A Unique Tryptophan C‐Prenyltransferase from the Kawaguchipeptin Biosynthetic Pathway

Acknowledgements This work was supported by funding of the Academy of Finland (259505), Helsinki University Research grant (490085) and ESCMID grant (4720572) to D.P.F., University of Pittsburgh Central Research Development Fund to X.L., Technology Strategy Board grant (131181) to W.H., M.J. and J.H.N. National Programme of Sustainability I of the Ministry of Education of the Czech Republic I grant (LO1416) to T.G.Peer reviewedPostprin

Cyanobactins : ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides produced by cyanobacteria

Ribosomal peptides are produced through the post-translational modification of precursor peptides. Cyanobactins are a family of ribosomal peptides produced by cyanobacteria. A great variety of cyclic peptides that can be assigned to the cyanobactin family have been described from cyanobacteria. In the biosynthesis, the precursor peptide is cleaved, N-to-C macrocyclized, and some amino acids are heterocyclized or prenylated. As a family, the cyanobactins possess cytotoxicity, multidrug-resistance reversing activity, anti-malarial, antimicrobial, and allelopathic activities. The aim of this study was to explore the distribution of cyanobactin pathways and determine the chemical diversity of the peptides they encode. Cyanobacterial strains were studied using a combination of bioinformatics, molecular biology, evolutionary biology, and structural chemistry. In this study, a PCR-based approach demonstrated that a gene, essential for cyanobactin biosynthesis, is common and sporadically distributed. It was found in 48 of 132 cyanobacterial strains studied. The product of a cyanobactin pathway in Anabaena sp. 90 was identified as a cyclic peptide, consisting only of proteinogenic amino acids and it was named anacyclamide. Diverse anacyclamides were identified from 27 strains of the genus Anabaena, consisting of 7-20 amino acids which were prenylated or geranylated in some strains. New cyanobactins were also found in 6 strains of the genus Microcystis based on the genetic similarity to an inactive cyanobactin gene cluster in M. aeruginosa NIES 843. These peptides, which were named piricyclamides, are similar to anacyclamides. Piricyclamides have 7 to 17 amino acids and like anacyclamides the only conserved amino acid is a single proline. Bioinformatic analysis of the cyanobactin pathway in 126 cyanobacterial genomes identified 31 cyanobactin gene clusters, demonstrating that cyanobactin pathways were widely distributed among all cyanobacteria. Surprisingly, two of the pathways identified in this study were shown to produce novel linear cyanobactins. These linear peptides of just 3 5 amino acids contain a cysteine derived thiazole and an N-terminus protected with a prenyl group and methylated C-terminus. The linear cyanobactins were named aeruginosamides B, C, and viridisamide A. Phylogenetic analyses subsequently showed that the cyanobactin pathway has a complex evolutionary history which differs from the evolutionary history of cyanobacteria. The cyanobactin family was originally defined as being cyclic peptides containing modified amino acids. In this study, altogether three types of cyanobactins were described, cyclic anacyclamides, piricyclamides, and the linear cyanobactins aeruginosamides and viridisamide A. This work broadened the cyanobactin definition to include unmodified cyclic peptides, and expanded the length variation