Lack of evidence for a role of hydrophobins in conferring surface hydrophobicity to conidia and hyphae of Botrytis cinerea

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Hydrophobins are small, cysteine rich, surface active proteins secreted by filamentous fungi, forming hydrophobic layers on the walls of aerial mycelia and spores. Hydrophobin mutants in a variety of fungi have been described to show 'easily wettable' phenotypes, indicating that hydrophobins play a general role in conferring surface hydrophobicity to aerial hyphae and spores.</p> <p>Results</p> <p>In the genome of the grey mould fungus <it>Botrytis cinerea</it>, genes encoding three hydrophobins and six hydrophobin-like proteins were identified. Expression analyses revealed low or no expression of these genes in conidia, while some of them showed increased or specific expression in other stages, such as sclerotia or fruiting bodies. Bhp1 belongs to the class I hydrophobins, whereas Bhp2 and Bhp3 are members of hydrophobin class II. Single, double and triple hydrophobin knock-out mutants were constructed by consecutively deleting <it>bhp1</it>, <it>bhp2 </it>and <it>bhp3</it>. In addition, a mutant in the hydrophobin-like gene <it>bhl1 </it>was generated. The mutants were tested for germination and growth under different conditions, formation of sclerotia, ability to penetrate and infect host tissue, and for spore and mycelium surface properties. Surprisingly, none of the <it>B. cinerea </it>hydrophobin mutants showed obvious phenotypic defects in any of these characters. Scanning electron microscopy of the hydrophobic conidial surfaces did not reveal evidence for the presence of typical hydrophobin 'rodlet' layers.</p> <p>Conclusions</p> <p>These data provide evidence that in <it>B. cinerea</it>, hydrophobins are not involved in conferring surface hydrophobicity to conidia and aerial hyphae, and challenge their universal role in filamentous fungi. The function of some of these proteins in sclerotia and fruiting bodies remains to be investigated.</p

Genome analysis of the necrotrophic fungal pathogens Sclerotinia sclerotiorum and Botrytis cinerea

Sclerotinia sclerotiorum and Botrytis cinerea are closely related necrotrophic plant pathogenic fungi notable for their wide host ranges and environmental persistence. These attributes have made these species models for understanding the complexity of necrotrophic, broad host-range pathogenicity. Despite their similarities, the two species differ in mating behaviour and the ability to produce asexual spores. We have sequenced the genomes of one strain of S. sclerotiorum and two strains of B. cinerea. The comparative analysis of these genomes relative to one another and to other sequenced fungal genomes is provided here. Their 38–39 Mb genomes include 11,860–14,270 predicted genes, which share 83% amino acid identity on average between the two species. We have mapped the S. sclerotiorum assembly to 16 chromosomes and found large-scale co-linearity with the B. cinerea genomes. Seven percent of the S. sclerotiorum genome comprises transposable elements compared t

Fungicide-Driven Evolution and Molecular Basis of Multidrug Resistance in Field Populations of the Grey Mould Fungus Botrytis cinerea

The grey mould fungus Botrytis cinerea causes losses of commercially important fruits, vegetables and ornamentals worldwide. Fungicide treatments are effective for disease control, but bear the risk of resistance development. The major resistance mechanism in fungi is target protein modification resulting in reduced drug binding. Multiple drug resistance (MDR) caused by increased efflux activity is common in human pathogenic microbes, but rarely described for plant pathogens. Annual monitoring for fungicide resistance in field isolates from fungicide-treated vineyards in France and Germany revealed a rapidly increasing appearance of B. cinerea field populations with three distinct MDR phenotypes. All MDR strains showed increased fungicide efflux activity and overexpression of efflux transporter genes. Similar to clinical MDR isolates of Candida yeasts that are due to transcription factor mutations, all MDR1 strains were shown to harbor activating mutations in a transcription factor (Mrr1) that controls the gene encoding ABC transporter AtrB. MDR2 strains had undergone a unique rearrangement in the promoter region of the major facilitator superfamily transporter gene mfsM2, induced by insertion of a retrotransposon-derived sequence. MDR2 strains carrying the same rearranged mfsM2 allele have probably migrated from French to German wine-growing regions. The roles of atrB, mrr1 and mfsM2 were proven by the phenotypes of knock-out and overexpression mutants. As confirmed by sexual crosses, combinations of mrr1 and mfsM2 mutations lead to MDR3 strains with higher broad-spectrum resistance. An MDR3 strain was shown in field experiments to be selected against sensitive strains by fungicide treatments. Our data document for the first time the rising prevalence, spread and molecular basis of MDR populations in a major plant pathogen in agricultural environments. These populations will increase the risk of grey mould rot and hamper the effectiveness of current strategies for fungicide resistance management

