Caracterización del Factor de Elongación 2 de Trypanosoma cruzy

Fil: Simonetti, Leandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, ArgentinaTrypanosoma cruzi, parásito causante de la enfermedad de Chagas-Mazza, divergió tempranamente\ndel tronco común de los eucariotas, por lo que exhibe mecanismos atípicos en procesos muy\nconservados a lo largo de la evolución. Particularmente el proceso de transcripción ha sido muy\nestudiado, observándose diferencias como la ausencia de regulación pre-transcripcional,\ntranscripción policistrónica y el agregado de la región no traducidas 5? por trans-splicing. Estas\ndiferencias sugieren que la síntesis de proteínas podría también presentar características únicas; sin\nembargo el proceso de traducción en tripanosomátidos no ha sido estudiado en profundidad.\nEn trabajos previos del laboratorio demostramos que los ribosomas de tripanosomátidos son\nresistentes a tricosantina, una toxina proteica que inhibe la actividad de ribosomas eucariotas.\nAdemás construimos un mapa de densidades electrónicas del ribosoma 80S de T. cruzi, donde se\nobservaron características estructurales distintivas no encontradas en otros eucariotas. También\nencontramos particularidades en las secuencias y en los patrones de interacción de las proteínas que\nconforman el tallo ribosomal de T. cruzi, un complejo pentamérico esencial para la síntesis proteica\nya que, junto con otras proteínas ribosomales y ARNr, median la interacción de distintos factores de\ntraducción con el ribosoma, y controlan la actividad GTPasa de algunos de estos, entre ellos el\nFactor de Elongación 2 (EF2), responsable de la translocación del ribosoma durante la fase de\nelongación. Continuando con esta línea de trabajos es que decidimos abordar la caracterización del\nEF2 de T. cruzi (TcEF2).\nDebido a que existe una gran variabilidad genética dentro de la especie T. cruzi, esta ha sido subdividida\nen seis Unidades Discretas de Tipificación (UDT I-VI). Para evaluar la diversidad del\nTcEF2 en las distintas UDT, diseñamos primers a partir de las secuencias disponibles de la cepa CL\nBrener (UDT VI) y clonamos y secuenciamos el gen a partir de cepas pertenecientes a las demás\nUDT. A nivel de secuencias de ADN, si bien observamos una identidad mayor al 99% entre todas\nlas UDT, encontramos 35 variaciones. De estas, 29 corresponden a transiciones y sólo 7 a\ntransversiones únicamente de dos tipos (G?T y G?C). El 80% de las variantes afectan la tercera\nposición de los codones y no producen cambios en la secuencia aminoacídica, mientras que las\nrestantes generan 6 cambios no-sinónimos. En reconstrucciones filogenéticas, las UDT I y II forman\nlíneas independientes, mientras que las UDT III y IV, y las UDT V y VI, forman parte de sendos\nclados, acorde a los estudios existentes sobre la filogenia de T. cruzi.\nConstruimos un modelo de la estructura proteica del TcEF2 unida a GDP e ión Magnesio,\nbasándonos en el cristal de su ortólogo en Saccharomyces cerevisiae, con el que comparte una\nidentidad en su secuencia aminoacídica del 57,6%. En el modelo observamos los seis sub-dominios\nclásicos de los EF2 eucariotas, así como la conservación de diversos residuos con importancia\nfuncional: las cuatro hélices canónicas que forman el bolsillo GTPasa están conservadas, los\naminoácidos que estabilizan el GDP y el ión Magnesio, la Histidina que es diftamidada posttraduccionalmente\n(His703), una de las dos Treoninas fosforilables (Thr57), las dos Lisinas (Lys511 y Lys617), y 8 de las 11 Argininas metilables. Este modelo se utilizó además para simular el efecto\nde las variaciones observadas en las distintas UDT, sobre su estabilidad estructural. Los resultados\nmostraron un aumento en la estabilidad de todos los TcEF2, excepto para las UDT III y IV en donde\nuna Alanina en la posición 360 presenta un efecto altamente desestabilizante, si bien este efecto es\ndisminuido gracias a la introducción de otra Alanina, en posición 367.\nPara estudiar la similitud a nivel funcional entre el TcEF2 y otros EF2, realizamos ensayos de\ncomplementación en levaduras, utilizando la cepa de S. cerevisiae GB2, la cual es knock-out para el\nEF2 y contiene una copia del factor endógeno bajo un promotor inducible por galactosa. Además de\nutilizar el EF2 de S. cerevisiae (ScEF2) como control positivo, clonamos el factor de Mus musculus\n(MmEF2), como representante de un organismo mamífero. Al estudiar la velocidad de crecimiento\nde cultivos de levaduras en condiciones de co-expresión del TcEF2 con ScEF2, observamos una\naumento en los tiempos de duplicación, sugiriendo una posible inhibición competitiva. En los\nensayos de complementación realizados, ni el TcEF2 ni el MmEF2, rescataron el crecimiento en la\ncepa GB2. Sin embargo, no fue posible concluir ningún efecto del TcEF2, ya que al analizar los\nniveles de expresión por Western Blot, encontramos que los factores heterólogos eran producidos en\ncantidades menores comparados con el factor endógeno.\nPara salvar este obstáculo, utilizamos un sistema de complementación in vitro donde, el TcEF2\nrescató la traducción en polisomas de T. cruzi y de Rattus norvegicus. El TcEF2 tiene una similitud\na nivel de amioácidos del 75%, con R. norvegicus, M. musculus y Homo sapiens, sin embargo, los\nresiduos que contactan con los distintos componentes del ribosoma presentan una similitud del\n83%. Por su parte, los residuos de las proteínas ribosomales (L9, L12, S23, S30 y P0) que contactan\nel EF2, presentan una similitud del 96,1%, y los ARNr (28S y 18S), una identidad del 88,2%, entre\nlas de T. cruzi y las de los mamíferos estudiados.\nNuestros resultados sugieren que, pese a las diferencias entre los EF2 de T. cruzi y mamíferos, el\nTcEF2 podría reemplazar funcionalmente al factor de mamíferos, probablemente debido a la alta\nconservación de los residuos que participan formando puentes de Hidrógeno y enlaces hidrofóbicos\nentre el EF2 y el ribosoma

