Functional characterization of AdcB and AdcC, two arrestin-related proteins of the social amoeba Dictyostelium discoideum

Les protéines de la membrane plasmique jouent un rôle fondamental dans la détection des informations véhiculées par le milieu extracellulaire et l’adaptation des cellules aux variations de l’environnement. Elles font l’objet d’une régulation fine qui permet de moduler leur présence à la membrane et de contrôler les voies de signalisation en aval. Dans ce contexte, les arrestines qui constituent une superfamille de protéines adaptatrices, se sont imposées comme des régulateurs clés depuis la découverte des β-arrestines et arrestines visuelles, spécifiques des eucaryotes supérieurs, et de leur rôle dans la régulation des récepteurs couplés aux protéines G hétéro-trimériques, jusqu’à l’identification plus récente de nouveaux membres apparentés, présents des mammifères jusqu’aux protistes, et partageant un rôle commun de régulation de cargos membranaires. Ce travail de thèse porte sur la caractérisation fonctionnelle de deux représentants du clan arrestine de l’amibe Dictyostelium discoideum, les protéines AdcB et AdcC. Ces deux protéines partagent une même organisation multimodulaire, spécifique aux Dictyostélides, qui associe au cœur arrestine, un domaine putatif C2 de type calcium-binding et deux modules SAMs, respectivement aux extrémités N- et C-terminales des protéines. Nous avons établi que ces domaines apportent des fonctions spécifiques à ces arrestines en leur conférant la capacité de lier des lipides anioniques in vitro en réponse au calcium à travers leur module C2, et de former des structures homo- et hétéro-oligomériques via leurs domaines SAMs. En dépit de ces similarités, AdcB et AdcC présentent un comportement différent in cellulo dans la mesure où seul AdcC transloque à la membrane plasmique en réponse à une élévation du calcium cytosolique, provoquée par la stimulation des cellules par les chimioattractants AMPc et acide folique ou le calcium lui-même. Ces résultats ont été complétés par une étude phénotypique des mutants invalidés pour ces arrestines et la recherche de partenaires qui ouvrent des pistes pour des études futures.Integral proteins of the plasma membrane play a major role in the detection of environmental cues and in the adaptation of cells to variations of their environment. Regulatory mechanisms modulate their presence at the cell surface and control the signaling cascades activated in response to their stimulation. In this context, members of the arrestin revealed to be key regulators, since the discovery of β- and visual arrestins and their well-described role in the regulation of G-protein coupled receptors in complex organisms, and the more recent identification of arrestin-related proteins, present from mammals to protists and sharing functions in membrane cargo trafficking. This work aims at the functional characterization of two arrestin-related proteins of the social amoeba Dictyostelium discoideum, the AdcB and AdcC proteins. These two members of the arrestin clan share a similar multimodular organization, specific to Dictyostelids, with a putative N-terminal calcium-binding type C2 domain and two C-terminal SAM domains surrounding the arrestin module. We showed that the C2 domain confers calcium-dependent binding properties to anionic lipids in vitro and that the SAM domains allow the self-association and hetero-interaction of the two proteins in complexes of high molecular weight. Despite these similarities, AdcB and AdcC harbor a distinct behavior in vivo as only AdcC translocates to the plasma membrane in response to an intracellular calcium rise triggered by the chemoattractants acid folic and cAMP or extracellular calcium. In parallel, a phenotypic characterization of adcB and adcC single or double null mutants and a search for partners were conducted, that open new avenues for future research on these adaptor proteins

Caractérisation fonctionnelle des protéines AdcB et AdcC, deux membres du clan arrestine de l'amibe sociale Dictyostelium discoideum