Genomic Analysis of the Necrotrophic Fungal Pathogens Sclerotinia sclerotiorum and Botrytis cinerea

Sclerotinia sclerotiorum and Botrytis cinerea are closely related necrotrophic plant pathogenic fungi notable for their wide host ranges and environmental persistence. These attributes have made these species models for understanding the complexity of necrotrophic, broad host-range pathogenicity. Despite their similarities, the two species differ in mating behaviour and the ability to produce asexual spores. We have sequenced the genomes of one strain of S. sclerotiorum and two strains of B. cinerea. The comparative analysis of these genomes relative to one another and to other sequenced fungal genomes is provided here. Their 38–39 Mb genomes include 11,860–14,270 predicted genes, which share 83% amino acid identity on average between the two species. We have mapped the S. sclerotiorum assembly to 16 chromosomes and found large-scale co-linearity with the B. cinerea genomes. Seven percent of the S. sclerotiorum genome comprises transposable elements compared to <1% of B. cinerea. The arsenal of genes associated with necrotrophic processes is similar between the species, including genes involved in plant cell wall degradation and oxalic acid production. Analysis of secondary metabolism gene clusters revealed an expansion in number and diversity of B. cinerea–specific secondary metabolites relative to S. sclerotiorum. The potential diversity in secondary metabolism might be involved in adaptation to specific ecological niches. Comparative genome analysis revealed the basis of differing sexual mating compatibility systems between S. sclerotiorum and B. cinerea. The organization of the mating-type loci differs, and their structures provide evidence for the evolution of heterothallism from homothallism. These data shed light on the evolutionary and mechanistic bases of the genetically complex traits of necrotrophic pathogenicity and sexual mating. This resource should facilitate the functional studies designed to better understand what makes these fungi such successful and persistent pathogens of agronomic crops

Molecular, biochemical and physiological analysis of transport proteins belonging to the MCF (Mitochondrial Carrier Family) of plants and protists

Die Transportproteine AtER-ANT1 und OsER-ANT1 sind Vertreter der MCF (mitochondrial carrier family) und werden phylogenetisch in die Gruppe der klassischen mitochondrialen ADP/ATP-Transporter (AACs) eingegliedert. Unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtER-ANT1 und OsER-ANT1 um spezifische ADP/ATP-Transporter handelt. Der Transport dieser Substrate verläuft in Form eines Gegentausches, entsprechend den klassischen mitochondrialen AACs. Sowohl AtER-ANT1 als auch OsER-ANT1 sind hochgradig insensitiv gegen die Hemmstoffe BKA und CAT der klassischen mitochondrialen AACs. Dagegen konnte für diese Transportproteine NEM (N-ethylmaleimid) als spezifischer Hemmstoff identifiziert werden, der interessanterweise auch eine inhibierende Wirkung auf den Nukleotidtransport ber die ER-Membran besitzt. Der Transport der klassischen mitochondrialen AACs wird dagegen nicht beeinflusst. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisierung von AtER-ANT1 mittels GFP-Fusion ergaben, dass dieses Protein in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist. Weiter wurde eine Methode etabliert, die Lokalisierung des AtER-ANT1 in planta zu untersuchen. Durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation in Abhängigkeit der An- bzw. Abwesenheit von Mg2+ konnte die Lokalisierung des AtER-ANT1 im ER bestätigt werden. Weiter konnte mit diesem Gradienten auch eine Kolokalisierung des AtER-ANT1 mit dem ER-spezifischen Marker-Protein Calretikulin gezeigt werden. Eine Analyse der gewebespezifischen Expression offenbarte eine starke Expression des AtERANT1 in Geweben, die eine hohe ER-Aktivität aufweisen, u.a. die Wurzelspitze, die Leitgefäße, die Samen und die Pollengewebe. Desweiteren wurde die physiologische Rolle des AtER-ANT1 anhand von zwei unabhängigen Knockout-Linien bezüglich dieses Gens umfassend untersucht. Es konnte dabei gezeigt werden, dass der dramatisch im Wachstum retardierte Phänotyp der Knockout-Pflanzen unter ambienten Wachstumsbedingungen mit einer enormen Veränderung des gesamten Stoffwechsels einhergeht. Detaillierte Metabolit-Analysen zeigten außerdem, dass die Deletion des AtER-ANT1 Gens besonders starke pleiotrope Effekte auf den Photorespirationsstoffwechsel hat. Diese Beobachtungen wurden durch Analysen der Knockout-Pflanzen unter hoch CO2-Bedingungen bestätigt. Die hoch CO2-Bedingungen bewirkten sowohl eine Verbesserung des gesamten Stoffwechsels als auch der morphologischen phänotypischen Erscheinung der Knockout-Pflanzen. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Redundanz verschiedener AACIsoformen in Arabidopsis thaliana, die auf biochemischer Ebene sehr ähnliche Eigenschaften besitzen. Knockout-Analysen zeigten, dass AtAAC1 für den pflanzlichen Stoffwechsel essentiell ist, da das Ausschalten eine Letalität der Pflanzen hervorruft. Für AtAAC2 und AtAAC3 kann dahingegen eine physiologische Bedeutung in späten Entwicklungsstadien der Pflanze angenommen werden. Neben der Charakterisierung pflanzlicher Transportproteine wurde zudem ein mitosomaler Adeninnukleotid-Transporter aus dem Protisten Entamoeba histolytica biochemisch unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems charakterisiert. Die Analysen ergaben, dass es sich bei diesem Adeninnukleotid-Transporter um ein zu den klassischen mitochondrialen AACs alternatives Transportprotein handelt, das sich sowohl im Substratspektrum als auch in Inhibitorstudien von bereits charakterisierten mitochondrialen und hydrogenosomalen ATP/ADP-Transportern unterscheidet. Mitosomen benötigen Energie u.a. zur Bildung von Fe-S-Clustern. Da diese Organellform im Gegensatz zu Mitochondrien und Hydrogenosomen nicht zu einer ATP-Synthese fähig sind, indizieren die ermittelten Daten eine physiologische Funktion dieses Proteins in der Versorgung der Mitosomen mit ATP

