Optimizing filter trap assay for the detection of aggregated alpha-synuclein in brain samples

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Mycolactone Gene Expression Is Controlled by Strong SigA-Like Promoters with Utility in Studies of Mycobacterium ulcerans and Buruli Ulcer

Mycolactone A/B is a lipophilic macrocyclic polyketide that is the primary virulence factor produced by Mycobacterium ulcerans, a human pathogen and the causative agent of Buruli ulcer. In M. ulcerans strain Agy99 the mycolactone polyketide synthase (PKS) locus spans a 120 kb region of a 174 kb megaplasmid. Here we have identified promoter regions of this PKS locus using GFP reporter assays, in silico analysis, primer extension, and site-directed mutagenesis. Transcription of the large PKS genes mlsA1 (51 kb), mlsA2 (7 kb) and mlsB (42 kb) is driven by a novel and powerful SigA-like promoter sequence situated 533 bp upstream of both the mlsA1 and mlsB initiation codons, which is also functional in Escherichia coli, Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium marinum. Promoter regions were also identified upstream of the putative mycolactone accessory genes mup045 and mup053. We transformed M. ulcerans with a GFP-reporter plasmid under the control of the mls promoter to produce a highly green-fluorescent bacterium. The strain remained virulent, producing both GFP and mycolactone and causing ulcerative disease in mice. Mosquitoes have been proposed as a potential vector of M. ulcerans so we utilized M. ulcerans-GFP in microcosm feeding experiments with captured mosquito larvae. M. ulcerans-GFP accumulated within the mouth and midgut of the insect over four instars, whereas the closely related, non-mycolactone-producing species M. marinum harbouring the same GFP reporter system did not. This is the first report to identify M. ulcerans toxin gene promoters, and we have used our findings to develop M. ulcerans-GFP, a strain in which fluorescence and toxin gene expression are linked, thus providing a tool for studying Buruli ulcer pathogenesis and potential transmission to humans

New Antibody-Free Mass Spectrometry-Based Quantification Reveals That C9ORF72 Long Protein Isoform Is Reduced in the Frontal Cortex of Hexanucleotide-Repeat Expansion Carriers

Frontotemporal dementia (FTD) is a fatal neurodegenerative disease characterized by behavioral and language disorders. The main genetic cause of FTD is an intronic hexanucleotide repeat expansion (G4C2)n in the C9ORF72 gene. A loss of function of the C9ORF72 protein associated with the allele-specific reduction of C9ORF72 expression is postulated to contribute to the disease pathogenesis. To better understand the contribution of the loss of function to the disease mechanism, we need to determine precisely the level of reduction in C9ORF72 long and short isoforms in brain tissue from patients with C9ORF72 mutations. In this study, we developed a sensitive and robust mass spectrometry (MS) method for quantifying C9ORF72 isoform levels in human brain tissue without requiring antibody or affinity reagent. An optimized workflow based on surfactant-aided protein extraction and pellet digestion was established for optimal recovery of the two isoforms in brain samples. Signature peptides, common or specific to the isoforms, were targeted in brain extracts by multiplex MS through the parallel reaction monitoring mode on a Quadrupole–Orbitrap high resolution mass spectrometer. The assay was successfully validated and subsequently applied to frontal cortex brain samples from a cohort of FTD patients with C9ORF72 mutations and neurologically normal controls without mutations. We showed that the C9ORF72 short isoform in the frontal cortices is below detection threshold in all tested individuals and the C9ORF72 long isoform is significantly decreased in C9ORF72 mutation carriers

