Molekulare Determinanten der Kaliumkanalblockade durch die Substanz 293B und der Inaktivierung der a-Untereinheit KCNQ1 im kardialen IKs-Kanalkomplex

Das Chromanol 293B stellt die Leitsubstanz einer möglicherweise neuen Kategorie von Klasse­III­Antiarrhythmika dar. Im Herzen inhibiert es potent und spezifisch den Kaliumkanal I Ks , der an der Repolarisation der Membran bei Ablauf eines Aktionspotentials beteiligt ist. Er ist aus der Alpha­Untereinheit KCNQ1 und der Beta­Untereinheit MinK aufgebaut. Es bestehen deutliche biophysikalische Unterschiede zwischen den Strömen homomerer KCNQ1­ und heteromerer I Ks (KCNQ1/MinK)­Kanäle. Die Koexpression mit MinK verändert aber auch die Pharmakologie von KCNQ1. In der vorliegenden Arbeit trugen zwei unabhängige Lösungsansätze dazu bei, die Interaktion der beiden Untereinheiten molekular besser zu verstehen. Dabei wurden als Methoden die zielgerichtete Mutagenese, die Expression der Wild­Typ­Proteine und der Mutanten in Xenopus­Oozyten und deren elektrophysiologische Analyse angewendet. Im ersten Teil wurde die Bindungsstelle des I Ks ­Inhibitors 293B molekular identifiziert, während im zweiten Teil der Mechanismus der Inaktivierung der Alpha­Untereinheit KCNQ1 untersucht wurde. In den beiden Ansätzen wurde ausgenutzt, dass die zu KCNQ1 eng verwandten KCNQ2­ Kanäle weder sensitiv gegenüber 293B waren noch eine Inaktivierung zeigten. Die Expression von MinK­Mutanten, die alle veränderbaren Regionen des Proteins abdeckten, ergab, dass keine dieser Mutationen die Affinität des I Ks ­Kanals gegenüber 293B wesentlich beeinflusste. Das war erstaunlich, da homomere KCNQ1­Kanäle durch das Chromanol 293B um den Faktor 4­5 schwächer zu blockieren sind als I Ks ­Kanäle und da zusätzlich gezeigt wurde, dass sich auch das Ausmaß der Stereoselektivität von 293B und anderer verwandter I Ks ­Inhibitoren in Bezug auf KCNQ1 und I Ks stark unterscheidet. Es konnte aus den Ergebnissen indirekt vermutet werden, dass MinK offensichtlich auf allosterische Art die Affinität des Inhibitors erhöht. Um einen Hinweis auf die I Ks ­Spezifität des Blocks durch 293B auch innerhalb der KCNQ­ Familie zu erhalten, wurde zunächst die Inhibition der verwandten KCNQ2 und KCNQ3­Kanäle getestet, die sich als kaum signifikant erwies. In diesem Zusammenhang wurde auch ein neues Mitglied der KCNQ­Familie kloniert, KCNQ5, das schwach sensitiv gegen 293B war, nicht im Herzen vorkommt aber wahrscheinlich zusammen mit KCNQ2/KCNQ3 zum neurona­ len M­Strom beiträgt. Dies ergab Hinweise darauf, dass von anderen KCNQ­Kanälen differente Proteinsequenzen die hohe Sensitivität des KCNQ1­Kanals gegenüber 293B determinieren. Die Bindungsstelle an der Alpha­Untereinheit KCNQ1 wurde anschließend durch KCNQ1/KCNQ2­ Chimären auf die innere Porenregion eingegrenzt. Durch detaillierte Untersuchung mithilfe von Punktmutationen identifizierten wir Aminosäuren in der Transmembranregion S6 (I337) und der Porenschleife H5(V307), deren Austausch gegen die entsprechenden KCNQ2­ Aminosäuren die Affinität von 293B zu KCNQ1­ sowie zu I Ks ­Kanälen um den Faktor 4­20 herabsetzten. Durch Analogiemodellierung mithilfe der bekannten Kristallstruktur des KcsA­ Kaliumkanals konnte ein 3D­Modell der KCNQ1­Porenregion erstellt werden, aus dem sich ergab, dass die Seitenketten der Aminosäure Isoleucin 337 in das Lumen der inneren Pore gerichtet sind. Aus dem Modell konnte weiterhin das Phenylalanin 340 als in das Lumen gerichtet identifiziert werden. Dieses Ergebnis konnte durch weitere Mutagenese­Experimente evaluiert werden, aus denen hervorging, dass Veränderungen an dieser und benachbarten Positionen die Sensitivität sowohl von KCNQ1­ als auch von I Ks ­Kanälen gegenüber 293B um den Faktor 10­100 verminderten. Das 293B­Molekül konnte so in das Modell integriert werden, dass sich attraktive Interaktionen mit diesen beiden Resten (F340 und I337) ausbilden. Die innere Porenregion stellt auch für viele Inhibitoren anderer Kaliumkanäle eine wichtige Determinante für hohe Affinität dar. Die in H5 gelegene Aminosäure V307 schien nach dem Modell nicht an einer 293B­Interaktion direkt beteiligt zu sein. Es fiel aber bei der Charakterisierung auf, dass das veränderte Protein nicht mehr inaktivierte. Daher sollte ein Zusammenhang zwischen dem 293B­ Wirkmechanismus und der intrinsischen KCNQ1­Inaktivierung untersucht werden. Es wurden wiederum durch einen Chimärenansatz zunächst die Regionen identifiziert, die für eine KCNQ1­Inaktivierung notwendig sind. Anschließend wurde nach punktuellem Austausch von KCNQ1­Aminosäuren gegen analoge KCNQ2­Reste für eine weitere Position im Transmembransegment S5 (G272) ein Verlust der Inaktivierung festgestellt. Die zweite nicht­ inaktivierende Mutante G272C war Wild­Typ­gleich 293B­empfindlich, woraus sich vermuten ließ, dass die schwache Empfindlichkeit gegenüber 293B und der Verlust der Inaktivierung der KCNQ1­Mutante V307L nicht in Zusammenhang stehen. Die Ergebnisse machten aber molekular den Unterschied der KCNQ1­Inaktivierung zu den beiden klassischen Inaktivierungsarten von Kaliumkanälen, N­ und C­Typ, deutlich. Zuvor war dies nur anhand unterschiedlicher biophysikalischer Eigenschaften gezeigt worden. Das zuvor erstellte KCNQ1­ Modell unterstützte die Resultate, da sich in ihm die beiden Regionen S5 und die Porenhelix H5 etwa auf Höhe der beiden Aminosäuren V307 und G272 kreuzen, was eine Interaktion dieser Regionen suggeriert. Zudem ist bei der ein Long­QT­Syndrom verursachenden KCNQ1­Mutation L273F die mutierte Stelle unmittelbar neben dem Valinrest 307 lokalisiert. Diese besonders stark inaktivierende LQT1­Mutante erhielt auch unter der Einwirkung von MinK eine nachweisbare Inaktivierung aufrecht. Da die KCNQ1­Inaktivierung durch MinK­Koexpression normalerweise aufgehoben wird, spricht dies für eine pathophysiologische Relevanz der KCNQ1­Inaktivierung