Molecular, biochemical and physiological analysis of transport proteins belonging to the MCF (Mitochondrial Carrier Family) of plants and protists

Die Transportproteine AtER-ANT1 und OsER-ANT1 sind Vertreter der MCF (mitochondrial carrier family) und werden phylogenetisch in die Gruppe der klassischen mitochondrialen ADP/ATP-Transporter (AACs) eingegliedert. Unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtER-ANT1 und OsER-ANT1 um spezifische ADP/ATP-Transporter handelt. Der Transport dieser Substrate verläuft in Form eines Gegentausches, entsprechend den klassischen mitochondrialen AACs. Sowohl AtER-ANT1 als auch OsER-ANT1 sind hochgradig insensitiv gegen die Hemmstoffe BKA und CAT der klassischen mitochondrialen AACs. Dagegen konnte für diese Transportproteine NEM (N-ethylmaleimid) als spezifischer Hemmstoff identifiziert werden, der interessanterweise auch eine inhibierende Wirkung auf den Nukleotidtransport ber die ER-Membran besitzt. Der Transport der klassischen mitochondrialen AACs wird dagegen nicht beeinflusst. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisierung von AtER-ANT1 mittels GFP-Fusion ergaben, dass dieses Protein in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist. Weiter wurde eine Methode etabliert, die Lokalisierung des AtER-ANT1 in planta zu untersuchen. Durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation in Abhängigkeit der An- bzw. Abwesenheit von Mg2+ konnte die Lokalisierung des AtER-ANT1 im ER bestätigt werden. Weiter konnte mit diesem Gradienten auch eine Kolokalisierung des AtER-ANT1 mit dem ER-spezifischen Marker-Protein Calretikulin gezeigt werden. Eine Analyse der gewebespezifischen Expression offenbarte eine starke Expression des AtERANT1 in Geweben, die eine hohe ER-Aktivität aufweisen, u.a. die Wurzelspitze, die Leitgefäße, die Samen und die Pollengewebe. Desweiteren wurde die physiologische Rolle des AtER-ANT1 anhand von zwei unabhängigen Knockout-Linien bezüglich dieses Gens umfassend untersucht. Es konnte dabei gezeigt werden, dass der dramatisch im Wachstum retardierte Phänotyp der Knockout-Pflanzen unter ambienten Wachstumsbedingungen mit einer enormen Veränderung des gesamten Stoffwechsels einhergeht. Detaillierte Metabolit-Analysen zeigten außerdem, dass die Deletion des AtER-ANT1 Gens besonders starke pleiotrope Effekte auf den Photorespirationsstoffwechsel hat. Diese Beobachtungen wurden durch Analysen der Knockout-Pflanzen unter hoch CO2-Bedingungen bestätigt. Die hoch CO2-Bedingungen bewirkten sowohl eine Verbesserung des gesamten Stoffwechsels als auch der morphologischen phänotypischen Erscheinung der Knockout-Pflanzen. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Redundanz verschiedener AACIsoformen in Arabidopsis thaliana, die auf biochemischer Ebene sehr ähnliche Eigenschaften besitzen. Knockout-Analysen zeigten, dass AtAAC1 für den pflanzlichen Stoffwechsel essentiell ist, da das Ausschalten eine Letalität der Pflanzen hervorruft. Für AtAAC2 und AtAAC3 kann dahingegen eine physiologische Bedeutung in späten Entwicklungsstadien der Pflanze angenommen werden. Neben der Charakterisierung pflanzlicher Transportproteine wurde zudem ein mitosomaler Adeninnukleotid-Transporter aus dem Protisten Entamoeba histolytica biochemisch unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems charakterisiert. Die Analysen ergaben, dass es sich bei diesem Adeninnukleotid-Transporter um ein zu den klassischen mitochondrialen AACs alternatives Transportprotein handelt, das sich sowohl im Substratspektrum als auch in Inhibitorstudien von bereits charakterisierten mitochondrialen und hydrogenosomalen ATP/ADP-Transportern unterscheidet. Mitosomen benötigen Energie u.a. zur Bildung von Fe-S-Clustern. Da diese Organellform im Gegensatz zu Mitochondrien und Hydrogenosomen nicht zu einer ATP-Synthese fähig sind, indizieren die ermittelten Daten eine physiologische Funktion dieses Proteins in der Versorgung der Mitosomen mit ATP