La sous-unité lourde des neurofilaments (NFH): du gène à la pathologie

Neurofilaments (NFs) are the major and specific Intermediate Filaments (IF) of neurons. They are required for the maintenance and proper function of axons. Among the three subunits, the high molecular NFH, is the last to appear during neurogenesis and synaptogenesis. However its precise role is unknown. Accumulation of cytoskeleton components is a fundamental event in neurodegenerative diseases, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), or in peripheral neuropathies, including Neurofilaments. Their aggregation in the cytoplasm or in axon may perturb the axonal flow. We develop a cellular and molecular tool through a fusion protein, NFHGFP, which allows us to follow the metabolism of NFH using the fluorochrome eGFP. The expression of NFHGFP, in cell culture experiments or in transgenic mice, does not modify the metabolism of IF, nor NFHGFP aggregation induced with specific IF toxic drugs or in double transgenic mice (NFHLacZ/NFHGFP). NFHGFP appears to be a new tool that could help to dissect the mechanisms of neuronal differentiation, intracellular and axono-myelinic interactions, neurotoxicity? We also show that regulatory elements are present in the second intron of NFH. These results are in accordance with those described for NFM and NFL. After having described, in mice, that a microtubule associated protein, STOP, is also associated with Neurofilaments, we demonstrated that STOP is also present in human nervous tissues and is associated with Neurofilaments. The protein is also aggregated in pathological neuronal structures known to be enriched in NFs, the spheroids. Finally, in axonal peripheral neuropathies of unknown aetiology, we point up that expression of Tubulin and NFs, is the same as in axonal growth and we postulate that chronic failure of regeneration may explain the pathophysiology of these neuropathies.Le cytosquelette des neurones matures est majoritairement composé de Neurofilaments. Ils sont nécessaires à la mise en place et au maintien de l'axone. Parmi les trois sous unités qui composent le neurofilament, celle de haut poids moléculaire (NFH) apparaît le plus tardivement lors de la différentiation de la synapse et sa fonction précise est mal connue. Une perturbation du métabolisme des Neurofilaments (à l'échelon de la protéine et/ou du gène) est impliquée dans certaines pathologies du système nerveux. Dans les maladies neurodégénératives, en particulier dans la Sclérose Latérale Amyotophique (SLA) ou dans des neuropathies périphériques, l'agrégation de NFs dans le corps cellulaire et dans l'axone, avec perturbation du flux axonal, est un événement fondamental. Nous avons développé un outil cellulaire et moléculaire, utilisant une protéine de fusion NFHGFP, permettant, grâce à un fluorochrome (eGFP), de suivre le métabolisme de NFH. En culture de cellules ou chez des souris transgéniques, l'expression de cette protéine de fusion ne modifie pas leur fonctionnement ni leur comportement en présence notamment de drogues susceptibles d'entraîner leur agrégation. L'utilisation de cet outil, en particulier en association avec l'expression de la protéine NFHLacZ, ouvre la voie pour de nouvelles études en situation physiologique et pathologique : différentiation neuronale, interactions intracellulaires et axonomyéliniques, études de neurotoxicité... Les travaux présentés portent également sur les mécanismes de régulation intragénique de NFH. Nous avons montré que, comme pour les deux autres sous unités (NFL et NFM), les séquences introniques, en particulier le second intron, permettaient de contrôler dans le temps et dans l'espace l'expression d'un rapporteur. Dans un objectif de transposition des résultats de la recherche fondamentale et expérimentale à la recherche clinique, nous avons démontré qu'une protéine initialement décrite comme associée aux microtubules (STOP) était également associée aux neurofilaments dans les tissus humains normaux et pathologiques (SLA). Enfin nous avons pu établir que le profil d'expression de la tubuline et des Neurofilaments dans des neuropathies périphériques de cause indéterminée reproduisait celui de la croissance axonale, et qu'une régénération inefficace pouvait également être à l'origine de certaines neuropathies

La sous-unité lourde des neurofilaments (NFH) (du gène à la pathologie)

Le cytosquelette des neurones matures est majoritairement composé de Neurofilaments. Ils sont nécessaires à la mise en place et au maintien de l'axone. Parmi les trois sous unités qui composent le neurofilament, celle de haut poids moléculaire (NFH) apparaît le plus tardivement lors de la différentiation de la synapse et sa fonction précise est mal connue. Une perturbation du métabolisme des Neurofilaments (à l'échelon de la protéine et/ou du gène) est impliquée dans certaines pathologies du système nerveux. Dans les maladies neurodégénératives, en particulier dans la Sclérose Latérale Amyotophique (SLA) ou dans des neuropathies périphériques, l'agrégation de NFs dans le corps cellulaire et dans l'axone, avec perturbation du flux axonal, est un événement fondamental. Nous avons développé un outil cellulaire et moléculaire, utilisant une protéine de fusion NFHGFP, permettant, grâce à un fluorochrome (eGFP), de suivre le métabolisme de NFH. En culture de cellules ou chez des souris transgéniques, l'expression de cette protéine de fusion ne modifie pas leur fonctionnement ni leur comportement en présence notamment de drogues susceptibles d'entraîner leur agrégation. L'utilisation de cet outil, en particulier en association avec l'expression de la protéine NFHLacZ, ouvre la voie pour de nouvelles études en situation physiologique et pathologique : différentiation neuronale, interactions intracellulaires et axonomyéliniques, études de neurotoxicité... Les travaux présentés portent également sur les mécanismes de régulation intragénique de NFH. Nous avons montré que, comme pour les deux autres sous unités (NFL et NFM), les séquences introniques, en particulier le second intron, permettaient de contrôler dans le temps et dans l'espace l'expression d'un rapporteur. Dans un objectif de transposition des résultats de la recherche fondamentale et expérimentale à la recherche clinique, nous avons démontré qu'une protéine initialement décrite comme associée aux microtubules (STOP) était également associée aux neurofilaments dans les tissus humains normaux et pathologiques (SLA). Enfin nous avons pu établir que le profil d'expression de la tubuline et des Neurofilaments dans des neuropathies périphériques de cause indéterminée reproduisait celui de la croissance axonale, et qu'une régénération inefficace pouvait également être à l'origine de certaines neuropathies.Neurofilaments (NFs) are the major and specific Intermediate Filaments (IF) of neurons. They are required for the maintenance and proper function of axons. Among the three subunits, the high molecular NFH, is the last to appear during neurogenesis and synaptogenesis. However its precise role is unknown. Accumulation of cytoskeleton components is a fundamental event in neurodegenerative diseases, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), or in peripheral neuropathies, including Neurofilaments. Their aggregation in the cytoplasm or in axon may perturb the axonal flow. We develop a cellular and molecular tool through a fusion protein, NFHGFP, which allows us to follow the metabolism of NFH using the fluorochrome eGFP. The expression of NFHGFP, in cell culture experiments or in transgenic mice, does not modify the metabolism of IF, nor NFHGFP aggregation induced with specific IF toxic drugs or in double transgenic mice (NFHLacZ/NFHGFP). NFHGFP appears to be a new tool that could help to dissect the mechanisms of neuronal differentiation, intracellular and axono-myelinic interactions, neurotoxicity? We also show that regulatory elements are present in the second intron of NFH. These results are in accordance with those described for NFM and NFL. After having described, in mice, that a microtubule associated protein, STOP, is also associated with Neurofilaments, we demonstrated that STOP is also present in human nervous tissues and is associated with Neurofilaments. The protein is also aggregated in pathological neuronal structures known to be enriched in NFs, the spheroids. Finally, in axonal peripheral neuropathies of unknown aetiology, we point up that expression of Tubulin and NFs, is the same as in axonal growth and we postulate that chronic failure of regeneration may explain the pathophysiology of these neuropathies.ANGERS-BU Médecine-Pharmacie (490072105) / SudocSudocFranceF