Integral proteins of the plasma membrane play a major role in the detection of environmental cues and in the adaptation of cells to variations of their environment. Regulatory mechanisms modulate their presence at the cell surface and control the signaling cascades activated in response to their stimulation. In this context, members of the arrestin revealed to be key regulators, since the discovery of β- and visual arrestins and their well-described role in the regulation of G-protein coupled receptors in complex organisms, and the more recent identification of arrestin-related proteins, present from mammals to protists and sharing functions in membrane cargo trafficking. This work aims at the functional characterization of two arrestin-related proteins of the social amoeba Dictyostelium discoideum, the AdcB and AdcC proteins. These two members of the arrestin clan share a similar multimodular organization, specific to Dictyostelids, with a putative N-terminal calcium-binding type C2 domain and two C-terminal SAM domains surrounding the arrestin module. We showed that the C2 domain confers calcium-dependent binding properties to anionic lipids in vitro and that the SAM domains allow the self-association and hetero-interaction of the two proteins in complexes of high molecular weight. Despite these similarities, AdcB and AdcC harbor a distinct behavior in vivo as only AdcC translocates to the plasma membrane in response to an intracellular calcium rise triggered by the chemoattractants acid folic and cAMP or extracellular calcium. In parallel, a phenotypic characterization of adcB and adcC single or double null mutants and a search for partners were conducted, that open new avenues for future research on these adaptor proteins.Les protéines de la membrane plasmique jouent un rôle fondamental dans la détection des informations véhiculées par le milieu extracellulaire et l’adaptation des cellules aux variations de l’environnement. Elles font l’objet d’une régulation fine qui permet de moduler leur présence à la membrane et de contrôler les voies de signalisation en aval. Dans ce contexte, les arrestines qui constituent une superfamille de protéines adaptatrices, se sont imposées comme des régulateurs clés depuis la découverte des β-arrestines et arrestines visuelles, spécifiques des eucaryotes supérieurs, et de leur rôle dans la régulation des récepteurs couplés aux protéines G hétéro-trimériques, jusqu’à l’identification plus récente de nouveaux membres apparentés, présents des mammifères jusqu’aux protistes, et partageant un rôle commun de régulation de cargos membranaires. Ce travail de thèse porte sur la caractérisation fonctionnelle de deux représentants du clan arrestine de l’amibe Dictyostelium discoideum, les protéines AdcB et AdcC. Ces deux protéines partagent une même organisation multimodulaire, spécifique aux Dictyostélides, qui associe au cœur arrestine, un domaine putatif C2 de type calcium-binding et deux modules SAMs, respectivement aux extrémités N- et C-terminales des protéines. Nous avons établi que ces domaines apportent des fonctions spécifiques à ces arrestines en leur conférant la capacité de lier des lipides anioniques in vitro en réponse au calcium à travers leur module C2, et de former des structures homo- et hétéro-oligomériques via leurs domaines SAMs. En dépit de ces similarités, AdcB et AdcC présentent un comportement différent in cellulo dans la mesure où seul AdcC transloque à la membrane plasmique en réponse à une élévation du calcium cytosolique, provoquée par la stimulation des cellules par les chimioattractants AMPc et acide folique ou le calcium lui-même. Ces résultats ont été complétés par une étude phénotypique des mutants invalidés pour ces arrestines et la recherche de partenaires qui ouvrent des pistes pour des études futures

Caractérisation fonctionnelle des protéines AdcB et AdcC, deux membres du clan arrestine de l'amibe sociale Dictyostelium discoideum

Integral proteins of the plasma membrane play a major role in the detection of environmental cues and in the adaptation of cells to variations of their environment. Regulatory mechanisms modulate their presence at the cell surface and control the signaling cascades activated in response to their stimulation. In this context, members of the arrestin revealed to be key regulators, since the discovery of β- and visual arrestins and their well-described role in the regulation of G-protein coupled receptors in complex organisms, and the more recent identification of arrestin-related proteins, present from mammals to protists and sharing functions in membrane cargo trafficking. This work aims at the functional characterization of two arrestin-related proteins of the social amoeba Dictyostelium discoideum, the AdcB and AdcC proteins. These two members of the arrestin clan share a similar multimodular organization, specific to Dictyostelids, with a putative N-terminal calcium-binding type C2 domain and two C-terminal SAM domains surrounding the arrestin module. We showed that the C2 domain confers calcium-dependent binding properties to anionic lipids in vitro and that the SAM domains allow the self-association and hetero-interaction of the two proteins in complexes of high molecular weight. Despite these similarities, AdcB and AdcC harbor a distinct behavior in vivo as only AdcC translocates to the plasma membrane in response to an intracellular calcium rise triggered by the chemoattractants acid folic and cAMP or extracellular calcium. In parallel, a phenotypic characterization of adcB and adcC single or double null mutants and a search for partners were conducted, that open new avenues for future research on these adaptor proteins.Les protéines de la membrane plasmique jouent un rôle fondamental dans la détection des informations véhiculées par le milieu extracellulaire et l’adaptation des cellules aux variations de l’environnement. Elles font l’objet d’une régulation fine qui permet de moduler leur présence à la membrane et de contrôler les voies de signalisation en aval. Dans ce contexte, les arrestines qui constituent une superfamille de protéines adaptatrices, se sont imposées comme des régulateurs clés depuis la découverte des β-arrestines et arrestines visuelles, spécifiques des eucaryotes supérieurs, et de leur rôle dans la régulation des récepteurs couplés aux protéines G hétéro-trimériques, jusqu’à l’identification plus récente de nouveaux membres apparentés, présents des mammifères jusqu’aux protistes, et partageant un rôle commun de régulation de cargos membranaires. Ce travail de thèse porte sur la caractérisation fonctionnelle de deux représentants du clan arrestine de l’amibe Dictyostelium discoideum, les protéines AdcB et AdcC. Ces deux protéines partagent une même organisation multimodulaire, spécifique aux Dictyostélides, qui associe au cœur arrestine, un domaine putatif C2 de type calcium-binding et deux modules SAMs, respectivement aux extrémités N- et C-terminales des protéines. Nous avons établi que ces domaines apportent des fonctions spécifiques à ces arrestines en leur conférant la capacité de lier des lipides anioniques in vitro en réponse au calcium à travers leur module C2, et de former des structures homo- et hétéro-oligomériques via leurs domaines SAMs. En dépit de ces similarités, AdcB et AdcC présentent un comportement différent in cellulo dans la mesure où seul AdcC transloque à la membrane plasmique en réponse à une élévation du calcium cytosolique, provoquée par la stimulation des cellules par les chimioattractants AMPc et acide folique ou le calcium lui-même. Ces résultats ont été complétés par une étude phénotypique des mutants invalidés pour ces arrestines et la recherche de partenaires qui ouvrent des pistes pour des études futures