The role of mitogen-activated protein (MAP) kinase signalling components and the Ste12 transcription factor in germination and pathogenicity of Botrytis cinerea

In all fungi studied so far, mitogen-activated protein (MAP) kinase cascades serve as central signalling complexes that are involved in various aspects of growth, stress response and infection. In this work, putative components of the yeast Fus3/Kss1-type MAP kinase cascade and the putative downstream transcription factor Ste12 were analysed in the grey mould fungus Botrytis cinerea. Deletion mutants of the MAP triple kinase Ste11, the MAP kinase kinase Ste7 and the MAP kinase adaptor protein Ste50 all resulted in phenotypes similar to that of the previously described BMP1 MAP kinase mutant, namely defects in germination, delayed vegetative growth, reduced size of conidia, lack of sclerotia formation and loss of pathogenicity. Mutants lacking Ste12 showed normal germination, but delayed infection as a result of low penetration efficiency. Two differently spliced ste12 transcripts were detected, and both were able to complement the ste12 mutant, except for a defect in sclerotium formation, which was only corrected by the full-sized transcript. Overexpression of the smaller ste12 transcript resulted in delayed germination and strongly reduced infection. Bc-Gas2, a homologue of Magnaporthe grisea Gas2 that is required for appressorial function, was found to be non-essential for growth and infection, but its expression was under the control of both Bmp1 and Ste12. In summary, the role and regulatory connections of the Fus3/Kss1-type MAP kinase cascade in B. cinerea revealed both common and unique properties compared with those of other plant pathogenic fungi, and provide evidence for a regulatory link between the BMP1 MAP kinase cascade and Ste12

Identification of a Novel Adenine Nucleotide Transporter in the Endoplasmic Reticulum of Arabidopsis[W]

Many metabolic reactions in the endoplasmic reticulum (ER) require high levels of energy in the form of ATP, which is important for cell viability. Here, we report on an adenine nucleotide transporter residing in the ER membranes of Arabidopsis thaliana (ER-ANT1). Functional integration of ER-ANT1 in the cytoplasmic membrane of intact Escherichia coli cells reveals a high specificity for an ATP/ADP antiport. Immunodetection in transgenic ER-ANT1-C-MYC-tag Arabidopsis plants and immunogold labeling of wild-type pollen grain tissue using a peptide-specific antiserum reveal the localization of this carrier in ER membranes. Transgenic ER-ANT1-promoter-β-glucuronidase Arabidopsis lines show high expression in ER-active tissues (i.e., pollen, seeds, root tips, apical meristems, or vascular bundles). Two independent ER-ANT1 Arabidopsis knockout lines indicate a high physiological relevance of ER-ANT1 for ATP transport into the plant ER (e.g., disruption of ER-ANT1 results in a drastic retardation of plant growth and impaired root and seed development). In these ER-ANT1 knockout lines, the expression levels of several genes encoding ER proteins that are dependent on a sufficient ATP supply (i.e., BiP [for luminal binding protein] chaperones, calreticulin chaperones, Ca2+-dependent protein kinase, and SEC61) are substantially decreased