Biopsies de glandes salivaires accessoires (une nouvelle source de biomarqueurs pour la maladie de Parkinson ?)

OBJECTIF: Mettre en évidence la présence d'inclusions de phospho-a-synucléine dans les glandes salivaires accessoires de patients parkinsoniens afin d'évaluer l'utilité des biopsies de glandes salivaires accessoires en tant que biomarqueur dans la maladie de Parkinson (MP). INTRODUCTION: Il n'existe pas à l'heure actuelle de biomarqueur radiologique ou biochimique validé dans la MP. Un biomarqueur neuropathologique permettrait d'établir le diagnostic positif et de différencier la MP de l'atrophie multisystème ou de la paralysie supranucléaire progressive. Les études post-mortem du système salivaire dans la MP ont montré que le système nerveux autonome pré- et postganglionnaire innervant les glandes salivaires, était atteint par le processus pathologique de façon marquée. Le système salivaire pourrait être un biomarqueur intéressant car facilement accessible à la biopsie et fortement innervé par les neurones postganglionnaires. MATERIEL/METHODES: 28 patients (16 parkinsoniens, 12 témoins) ont bénéficié d'une biopsie de glandes salivaires accessoires, grâce à une courte incision de la lèvre inférieure après anesthésie locale et prélèvement de 1 à 2 glandes salivaires accessoires. Le tissu était fixé dans du paraformaldéhyde, inclus en paraffine, puis immunomarqué par un anticorps anti phospho-a-synucléine (1:10 000, Wako, Osaka, Japan). Trois coupes de 4 m d'épaisseur étaient étudiées par patient. RESULTATS: Seuls 3/16 (19%) patients parkinsoniens ont révélé des inclusions phospho-?-synucléine positives, se rapprochant de prolongements de Lewy. Deux des 12 témoins étaient faiblement immunoréactifs (17%). Aucune complication liée au geste n'a été rapportée. CONCLUSION: La sensibilité de l'analyse des BGSA par immuno-histochimie anti phospho-a-synucléine pour le diagnostic de MP est décevante et ne confirme pas les données autopsiques obtenues dans les glandes sous-maxillaires. Nos résultats sont confirmés par ceux d'une autre équipe, en cours de publication. Des explorations complémentaires, visant à mieux caractériser l'infiltrat inflammatoire et à étudier la protéine pathologique par des techniques non immuno-histochimiques comme la migration sur gel bidimensionnel, sont des perspectives intéressantes pour l'avenir.NANTES-BU Médecine pharmacie (441092101) / SudocSudocFranceF

Late-onset camptocormia caused by a heterozygous in-frame CAPN3 deletion

International audienceCamptocormia is defined by a pathological involuntary flexion of the thoracic and lumbar spine that is fully reducible in the supine position. Although originally described as a manifestation of conversion disorder, it is more commonly caused by a wide range of neurological diseases, in particular movement and neuromuscular disorders. We describe here a rare case of late onset camptocormia caused by autosomal dominant calpainopathy due to a heterozygous in-frame deletion in CAPN3 leading to loss of a single lysin amino acid in the catalytic domain of calpain-3. Creatine kinase levels, electromyography, and thigh muscle MRI were normal. Muscle biopsy did not show lobulated fibers and calpain-3 protein expression was not decreased, but in vitro functional assays showed impaired proteolytic function of. Lys254del CAPN3. Autosomal dominant calpainopathy should be considered in the differential diagnosis of late onset camptocormia and unexplained paravertebral myopathies even in presence of normal creatine kinase levels, and in absence of lobulated fibers, of decreased calpain-3 protein expression, and of muscle limb involvement

Characterization of Cells Interactions with Patterned Azopolymer-Based Materials using SEM, AFM and Video Microscopy

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Myoadenylate deaminase deficiency: a frequent cause of muscle pain A case detected by exercise testing

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