of cyanobactins setting new upper and lower limits, 3 20, for the length of the peptides in the cyanobactin family. The definition of cyanobactin was further refined to include linear peptides with termini protected by prenylation and methylation. Overall, this study has shown that the cyanobactin pathway is common in cyanobacteria and able to produce a range of chemically diverse peptides.Bakteerit tuottavat erilaisia pieniä ribosomaalisia peptidejä, jotka on muokattu suuremmasta esipeptidistä. Syanobaktiinit ovat syanobakteerien tuottamia ribosomaalisia rengaspeptidejä, jotka sisältävät muokattuja aminohappoja. Syanobaktiinien on havaittu olevan soluille myrkyllisiä, antimikrobisia, lääkevastustuskykyä alentavia ja malariaa estäviä sekä niillä on havaittu myös olevan muiden eliöiden kasvuun vaikuttavia, allelopaattisia, ominaisuuksia. Tässä työssä selvitettiin syanobaktiinien biosynteesigeenien esiintymistä syanobakteereissa sekä syanobaktiinien kemiallisten rakenteiden monimuotoisuutta. Työssä tutkittiin syanobakteerikantoja yhdistelemällä bioinformatiikkaa, molekyylibiologiaa, evoluutiobiologiaa sekä kemiallista rakenneanalytiikkaa. Syanobaktiinien tuottamiseen tarvittavien geenien todettiin olevan yleisiä. Tutkituista 132 syanobakteerikannasta 48 löydettiin PCR-menetelmällä syanobaktiinien biosynteesille oleellinen patA-geeni. Anabaena sp. 90 -syanobakteerin genomissa on syanobaktiinien tuottamiseksi tarvittavat geenit. Geenien tuottama syanobaktiini löydettiin ja nimettiin anasyklamidiksi. Anasyklamideja löydettiin 27 Anabaena-kannasta. Anasyklamidit koostuvat 7 20 tavallisesta aminohaposta ja toisinaan jokin aminohappo on prenyloitu tai geranyloitu. Uusia syanobaktiineja löydettiin myös kuudesta Microcystis-kannasta Microcystis aeruginosa NIES 843 -kannan toimimattoman syanobaktiini geeniryhmän perusteella. Nämä syanobaktiinit nimettiin pirisyklamideiksi. Pirisyklamideissa on 7 17 aminohappoa, joista viimeinen on aina proliini, kuten anasyklamideissakin. Myös pirisyklamideissa on prenyloituja tai geranyloituja aminohappoja. Bioinformatiikan avulla löydettiin 126 syanobakteerigenomista 31 syanobaktiinien tuottamiseen tarvittavaa geeniryhmää. Näistä kahden havaittiin tuottavan lineaarisia 3 5 aminohaposta koostuvia syanobaktiineja. Löydetyissä lineaarisissa syanobaktiineissa on kysteiinistä muokattu heterosyklinen tiatsolirengas, prenyyliryhmällä suojattu aminopää sekä metyloitu karboksyylipää. Uudet lineaariset syanobaktiinit nimettiin aeruginosamidi B:ksi ja C:ksi sekä viridisamidi A:ksi. Tutkimuksen mukaan syanobaktiinien tuottamiseksi tarvittavat geeniryhmät ovat laajalle levinneitä syanobakteerien joukossa. Fylogeneettiset analyysit osoittivat, että syanobaktiineja tuottavien geenien evoluutio on monimutkainen ja se eroaa syanobakteerien evolutiivisesta historiasta. Aikaisemmin syanobaktiinit oli määritelty rengaspeptideiksi, joissa on muokattuja aminohappoja. Tässä työssä kuvattiin rengasmaiset anasyklamidit ja pirisyklamidit sekä lineaariset aeruginosamidit ja viridisamidi A. Työssä laajennettiin syanobaktiinien määritelmää käsittämään myös ainoastaan tavallisista, muokkaamattomista aminohapoista koostuvia rengaspeptidejä sekä asetettiin uudet ääripituudet syanobaktiineille (3 20). Syanobaktiinit määriteltiin nyt sisältämään myös lineaarisia peptidejä. Kaiken kaikkiaan työ osoitti, että syanobaktiinien tuottamiseksi tarvittavat geenit ovat yleisiä syanobakteereilla ja ne tuottavat suuren joukon erilaisia syanobaktiineja

