Isolation, purification and characterisation of new bacterial lysozyme inhibitors

Abstract

Lysozymes zijn belangrijke componenten van het aangeboren defensiesysteem bij dieren en vertonen een antibacteriële werking door de hydrolyse van peptidoglycaan, de belangrijkste structurele component van de bacteriële celwand. Gezien het wijd verspreide voorkomen van verschillende types van lysozymes in het dierenrijk, en hun doeltreffendheid als antibacteriële agentia, is het niet verwonderlijk dat bacteriën op hun beurt strategieën ontwikkeld hebben om aan de lytische werking van lysozymes te ontsnappen. Zo wordt de peptidoglycaanlaag van Gram-negatieve bacteriën afgeschermd door hun buitenmembraan, en maken sommige bacteriën structuurvarianten van peptidoglycaan aan die ongevoelig zijn voor lysozym. Een meer recent ontdekte strategie is de productie van specifieke lysozym inhibitoren. In 2001 werd voor het eerst een specifieke proteïne lysozym inhibitor Ivy (Inhibitor van vertebraat lysozym) geïdentificeerd in het periplasma van Escherichia coli. Aangezien inactivatie van het ivy gen in E. coli resulteert in een snelle en volledige afdoding van de bacteriën in speeksel (in tegenstelling tot de overeenkomstige Ivy producerende stam die zelfs in staat was te groeien), kan Ivy beschouwd worden als een belangrijke factor in de bescherming van E. coli tegen gastheerlysozym wanneer het buitenmembraan van deze bacterie gepermeabiliseerd is. De beperkte verspreiding van ivy homologen in andere bacteriën wierp echter vragen op over de bredere relevantie van lysozym inhibitoren in bacterie-gastheer interacties. De globale doelstelling van dit werk was daarom te zoeken naar andere bacteriële lysozym inhibitoren specifiek voor c- of g-type lysozymes. In een eerste deel werd een algemene procedure op punt gesteld om nieuwe, bacteriële lysozym inhibitoren op te sporen. Deze procedure werd in eerste instantie gebruikt om Ivy uit E. coli op te zuiveren. Vervolgens werden Ivy homologen van Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae en Yersinia enterocolitica met succes geïsoleerd, opgezuiverd en geïdentificeerd, hetgeen de gevoeligheid en bruikbaarheid van de procedure in de zoektocht naar nieuwe bacteriële lysozym inhibitoren aantoont. Een screen van periplasmatische proteïneëxtracten van gram-negatieve bacteriën voor inhibitie van zowel kippeëi-eiwit lysozym (HEWL) als ganzenei-eiwit lysozym (GEWL) leverde duidelijke indicaties voor de aanwezigheid van een GEWL inhibitor in Aeromonas hydrophila en een Ivy-deficiënte E. coli mutant.Bovendien vertoonden de extracten van Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris en Salmonella Enteritidis (die geen van allen een ivy homologe sequentie in hun genoom herbergen) sterke HEWL inhibitorische activiteit, wat opnieuw de aanwezigheid van een type lysozym inhibitor, verschillend van Ivy suggereert. De verdere zuivering en identificatie van de component met HEWL inhibitorische activiteit uit het periplasma van S. Enteritidis bevestigde deze hypothese en de geïdentificeerde inhibitor werd omgedoopt tot PliC (Periplasmatische lysozym inhibitor van c-type lysozym). In een periplasmatisch extract van een pliC knock out mutant werd geen lysozym inhibitorische activiteit meer gedetecteerd. Bovendien bleek deze stam, in vergelijking met de overeenkomstige wildtype stam, gevoeliger te zijn voor lysozym in de aanwezigheid van het buitenmembraan permeabiliserende proteïne lactoferrin. PliC is verwant met een familie van proteïnen die gekenmerkt worden door een gemeenschappelijk geconserveerd COG3895 domein. Voor drie voorspelde lipoproteïnen van deze groep werd de HEWL inhibitorische activiteit bevestigd, en bijgevolg werden deze voortaan aangeduid als MliC (Membraangebonden lysozym inhibitor van c-type lysozym) van respectievelijk E. coli, Pseudomonas aeruginosa en Salmonella Typhimurium. Gebruik makende van een nieuw ontwikkelde omgekeerde zymogram-methode werd bovendien in P. mirabilis een bijkomende periplasmatische (PliC) vertegenwoordiger gedetecteerd, geïsoleerd en geïdentificeerd. Al de geteste HEWL inhibitoren (Ivy van E. coli, MliC van E. coli, MliC van P. aeruginosa) zorgden voor een verhoogde HEWL tolerantie wanneer ze tot expressie werden gebracht in E. coli ivy mliC. In een laatste gedeelte werd de inductie van HEWL inhibitoren door de Rcs regulatieweg bestudeerd. Recent werd aangetoond dat Rcs een celwand stressrespons doet aanslaan na blootstelling aan ß-lactam antibiotica, en microroosterdata hebben uitgewezen dat de expressie van ivy en mliC/pliC wordt opgereguleerd door deze regulatieweg in E. coli en S. Typhimurium. We konden aantonen dat hydrolyse van peptidoglycaan door lysozym ook de Rcs pathway induceert, met inbegrip van de lysozym inhibitoren. Bovendien bleek knockout van Rcs E. coli gevoeliger te maken voor lysozym, en deze gevoeligheid kon tenminste gedeeltelijk worden hersteld door overexpressie van de lysozym inhibitor Ivy. Deze resultaten verruimen het belang van de Rcs pathway als cellulaire respons op uiteenlopende soorten van celwandstress. Het wijdverspreide voorkomen van c-type lysozym in vertebraten laat vermoeden dat dit regulatiemechanisme van de productie van lysozym inhibitoren van belang kan zijn in de associatie van E. coli en S. Typhimurium met hun vertebrate gastheren.status: publishe