Role of lysozyme inhibitors in the virulence of avian pathogenic Escherichia coli

Lysozymes are key effectors of the animal innate immunity system that kill bacteria by hydrolyzing peptidoglycan, their major cell wall constituent. Recently, specific inhibitors of the three major lysozyme families occuring in the animal kingdom (c-, g- and i-type) have been discovered in Gram-negative bacteria, and it has been proposed that these may help bacteria to evade lysozyme mediated lysis during interaction with an animal host. Escherichia coli produces two inhibitors that are specific for c-type lysozyme (Ivy, Inhibitor of vertebrate lysozyme; MliC, membrane bound lysozyme inhibitor of c-type lysozyme), and one specific for g-type lysozyme (PliG, periplasmic lysozyme inhibitor of g-type lysozyme). Here, we investigated the role of these lysozyme inhibitors in virulence of Avian Pathogenic E. coli (APEC) using a serum resistance test and a subcutaneous chicken infection model. Knock-out of mliC caused a strong reduction in serum resistance and in in vivo virulence that could be fully restored by genetic complementation, whereas ivy and pliG could be knocked out without effect on serum resistance and virulence. This is the first in vivo evidence for the involvement of lysozyme inhibitors in bacterial virulence. Remarkably, the virulence of a ivy mliC double knock-out strain was restored to almost wild-type level, and this strain also had a substantial residual periplasmic lysozyme inhibitory activity that was higher than that of the single knock-out strains. This suggests the existence of an additional periplasmic lysozyme inhibitor in this strain, and indicates a regulatory interaction in the expression of the different inhibitors

A New Family of Lysozyme Inhibitors Contributing to Lysozyme Tolerance in Gram-Negative Bacteria

Lysozymes are ancient and important components of the innate immune system of animals that hydrolyze peptidoglycan, the major bacterial cell wall polymer. Bacteria engaging in commensal or pathogenic interactions with an animal host have evolved various strategies to evade this bactericidal enzyme, one recently proposed strategy being the production of lysozyme inhibitors. We here report the discovery of a novel family of bacterial lysozyme inhibitors with widespread homologs in gram-negative bacteria. First, a lysozyme inhibitor was isolated by affinity chromatography from a periplasmic extract of Salmonella Enteritidis, identified by mass spectrometry and correspondingly designated as PliC (periplasmic lysozyme inhibitor of c-type lysozyme). A pliC knock-out mutant no longer produced lysozyme inhibitory activity and showed increased lysozyme sensitivity in the presence of the outer membrane permeabilizing protein lactoferrin. PliC lacks similarity with the previously described Escherichia coli lysozyme inhibitor Ivy, but is related to a group of proteins with a common conserved COG3895 domain, some of them predicted to be lipoproteins. No function has yet been assigned to these proteins, although they are widely spread among the Proteobacteria. We demonstrate that at least two representatives of this group, MliC (membrane bound lysozyme inhibitor of c-type lysozyme) of E. coli and Pseudomonas aeruginosa, also possess lysozyme inhibitory activity and confer increased lysozyme tolerance upon expression in E. coli. Interestingly, mliC of Salmonella Typhi was picked up earlier in a screen for genes induced during residence in macrophages, and knockout of mliC was shown to reduce macrophage survival of S. Typhi. Based on these observations, we suggest that the COG3895 domain is a common feature of a novel and widespread family of bacterial lysozyme inhibitors in gram-negative bacteria that may function as colonization or virulence factors in bacteria interacting with an animal host

Isolation, purification and characterisation of new bacterial lysozyme inhibitors