Palladium- and Copper-Catalysed Reactions of Unsaturated Amines on Solid Support

Formation of carbon carbon bonds constitutes the basis of synthetic organic chemistry. The growing demand of safer and environmentally friendlier processes, combined with continuing need for more efficient and selective reactions, has given challenges to industrial and fundamental academic research. The objective of this thesis was to develop novel ways to perform important carbon carbon bond-forming reactions on solid support. Of special focus were palladium- and copper-catalysed reactions of unsaturated amines. Polymer-bound propargylamine and allylamine were arylated successfully by the palladium-catalysed Sonogashira and Heck reaction, respectively. Additionally, allenes were produced in the Crabbé homologation of polymer-bound propargylamine, where copper acetylide is acting as an intermediate. All of these reactions would give rise to biologically interesting molecules: 1,3-arylaminopropanes after hydrogenation of the Sonogashira and Heck products and nitrogen-containing allenes by the Crabbé reaction. By varying the aryl iodide in solution, a series of arylated propargylamines and allylamines were synthesised and isolated as their acetamides. From the polymer-bound propargylamine, various allene amides were obtained after N-acylation followed by the Crabbé reaction. It was also briefly explored if the arylation of propargylamine on solid-phase could be possible without expensive palladium via the Castro-Stephens reaction, using a polymer-bound copper acetylide and the aryl iodide in solution. However, attempts to perform the first Castro Stephens reaction on solid-phase failed. Free amines are problematic in the Sonogashira and Heck reactions, due to coordination with the palladium catalyst and nucleophilicity toward the allene in the Crabbé reaction. These incompatibilities were solved by using the resin linkers simultaneously as protecting groups for the amines: as carbamates in the Sonogashira and Heck reaction, and as N-acyltriazenes in the Crabbé reaction. For the Heck reaction, finding the right reaction conditions turned out to be particularly difficult, the additional challenges being the narrow temperature window and the need to avoid polyarylation. Nevertheless, a regioselective γ-arylation could be performed giving similar yields as in the Sonogashira studies. In summary, alternative methods to perform important carbon carbon bond-forming reactions on solid support were developed.Hiili-hiilisidoksia muodostavat reaktiot ovat koko synteettisen orgaanisen kemian perusta. Mahdollisimman tehokkaat ja selektiiviset reaktiot ovat tutkimuksen jatkuvana tavoitteena, mutta nykyään teollisuuden kehitystyössä, ja yhä useammin myös akateemisessa perustutkimuksessa, on huomioitava prosessin turvallisuus ja ympäristöystävällisyys. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli kehittää uusia kiintokantajamenetelmiä tärkeitä, hiili-hiilisidoksia muodostavia reaktioita varten, jolloin jokin reagoivista lähtöaineista kiinnitetään kovalentilla sidoksella kiinteälle polymeerihartsille muiden lähtöaineiden ollessa liuostilassa. Erityisenä mielenkiinnon kohteena olivat tyydyttymättömien amiinien palladium- ja kuparikatalysoidut reaktiot. Tutkimuksen tavoitteena oli polymeerihartsiin kiinnitetyn hiili-hiilikolmoissidoksen sisältävän propargyyliamiinin sekä vastaavan kaksoissidoksen sisältävän allyyliamiinin arylointi. Tämä onnistui suorittamalla aromaattisen renkaan kytkentä amiinin kolmois- tai kaksoissidokseen palladiumkatalysoidun Sonogashira- tai Heck-reaktion avulla. Lisäksi polymeeriin kiinnitetystä propargyyliamiinista muodostettiin Crabbé-reaktion avulla alleeni, jossa ovat kumuloituneet eli peräkkäiset kaksoissidokset. Crabbé-reaktiossa, samoin kuin Sonogashira-reaktiossa, esiintyy välituotteena lyhytikäinen kupariasetylidi, jossa kupariatomi on sitoutunut kolmoissidoksen hiiliatomiin. Näillä kaikilla reaktioilla on mahdollista tuottaa biologisesti mielenkiintoisia molekyylejä. Sonogashira- ja Heck-tuotteita vedyttämällä saadaan 1,3-aryyliaminopropaaneja Crabbé-reaktion tuottaessa typpipitoisia alleeneja. Aryyliaminopropaaniyksikkö esiintyy useassa tärkeässä lääkeainemolekyylissä. Alleenit ovat yleisesti tärkeitä ja monipuolisia synteesikemian välituotteita. Useita erilaisia, aryloituja propargyyli- ja allyyliamiineja valmistettiin Sonogashira- ja Heck-reaktiolla vaihtelemalla liuostilassa olevaa lähtöainetta, aryylijodidia. Tuotteista valmistettiin asetamidijohdokset, jotka ovat helposti eritettävissä ja puhdistettavissa. Polymeeriin kiinnitetystä propargyyliamiinista saatiin erilaisia alleeniamideja suorittamalla N-asylointi ennen Crabbé-reaktiota. Työssä tutkittiin myös lyhyesti, olisiko polymeeriin kiinnitetyn propargyyliamiinin arylointi mahdollista suorittaa Castro-Stephens-reaktion avulla. Tällöin kupariasetylidi kiintokantajalla reagoisi liuostilaisen aryylijodidin kanssa, mutta kalliin palladiumkatalyytin käyttö ei olisi tarpeen. Yritykset suorittaa ensimmäinen Castro-Stephens-reaktio kiintokantajalla eivät kuitenkaan onnistuneet. Vapaat amiinit ovat ongelmallisia lähtöaineita sekä Sonogashira- että Heck-reaktioissa, koska typpiatomi koordinoituu katalyytin palladiumatomiin muodostaen riittävän vahvan sidoksen estääkseen reaktion. Toisaalta vapaan amiinin typpiatomi hyökkää helposti alleenin kaksoissidoksen keskimmäiseen atomiin häiriten Crabbé-reaktiota. Nämä ongelmat ratkaistiin kiinnittämällä amiinit polymeeriin karbamaatteina Sonogashira- ja Heck-reaktioita varten sekä N-asyylitriatseeneina Crabbé-reaktioita varten. Näin kiinnityskohdan funktionaalinen ryhmä, eli ns. linkkeri, toimii samalla amiinin suojaryhmänä. Heck-reaktioissa oikeiden reaktio-olosuhteiden löytäminen osoittautui erityisen vaikeaksi, ja erityisenä lisähaasteena olivat reaktioiden kapea lämpötila-alue sekä helposti tapahtuva allyyliamiinin ylimääräinen arylointi. Tästä huolimatta aryloitujen tuotteiden saannot olivat samaa suuruusluokkaa käytettäessä sekä Heck- että Sonogashira-reaktiota. Yleisesti voidaan todeta, että työssä kehitettiin vaihtoehtoisia menetelmiä suorittaa tärkeitä hiili-hiilisidoksia muodostavia reaktioita kiintokantajalla