Synthesis of the unique angular tricyclic chromone structure proposed for aspergillitine, and its relationship with alkaloid TMC-120B

The synthesis of the tricyclic angular chromone structure originally assigned to aspergillitine is reported. The synthesis was achieved in 11 steps and 15% overall yield from 2,4-dihydroxypropiophenone, through the intermediacy of 2,3-dimethyl-7-hydroxychromen-4-one. Construction of the nitrogen-bearing heterocyclic ring entailed a Stille cross-coupling reaction with n-Bu3SnCH2CHCH2, followed by double bond isomerization, oximation of the chromone carbonyl, and a final microwave-assisted electrocyclization of the thus formed 6π-electron aza-triene system.Fil: Simonetti, Sebastián Osvaldo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Química Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Química Rosario; ArgentinaFil: Larghi, Enrique Leandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Química Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Química Rosario; ArgentinaFil: Bracca, Andrea Beatriz Juana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Química Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Química Rosario; ArgentinaFil: Kaufman, Teodoro Saul. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Química Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Química Rosario; Argentin

Identificação de alunos com altas capacidades: uma contribuição de indicadores neuropsicológicos

This paper presents some data on the convergence between psychometric intelligence measurements (IQ tests) and physiological signs of mental activity found in high ability adolescents. The research study focus on a small group of 15 subjects submitted to electric encephalograms, previously chosen from a larger group of 77 classmates on the basis of scores on the WISC-III IQ Test. The results suggest continuous predominance of Alpha waves for the gifted group (higher frequency percentile and higher amplitude) what was not observed in the group without any superior intellectual ability. Even taking into account methodological limitations, this study may contribute to the understanding of a relationship between the intellectual quotient (IQ) and alpha waves frequency and amplitude, as observed during performance on cognitive tasks. Such results may suggest a possibility to complement psychometric measures with encephalic registers in giftedness research studies.Este artigo apresenta alguns dados sobre a convergência entre medidas psicométricas de inteligência e indicadores fisiológicos da actividade mental em adolescentes com alta capacidade intelectual. Para o efeito o estudo considerou um pequeno grupo de 15 sujeitos, submetidos ao eletroencefalograma quantitativo, selecionados a partir de uma população de 77 colegas com base nos resultados na WISC-III. Os resultados obtidos sugerem que no grupo de superdotados foi contínua a predominância de alfa (percentil frequencial sempre superior e alta amplitude), situação esta que não se observou no grupo de alunos sem capacidade intelectual superior. Mesmo com algumas limitações metodológicas, este estudo permite contribuir para a afirmação de que existe uma relação entre o quociente intelectual, a frequência e a amplitude das ondas alfa observadas durante a realização de tarefas cognitivas. Estes resultados parecem sugerir a possibilidade de uso complementar de provas psicométricas e de registos encefálicos no estudo da sobredotação.Palavras-chave: Altas Habilidades. Psicometria. Neuropsicologia. Electroen-cefalograma