Lysozymes zijn belangrijke componenten van het aangeboren defensiesysteem bij dieren en vertonen een antibacteriële werking door de hydrolyse van peptidoglycaan, de belangrijkste structurele component van de bacteriële celwand. Gezien het wijd verspreide voorkomen van verschillende types van lysozymes in het dierenrijk, en hun doeltreffendheid als antibacteriële agentia, is het niet verwonderlijk dat bacteriën op hun beurt strategieën ontwikkeld hebben om aan de lytische werking van lysozymes te ontsnappen. Zo wordt de peptidoglycaanlaag van Gram-negatieve bacteriën afgeschermd door hun buitenmembraan, en maken sommige bacteriën structuurvarianten van peptidoglycaan aan die ongevoelig zijn voor lysozym. Een meer recent ontdekte strategie is de productie van specifieke lysozym inhibitoren. In 2001 werd voor het eerst een specifieke proteïne lysozym inhibitor Ivy (Inhibitor van vertebraat lysozym) geïdentificeerd in het periplasma van Escherichia coli. Aangezien inactivatie van het ivy gen in E. coli resulteert in een snelle en volledige afdoding van de bacteriën in speeksel (in tegenstelling tot de overeenkomstige Ivy producerende stam die zelfs in staat was te groeien), kan Ivy beschouwd worden als een belangrijke factor in de bescherming van E. coli tegen gastheerlysozym wanneer het buitenmembraan van deze bacterie gepermeabiliseerd is. De beperkte verspreiding van ivy homologen in andere bacteriën wierp echter vragen op over de bredere relevantie van lysozym inhibitoren in bacterie-gastheer interacties. De globale doelstelling van dit werk was daarom te zoeken naar andere bacteriële lysozym inhibitoren specifiek voor c- of g-type lysozymes. In een eerste deel werd een algemene procedure op punt gesteld om nieuwe, bacteriële lysozym inhibitoren op te sporen. Deze procedure werd in eerste instantie gebruikt om Ivy uit E. coli op te zuiveren. Vervolgens werden Ivy homologen van Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae en Yersinia enterocolitica met succes geïsoleerd, opgezuiverd en geïdentificeerd, hetgeen de gevoeligheid en bruikbaarheid van de procedure in de zoektocht naar nieuwe bacteriële lysozym inhibitoren aantoont. Een screen van periplasmatische proteïneëxtracten van gram-negatieve bacteriën voor inhibitie van zowel kippeëi-eiwit lysozym (HEWL) als ganzenei-eiwit lysozym (GEWL) leverde duidelijke indicaties voor de aanwezigheid van een GEWL inhibitor in Aeromonas hydrophila en een Ivy-deficiënte E. coli mutant.Bovendien vertoonden de extracten van Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris en Salmonella Enteritidis (die geen van allen een ivy homologe sequentie in hun genoom herbergen) sterke HEWL inhibitorische activiteit, wat opnieuw de aanwezigheid van een type lysozym inhibitor, verschillend van Ivy suggereert. De verdere zuivering en identificatie van de component met HEWL inhibitorische activiteit uit het periplasma van S. Enteritidis bevestigde deze hypothese en de geïdentificeerde inhibitor werd omgedoopt tot PliC (Periplasmatische lysozym inhibitor van c-type lysozym). In een periplasmatisch extract van een pliC knock out mutant werd geen lysozym inhibitorische activiteit meer gedetecteerd. Bovendien bleek deze stam, in vergelijking met de overeenkomstige wildtype stam, gevoeliger te zijn voor lysozym in de aanwezigheid van het buitenmembraan permeabiliserende proteïne lactoferrin. PliC is verwant met een familie van proteïnen die gekenmerkt worden door een gemeenschappelijk geconserveerd COG3895 domein. Voor drie voorspelde lipoproteïnen van deze groep werd de HEWL inhibitorische activiteit bevestigd, en bijgevolg werden deze voortaan aangeduid als MliC (Membraangebonden lysozym inhibitor van c-type lysozym) van respectievelijk E. coli, Pseudomonas aeruginosa en Salmonella Typhimurium. Gebruik makende van een nieuw ontwikkelde omgekeerde zymogram-methode werd bovendien in P. mirabilis een bijkomende periplasmatische (PliC) vertegenwoordiger gedetecteerd, geïsoleerd en geïdentificeerd. Al de geteste HEWL inhibitoren (Ivy van E. coli, MliC van E. coli, MliC van P. aeruginosa) zorgden voor een verhoogde HEWL tolerantie wanneer ze tot expressie werden gebracht in E. coli ivy mliC. In een laatste gedeelte werd de inductie van HEWL inhibitoren door de Rcs regulatieweg bestudeerd. Recent werd aangetoond dat Rcs een celwand stressrespons doet aanslaan na blootstelling aan ß-lactam antibiotica, en microroosterdata hebben uitgewezen dat de expressie van ivy en mliC/pliC wordt opgereguleerd door deze regulatieweg in E. coli en S. Typhimurium. We konden aantonen dat hydrolyse van peptidoglycaan door lysozym ook de Rcs pathway induceert, met inbegrip van de lysozym inhibitoren. Bovendien bleek knockout van Rcs E. coli gevoeliger te maken voor lysozym, en deze gevoeligheid kon tenminste gedeeltelijk worden hersteld door overexpressie van de lysozym inhibitor Ivy. Deze resultaten verruimen het belang van de Rcs pathway als cellulaire respons op uiteenlopende soorten van celwandstress. Het wijdverspreide voorkomen van c-type lysozym in vertebraten laat vermoeden dat dit regulatiemechanisme van de productie van lysozym inhibitoren van belang kan zijn in de associatie van E. coli en S. Typhimurium met hun vertebrate gastheren.status: publishe

