investigate the association between scrotal circumference size and sperm characteristics in 194 males of Guzerat breed. Methods: The bulls were divided by age groups from 12 to 36 months of age. The length and width of the testicle and scrotal circumference were measured. Semen was collected from the animals that showed a circumference ≥ 19 cm through transrectal electrostimulation in order to induce ejaculation. The characteristics assessed in the semen were motility, speed, sperm concentration and presence of rounded cells. Results: the correlation between the scrotal circumference with the sperm motility by group of age was positive (r = 0.94; p < 0.005). The present study showed that the presence of proximal cytoplasmic droplet, the rounded cells in the semen and the defects on the head of the spermatozoids are objective evaluation features, which can be used for early selection of sperm production in Guzerat males. Conclusions: The production of sperm with normal rates in the Guzerat breed is achieved when males reach the age of 28 months and a scrotal circumference close to 30 cm

Relación entre la circunferencia escrotal, el crecimiento testicular y parámetros de calidad de semen en toros de raza Guzerat, desde la pubertad hasta los 36 meses de edad

Objetivo: investigar la asociación entre el tamaño de la circunferencia escrotal y las características espermáticas en 194 machos de la raza Guzerat. Métodos: los toros se dividieron por grupos de edades desde los 12 hasta los 36 meses de edad. Se realizaron mediciones del largo y ancho del testículo y de la circunferencia escrotal. A los animales que presentaron una circunferencia ≥ 19 cm se les colectó semen mediante electroestimulación transrectal para inducir la eyaculación. Las características evaluadas en el semen fueron motilidad, vigor, concentración espermática y presencia de células redondeadas. Resultados: la correlación entre la circunferencia escrotal con la motilidad espermática por grupo de edad fue positiva (r = 94; p \u3c 005). El presente estudio demostró que la presencia de gota citoplasmática proximal, las células redondeadas en el eyaculado y los defectos en la cabeza de los espermatozoides son características de evaluación objetiva, las cuales pueden ser utilizadas para seleccionar precozmente la producción de espermatozoides en estos machos Guzerat. Conclusiones: la producción de espermatozoides con parámetros normales en la raza Guzerat se logran cuando los machos llegan a la edad de 28 meses y una circunferencia escrotal cercana a los 30 cm

Concentración sérica de la hormona anti-Mülleriana y su relación con la reserva ovárica en vacas Brahman donantes de ovocitos

Objetive. To evaluate the relationship of AMH blood concentration with ovarian follicular count and in vitro embryo production in female Brahman cattle. Material and methods. To standardize the AMH quantification for Brahman donors, experiment 1 was performed, blood samples were taken from 10 heat synchronized Brahman females, in three different days of the estrous cycle, with more than 90 days postpartum and with normal reproductive evaluation. Serum concentration of AMH was determined with a commercial immunoenzymatic kit. After the technique was standardized, blood samples were taken from 100 non-synchronized Brahman oocyte donors, an ovum pick-up session was performed for in vitro embryo production and the number of follicles greater than 2 mm in the two ovaries was registered. Results. There were no differences in AMH concentration between the evaluated days of estrous cycle and a correlation of 0.82 (p&lt;0.001) was found between antral follicle population (AFP) and AMH concentration. Serum AMH concentration ranged from 0.02 to 2.69 ng/ml in Brahman oocyte donors. Also, a correlation of 0.73 (p&lt;0.001)  between AMH and AFP and 0.54 between the AMH and the percentage of blastocysts were found in donors. Conclusions. The AMH can be used as a satisfactory endocrine marker of ovarian reserve prediction for in vitro embryo production in Brahman cattle.  Objetivo. Evaluar la relación de la concentración sanguínea de AMH con el recuento folicular ovárico y la producción in vitro de embriones en hembras bovinas de la raza Brahman. Materiales y métodos. Para estandarizar la técnica de cuantificación de AMH se realizó un primer experimento, en el cual se tomaron muestras de sangre de 10 hembras Brahman sincronizadas en su celo, en tres días diferentes del ciclo estral, con más de 90 días posparto y con evaluación reproductiva normal. La concentración sérica de AMH se determinó con un kit inmunoenzimático comercial. Una vez estandarizada la técnica, se realizó un segundo experimento, se tomaron muestras de sangre de 100 donantes Brahman de ovocitos no sincronizadas, se realizó una sesión de aspiración folicular para la producción in vitro de embriones y se registró el número de folículos mayores de 2 mm en los dos ovarios. Resultados. No hubo diferencias en la concentración de AMH entre los días evaluados del ciclo estral y se encontró una correlación de 0,82 (p&lt;0.001) entre la población de folículos antrales (PFA) y la concentración de AMH. La concentración sérica de AMH osciló entre 0.02 y 2.69 ng/ml. Además, se encontró una correlación de 0.73 (p&lt;0.001) entre AMH y AFP y 0.54 entre AMH y el porcentaje de blastocistos producidos. Conclusiones. La AMH se puede utilizar como un marcador endocrino satisfactorio de la predicción de la reserva ovárica para la producción de embriones in vitro en ganado Brahman.