Immune Modulating Topical S100A8/A9 Inhibits Growth of Pseudomonas aeruginosa and Mitigates Biofilm Infection in Chronic Wounds

Pseudomonas aeruginosa biofilm maintains and perturbs local host defense, hindering timely wound healing. Previously, we showed that P. aeruginosa suppressed S100A8/A9 of the murine innate host defense. We assessed the potential antimicrobial effect of S100A8/A9 on biofilm-infected wounds in a murine model and P. aeruginosa growth in vitro. Seventy-six mice, inflicted with a full-thickness burn wound were challenged subcutaneously (s.c.) by 106 colony-forming units (CFUs) of P. aeruginosa biofilm. Mice were subsequently randomized into two treatment groups, one group receiving recombinant murine S100A8/A9 and a group of vehicle controls (phosphate-buffered saline, PBS) all treated with s.c. injections daily for up to five days. Wounds were analyzed for quantitative bacteriology and contents of key inflammatory markers. Count of blood polymorphonuclear leukocytes was included. S100A8/A9-treatment ameliorated wound infection, as evaluated by quantitative bacteriology (p ≤ 0.05). In vitro, growth of P. aeruginosa was inhibited dose-dependently by S100A8/A9 in concentrations from 5 to 40 μg/mL, as determined by optical density-measurement (OD-measurement) and quantitative bacteriology. Treatment slightly augmented key inflammatory cytokine Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), but dampened interferon-γ (IFN-γ) levels and blood polymorphonuclear count. In conclusion, topical S100A8/A9 displays remarkable novel immune stimulatory and anti-infective properties in vivo and in vitro. Importantly, treatment by S100A8/A9 provides local infection control. Implications for a role as adjunctive treatment in healing of chronic biofilm-infected wounds are discussed

D-Branes and Bundles on Elliptic Fibrations

We study the D-brane spectrum on a two-parameter Calabi-Yau model. The analysis is based on different tools in distinct regions of the moduli space: wrapped brane configurations on elliptic fibrations near the large radius limit, and SCFT boundary states at the Gepner point. We develop an explicit correspondence between these two classes of objects, suggesting that boundary states are natural quantum generalizations of bundles. We also find interesting D-brane dynamics in deep stringy regimes. The most striking example is, perhaps, that nonsupersymmetric D6-D0 and D4-D2 large radius configurations become stable BPS states at the Gepner point.Comment: 22 page