Observations of Giant Pulses from Pulsar PSR B0950+08 using LWA1

We report the detection of giant pulse emission from PSR B0950+08 in 24 hours of observations made at 39.4 MHz, with a bandwidth of 16 MHz, using the first station of the Long Wavelength Array, LWA1. We detected 119 giant pulses from PSR B0950+08 (at its dispersion measure), which we define as having SNRs at least 10 times larger than for the mean pulse in our data set. These 119 pulses are 0.035% of the total number of pulse periods in the 24 hours of observations. The rate of giant pulses is about 5.0 per hour. The cumulative distribution of pulse strength $S$ is a steep power law, $N(>S)\propto S^{-4.7}$, but much less steep than would be expected if we were observing the tail of a Gaussian distribution of normal pulses. We detected no other transient pulses in a dispersion measure range from 1 to 90 pc cm$^{-3}$, in the beam tracking PSR B0950+08. The giant pulses have a narrower temporal width than the mean pulse (17.8 ms, on average, vs. 30.5 ms). The pulse widths are consistent with a previously observed weak dependence on observing frequency, which may be indicative of a deviation from a Kolmogorov spectrum of electron density irregularities along the line of sight. The rate and strength of these giant pulses is less than has been observed at $\sim$100 MHz. Additionally, the mean (normal) pulse flux density we observed is less than at $\sim$100 MHz. These results suggest this pulsar is weaker and produces less frequent giant pulses at 39 MHz than at 100 MHz.Comment: 27 pages, 12 figures, typos correcte

Selective Blockade of Trypanosomatid Protein Synthesis by a Recombinant Antibody Anti-Trypanosoma cruzi P2β Protein

The ribosomal P proteins are located on the stalk of the ribosomal large subunit and play a critical role during the elongation step of protein synthesis. The single chain recombinant antibody C5 (scFv C5) directed against the C-terminal region of the Trypanosoma cruzi P2β protein (TcP2β) recognizes the conserved C-terminal end of all T. cruzi ribosomal P proteins. Although this region is highly conserved among different species, surface plasmon resonance analysis showed that the scFv C5 possesses very low affinity for the corresponding mammalian epitope, despite having only one single amino-acid change. Crystallographic analysis, in silico modelization and NMR assays support the analysis, increasing our understanding on the structural basis of epitope specificity. In vitro protein synthesis experiments showed that scFv C5 was able to specifically block translation by T. cruzi and Crithidia fasciculata ribosomes, but virtually had no effect on Rattus norvegicus ribosomes. Therefore, we used the scFv C5 coding sequence to make inducible intrabodies in Trypanosoma brucei. Transgenic parasites showed a strong decrease in their growth rate after induction. These results strengthen the importance of the P protein C terminal regions for ribosomal translation activity and suggest that trypanosomatid ribosomal P proteins could be a possible target for selective therapeutic agents that could be derived from structural analysis of the scFv C5 antibody paratope

Recombinant antibody against Trypanosoma cruzi from patients with chronic Chagas heart disease recognizes mammalian nervous system.

Background: To deeply understand the role of antibodies in the context of Trypanosoma cruzi infection, we decided to characterize A2R1, a parasite antibody selected from single-chain variable fragment (scFv) phage display libraries constructed from B cells of chronic Chagas heart disease patients. Methods: Immunoblot, ELISA, cytometry, immunofluorescence and immunohistochemical assays were used to characterize A2R1 reactivity. To identify the antibody target, we performed an immunoprecipitation and two-dimensional electrophoresis coupled to mass spectrometry and confirmed A2R1 specific interaction by producing the antigen in different expression systems. Based on these data, we carried out a comparative in silico analysis of the protein target_s orthologues, focusing mainly on post-translational modifications. Findings: A2R1 recognizes a parasite protein of ~50 kDa present in all life cycle stages of T. cruzi, as well as in other members of the kinetoplastid family, showing a defined immunofluorescence labeling pattern consistent with the cytoskeleton. A2R1 binds to tubulin, but this interaction relies on its post-translational modifications. Interestingly, this antibody also targets mammalian tubulin only present in brain, staining in and around cell bodies of the human peripheral and central nervous system. Interpretation: Our findings demonstrate for the first time the existence of a human antibody against T. cruzi tubulin capable of cross-reacting with a human neural protein. This work re-emphasizes the role of molecular mimicry between host and parasitic antigens in the development of pathological manifestations of T. cruzi infection

Panorama epidemiológico da Síndrome Respiratória Aguda Grave em crianças e adolescentes hospitalizados em unidades de referências do estado de Pernambuco / Epidemiological overview of Severe Acute Respiratory Syndrome in children and adolescents hospitalized in referral facilities in the state of Pernambuco

Objetivo: Avaliar e descrever sobre síndrome respiratória aguda grave em crianças e adolescentes hospitalizados em unidades de referência no município de Recife - Pernambuco. Métodos: Trata-se de um estudo descritivo, do tipo relato de experiência, no período da semana epidemiologia 19ª e 20ª do mês de maio de 2022 do Estado de Pernambuco. Relato de Experiência: Observamos que durante as semanas epidemiológicas 19ª e 20ª, houve um aumento do número de hospitalizações e alguns óbitos por SARS-CoV-2. A necessidade de um suporte ventilatório durante o mês de maio de 2022, e de especialista em tratamento de SARS-CoV-2. Considerações Finais: O estudo mostrou que as precações são necessárias para evitar a contaminação pela COVID-19, onde as nossas crianças menores de 05 anos não podem ser vacinadas contra o coronavírus e por este motivo, hoje as nossas unidades hospitalares de recife e região metropolitana estão em colapso