Natural Radiation in Mining

This brochure covers the main obligations set for mining in the legislation in Finland concerning radiation and nuclear energy. Mining companies are required to determine the exposure to natural radiation caused by mining, as well as the occurrence of any materials that are subject to licensing due to natural radionuclides. Varying levels of natural radionuclides, such as radionuclides of the uranium- and thorium-series, occur in all types of rocks and minerals. The decay of natural radionuclides emits ionizing radiation, which poses a detriment to health

Naturlig strålning inom gruvdrift

I denna broschyr beskrivs huvudpunkterna i strålnings- och kärnenergilagstiftningens krav på gruvdrift. Gruvbolagen ansvarar för att undersöka exponering för naturlig strålning orsakad av gruvdrift och förekomsten av eventuella strålande material som kräver tillstånd. Naturliga radioaktiva ämnen, såsom radionuklider i uran- och toriumserien, förekommer i alla sten- och mineralmaterial i varierande halter. När naturliga radioaktiva ämnen bryts ner uppstår joniserande strålning, som orsakar men för hälsan

Luonnonsäteily kaivostoiminnassa

Tässä esitteessä kerrotaan pääkohdat säteily- ja ydinenergialainsäädännön asettamista velvoitteista kaivostoiminnalle. Kaivosyhtiöiden vastuulla on selvittää kaivostoiminnasta aiheutuva luonnonsäteilyaltistus ja mahdollisten luvanvaraisten säteilevien materiaalien esiintyminen. Luonnon radioaktiivisia aineita, kuten uraani- ja toriumsarjan radionuklideja, esiintyy kaikissa kivi- ja mineraaliaineksissa vaihtelevina pitoisuuksina. Luonnon radioaktiivisten aineiden hajoamisesta syntyy ionisoivaa säteilyä, joka aiheuttaa terveyshaittaa

Cyanobactins-ribosomal cyclic peptides produced by cyanobacteria

Peer reviewe

Cyclic peptide production using a macrocyclase with enhanced substrate promiscuity and relaxed recognition determinants

This project was supported by grants from the ERC (no. 339367, MJ), BBSRC IBCatalyst (no. BB/M028526/1, MJ, WEH), BBSRC FoF (no. BB/M013669/1, MJ, WEH), IBioIC Exemplar (no. 2014-2-4, MJ, WEH), an AstraZeneca studentship (MJ, WEH, LT, KR), the Academy of Finland (no. 259505, DPF) and the SULSA leaders award (WEH). The authors like to thank the Aberdeen Proteomics Facility and the Aberdeen School of Natural and Computing Sciences MS Facility for LCMS analysis. Electronic supplementary information (ESI) available: Experimental section, Fig. S1–S60 and Tables S1–S3. See DOI: 10.1039/c7cc05913bPeer reviewedPublisher PD

Sphaerocyclamide, a prenylated cyanobactin from the cyanobacterium Sphaerospermopsis sp. LEGE 00249

Cyanobactins are a family of linear and cyclic peptides produced through the post-translational modification of short precursor peptides. A mass spectrometry-based screening of potential cyanobactin producers led to the discovery of a new prenylated member of this family of compounds, sphaerocyclamide (1), from Sphaerospermopsis sp. LEGE 00249. The sphaerocyclamide biosynthetic gene cluster (sph) encoding the novel macrocyclic prenylated cyanobactin, was sequenced. Heterologous expression of the sph gene cluster in Escherichia coli confirmed the connection between genomic and mass spectrometric data. Unambiguous establishment of the orientation and site of prenylation required the full structural elucidation of 1 using Nuclear Magnetic Resonance (NMR), which demonstrated that a forward prenylation occurred on the tyrosine residue. Compound 1 was tested in pharmacologically or ecologically relevant biological assays and revealed moderate antimicrobial activity towards the fouling bacterium Halomonas aquamarina CECT 5000.Peer reviewe