Adjunctive dabigatran therapy improves outcome of experimental left-sided <i>Staphylococcus aureus</i> endocarditis

<div><p>Background</p><p><i>Staphylococcus aureus</i> is the most frequent and fatal cause of left-sided infective endocarditis (IE). New treatment strategies are needed to improve the outcome. <i>S</i>. <i>aureus</i> coagulase promotes clot and fibrin formation. We hypothesized that dabigatran, could reduce valve vegetations and inflammation in <i>S</i>. <i>aureus</i> IE.</p><p>Methods</p><p>We used a rat model of severe aortic valve <i>S</i>. <i>aureus</i> IE. All infected animals were randomized to receive adjunctive dabigatran (10 mg/kg b.i.d., <i>n</i> = 12) or saline (controls, <i>n</i> = 11) in combination with gentamicin. Valve vegetation size, bacterial load, cytokine, cell integrins expression and peripheral platelets and neutrophils were assessed 3 days post-infection.</p><p>Results</p><p>Adjunctive dabigatran treatment significantly reduced valve vegetation size compared to controls (p< 0.0001). A significant reduction of the bacterial load in aortic valves was seen in dabigatran group compared to controls (p = 0.02), as well as expression of key pro-inflammatory markers keratinocyte-derived chemokine, IL-6, ICAM-1, TIMP-1, L-selectin (p< 0.04). Moreover, the dabigatran group had a 2.5-fold increase of circulating platelets compared to controls and a higher expression of functional and activated platelets (CD62p⁺) unbound to neutrophils.</p><p>Conclusion</p><p>Adjunctive dabigatran reduced the vegetation size, bacterial load, and inflammation in experimental <i>S</i>. <i>aureus</i> IE.</p></div

Studying unquenching effects in QCD with Dyson-Schwinger equations

We summarise recent results on the properties of gluons, quarks and light mesons from the Green's functions approach to QCD. We discuss a self-consistent, infrared power law solution for the Schwinger-Dyson equations of the 1PI-Greens functions of Yang-Mills theory. The corresponding running coupling has a universal fixed point at zero momentum. Based on these analytical results a truncation scheme for the coupled system of Schwinger-Dyson equations for the propagators of QCD and the Bethe-Salpeter equation for light mesons has been formulated. We compare numerical results for charge eigenstate vector and pseudoscalar meson observables with corresponding lattice data. The effects of unquenching the system are found to be small but not negligible.Comment: 8 pages, 8 figures. Invited talk given by C.S.F. at the 'Workshop on computational hadron physics', Sept. 13 - 17, Nikosia, Cypru

Dynamics of a Staphylococcus aureus infective endocarditis simulation model

Infective endocarditis (IE) is a serious infection of the inner surface of heart, resulting from minor lesions in the endocardium. The damage induces a healing reaction, which leads to recruitment of fibrin and immune cells. This sterile healing vegetation can be colonized during temporary bacteremia, inducing IE. We have previously established a novel in vitro IE model using a simulated IE vegetation (IEV) model produced from whole venous blood, on which we achieved stable bacterial colonization after 24h. The bacteria were organized in biofilm aggregates and displayed increased tolerance towards antibiotics. In this current study, we aimed at further characterizing the time course of biofilm formation and the impact on antibiotic tolerance development. We found that a S. aureus reference strain, as well as three clinical IE isolates formed biofilms on the IEV after 6h. When treatment was initiated immediately after infection, the antibiotic effect was significantly higher than when treatment was started after the biofilm was allowed to mature. We could follow the biofilm development microscopically by visualizing growing bacterial aggregates on the IEV. The findings indicate that mature, antibiotic-tolerant biofilms can be formed in our model already after 6h, accelerating the screening for optimal treatment strategies for IE

Large volume behavior of Yang-Mills propagators

We summarize results on finite-volume effects in the propagators of Landau gauge Yang-Mills theory using Dyson-Schwinger equations on a 4-dimensional torus. We demonstrate explicitly how the solutions for the gluon and the ghost propagator tend towards their respective infinite volume forms in the corresponding limit. We discuss the relation of our solutions with results from lattice Monte-Carlo simulations.Comment: 7 pages, 2 figures, Presented by CF at the XXV International Symposium on Lattice Field Theory, July 30 - August 4 2007, Regensburg, German

Alles im grünen Bereich!

ALLES IM GRÜNEN BEREICH! Alles im grünen Bereich! / Miller, Leif (Rights reserved) ( -