Calcium influx mediates the chemoattractant-induced translocation of the arrestin-related protein AdcC in Dictyostelium

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Pycnosomes: Condensed Endosomal Structures Secreted by Dictyostelium Amoebae.

Dictyostelium discoideum has been used largely as a model organism to study the organization and function of the endocytic pathway. Here we describe dense structures present in D. discoideum endocytic compartments, which we named pycnosomes. Pycnosomes are constitutively secreted in the extracellular medium, from which they can be recovered by differential centrifugation. We identified the most abundant protein present in secreted pycnosomes, that we designated SctA. SctA defines a new family of proteins with four members in D. discoideum, and homologous proteins in other protists and eumetazoa. We developed a monoclonal antibody specific for SctA and used it to further characterize secreted and intracellular pycnosomes. Within cells, immunofluorescence as well as electron microscopy identified pycnosomes as SctA-enriched dense structures in the lumen of endocytic compartments. Pycnosomes are occasionally seen in continuity with intra-endosomal membranes, particularly in U18666A-treated cells where intraluminal budding is highly enhanced. While the exact nature, origin and cellular function of pycnosomes remain to be established, this study provides a first description of these structures as well as a characterization of reagents that can be used for further studies

Collective regulation of cell motility using an accurate density-sensing system

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Supplementary table and figures from Collective regulation of cell motility using an accurate density-sensing system

The capacity of living cells to sense their population density and to migrate accordingly is essential for the regulation of many physiological processes. However, the mechanisms used to achieve such functions are poorly known. Here, based on the analysis of multiple trajectories of vegetative <i>Dictyostelium discoideum</i> cells, we investigate such a system extensively. We show that the cells secrete a high-molecular-weight quorum-sensing factor (QSF) in their medium. This extracellular signal induces, in turn, a reduction of the cell movements, in particular, through the downregulation of a mode of motility with high persistence time. This response appears independent of cAMP and involves a G-protein-dependent pathway. Using a mathematical analysis of the cells' response function, we evidence a negative feedback on the QSF secretion, which unveils a powerful generic mechanism for the cells to detect when they exceed a density threshold. Altogether, our results provide a comprehensive and dynamical view of this system enabling cells in a scattered population to adapt their motion to their neighbours without physical contact

Intraendosomal membranes association with pycnosomes.

<p><i>D</i>. <i>discoideum</i> cells were treated for 2h with U18666A to induce the formation of intraluminal membranes in the endocytic compartments, then fixed and processed for electron microscopy. Pycnosomes (stars) often appeared continuous with internal membranes. Arrowheads point to regions where the continuity between pycnosomal material and endosomal membranes was most apparent. Bar: 500 nm.</p

Electron microscopy reveals SctA-enriched endosomal pycnosomes.

<p><i>D</i>. <i>discoideum</i> cells grown in axenic medium were processed for immuno-electron microscopy. (A-B) Sections were labeled with the H161 anti-p80 antibody. The p80 protein was abundantly present in endosomal membranes, and only small amounts of p80 were found associated with pycnosomes (stars) in the lumen. (C-D) The B4.2 antibody revealed a high concentration of SctA in endosomal pycnosomes. In some pictures, pycnosomes appeared associated with some membranous elements (arrowheads). Bar: 500 nm.</p