Food applications of bacterial cell wall hydrolases

Bacterial cell wall hydrolases (BCWHs) display a remarkable structural and functional diversity that offers perspectives for novel food applications, reaching beyond those of the archetype BCWH and established biopreservative hen egg white lysozyme. Insights in BCWHs from bacteriophages to animals have provided concepts for tailoring BCWHs to target specific pathogens or spoilage bacteria, or, conversely, to expand their working range to Gram-negative bacteria. Genetically modified foods expressing BCWHs in situ showed successful, but face regulatory and ethical concerns. An interesting spin-off development is the use of cell wall binding domains of bacteriophage BCWHs for detection and removal of foodborne pathogens. Besides for improving food safety or stability, BCWHs may also find use as functional food ingredients with specific health effects.status: publishe

Goose-Type Lysozyme Inhibitor (PliG) Enhances Survival of Escherichia coli in Goose Egg Albumen ▿

The goose-type lysozyme inhibitor PliG enhances the survival of Escherichia coli in goose but not in chicken egg white, which contains goose- and chicken-type lysozymes, respectively. These results indicate that both the type of host lysozyme and the type of bacterial lysozyme inhibitor may affect bacterium-host interactions

Structure based discovery of small molecule suppressors targeting bacterial lysozyme inhibitors

The production of lysozyme inhibitors, competitively binding to the lysozyme active site, is a bacterial strategy to prevent the lytic activity of host lysozymes. Therefore, suppression of the lysozyme-inhibitor interaction is an interesting new approach for drug development since restoration of the bacterial lysozyme sensitivity will support bacterial clearance from the infected sites. Using molecular modelling techniques the interaction of the Salmonella PliC inhibitor with c-type lysozyme was studied and a protein-protein interaction based pharmacophore model was created. This model was used as a query to identify molecules, with potential affinity for the target, and subsequently, these molecules were filtered using molecular docking. The retained molecules were validated as suppressors of lysozyme inhibitory proteins using in vitro experiments revealing four active molecules.status: publishe

Recovery of puborectalis muscle after vaginal delivery: an ultrasound study

OBJECTIVES: To assess change in levator hiatal dimensions between pregnancy and different timepoints after vaginal delivery, and map recovery of the hiatus in order to contribute to secondary prevention of symptoms of pelvic floor disorders. METHODS: Twenty nulliparous women with a singleton pregnancy underwent ultrasound assessment of the pelvic floor at rest, on maximum pelvic floor muscle contraction (PFMC) and on Valsalva maneuver at 12 weeks' gestation and at 1 day and 1, 2, 3, 4, 6, 12, 18 and 24 weeks after vaginal delivery. Dimensions of the levator hiatus were measured and contractility and distensibility were calculated. The Wilcoxon signed rank test was used to compare each postpartum value with that at 12 weeks' gestation. RESULTS: Levator hiatal area at rest, on PFMC and on Valsalva maneuver was significantly increased at 1 day and at 1 and 2 weeks after vaginal delivery compared with measurements at 12 weeks' gestation. Hiatal area at rest and on PFMC from 3 weeks postpartum onward, as well as contractility from 6 weeks onward, were comparable to values at 12 weeks' gestation, whereas, a significant difference remained on Valsalva maneuver until 24 weeks after delivery. Moreover, distensibility was still increased at 24 weeks postpartum compared with measurements at 12 weeks' gestation. CONCLUSION: The puborectalis muscle has the ability to recover anatomically from a first vaginal delivery, and recovery occurs mainly during the first 3 weeks after delivery. Stretching of the puborectalis muscle, as reflected by distensibility, persisted 24 weeks after the first vaginal delivery. The data provide a better understanding of the early 'normal' regeneration process and we hypothesize that the first 3 weeks postpartum is the best window in which to start secondary prevention. Copyright © 2017 ISUOG. Published by John Wiley & Sons Ltd