Herstellung autofluoreszierender retroviraler Partikel zur Analyse der zellulären Aufnahmemechanismen von Foamyviren

Foamyviren (FV) gehören zur Familie der Retroviridae, werden aber aufgrund besonderer Eigenschaften in eine eigene Unterfamilie, die Spumaretrovirinae, eingeordnet. FV besitzen vor allem in vitro einen sehr breiten Tropismus, so dass bisher keine Zelllinie bekannt war, die nicht durch FV infiziert werden konnte. Obwohl diese Besonderheit darauf schließen lässt, dass ein sehr ubiquitäres Molekül auf der Wirtszelloberfläche für die FV-Bindung verwendet wird, ist der Rezeptor für die Virus-Aufnahme noch nicht bekannt. Dass FV einen pH-abhängigen Aufnahmemechanismus verwenden, lässt eine endozytotische Aufnahme vermuten. Dennoch sind die frühen Replikationsschritte, die zur Fusion der viralen und Wirtszellmembran führen, nur unzureichend charakterisiert. Deswegen wurden in der vorliegenden Arbeit funktionelle autofluoreszierende FV hergestellt, um die Bindung und Aufnahmemechanismen foamyviraler Partikel in Wirtszellen mit fluoreszenzmikroskopischen Analysen zu untersuchen. Mit diesen Methoden konnten erstmalig vier Zelllinien identifiziert werden, die nicht mit FV infizierbar sind, und damit mögliche Kandidaten für die Identifizierung des unbekannten FV Rezeptors darstellen. Des Weiteren wurden die fluoreszierenden FV erfolgreich eingesetzt, um die Fusionsereignisse zwischen viraler und zellulärer Membran in Echtzeit in lebenden Zellen zu untersuchen. Die durchgeführte „Single Virus Tracking“-Analyse zeigte, dass PFV (Prototype FV) Env-tragende Partikel sowohl an der Plasmamembran als auch in vermeintlichen Endosomen fusionieren können, wohingegen SFV (Simian FV) Env-tragende Partikel die Fusion wahrscheinlich nur in Endosomen auslösen können. Hinweis zur Nutzung der Filmdateien: Öffnen mit QuickTimePlayer bzw. Image

Differential pH-dependent cellular uptake pathways among foamy viruses elucidated using dual-colored fluorescent particles

Background: It is thought that foamy viruses (FVs) enter host cells via endocytosis because all FV glycoproteins examined display pH-dependent fusion activities. Only the prototype FV (PFV) glycoprotein has also significant fusion activity at neutral pH, suggesting that its uptake mechanism may deviate from other FVs. To gain new insights into the uptake processes of FV in individual live host cells, we developed fluorescently labeled infectious FVs. Results: N-terminal tagging of the FV envelope leader peptide domain with a fluorescent protein resulted in efficient incorporation of the fluorescently labeled glycoprotein into secreted virions without interfering with their infectivity. Double-tagged viruses consisting of an eGFP-tagged PFV capsid (Gag-eGFP) and mCherry-tagged Env (Ch-Env) from either PFV or macaque simian FV (SFVmac) were observed during early stages of the infection pathway. PFV Env, but not SFVmac Env, containing particles induced strong syncytia formation on target cells. Both virus types showed trafficking of double-tagged virions towards the cell center. Upon fusion and subsequent capsid release into the cytosol, accumulation of naked capsid proteins was observed within four hours in the perinuclear region, presumably representing the centrosomes. Interestingly, virions harboring fusion-defective glycoproteins still promoted virus attachment and uptake, but failed to show syncytia formation and perinuclear capsid accumulation. Non-fused or non-fusogenic viruses are rapidly cleared from the cells by putative lysosomal degradation. Monitoring the fraction of viruses containing both Env and capsid signals as a function of time demonstrated that PFV virions fused within the first few minutes, whereas fusion of SFVmac virions was less pronounced and observed over the entire 90 minutes measured. Conclusions: The characterized double-labeled FVs described here provide new mechanistic insights into FV early entry steps, demonstrating that productive viral fusion occurs early after target cell attachment and uptake. The analysis highlights apparent differences in the uptake pathways of individual FV species. Furthermore, the infectious double-labeled FVs promise to provide important tools for future detailed analyses on individual FV fusion events in real time using advanced imaging techniques

Analysis of Prototype Foamy Virus particle-host cell interaction with autofluorescent retroviral particles

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The foamy virus (FV) replication cycle displays several unique features, which set them apart from orthoretroviruses. First, like other B/D type orthoretroviruses, FV capsids preassemble at the centrosome, but more similar to hepadnaviruses, FV budding is strictly dependent on cognate viral glycoprotein coexpression. Second, the unusually broad host range of FV is thought to be due to use of a very common entry receptor present on host cell plasma membranes, because all cell lines tested in vitro so far are permissive.</p> <p>Results</p> <p>In order to take advantage of modern fluorescent microscopy techniques to study FV replication, we have created FV Gag proteins bearing a variety of protein tags and evaluated these for their ability to support various steps of FV replication. Addition of even small N-terminal HA-tags to FV Gag severely impaired FV particle release. For example, release was completely abrogated by an N-terminal autofluorescent protein (AFP) fusion, despite apparently normal intracellular capsid assembly. In contrast, C-terminal Gag-tags had only minor effects on particle assembly, egress and particle morphogenesis. The infectivity of C-terminal capsid-tagged FV vector particles was reduced up to 100-fold in comparison to wild type; however, infectivity was rescued by coexpression of wild type Gag and assembly of mixed particles. Specific dose-dependent binding of fluorescent FV particles to target cells was demonstrated in an Env-dependent manner, but not binding to target cell-extracted- or synthetic- lipids. Screening of target cells of various origins resulted in the identification of two cell lines, a human erythroid precursor- and a zebrafish- cell line, resistant to FV Env-mediated FV- and HIV-vector transduction.</p> <p>Conclusions</p> <p>We have established functional, autofluorescent foamy viral particles as a valuable new tool to study FV - host cell interactions using modern fluorescent imaging techniques. Furthermore, we succeeded for the first time in identifying two cell lines resistant to Prototype Foamy Virus Env-mediated gene transfer. Interestingly, both cell lines still displayed FV Env-dependent attachment of fluorescent retroviral particles, implying a post-binding block potentially due to lack of putative FV entry cofactors. These cell lines might ultimately lead to the identification of the currently unknown ubiquitous cellular entry receptor(s) of FVs.</p

Herstellung autofluoreszierender retroviraler Partikel zur Analyse der zellulären Aufnahmemechanismen von Foamyviren

Foamyviren (FV) gehören zur Familie der Retroviridae, werden aber aufgrund besonderer Eigenschaften in eine eigene Unterfamilie, die Spumaretrovirinae, eingeordnet. FV besitzen vor allem in vitro einen sehr breiten Tropismus, so dass bisher keine Zelllinie bekannt war, die nicht durch FV infiziert werden konnte. Obwohl diese Besonderheit darauf schließen lässt, dass ein sehr ubiquitäres Molekül auf der Wirtszelloberfläche für die FV-Bindung verwendet wird, ist der Rezeptor für die Virus-Aufnahme noch nicht bekannt. Dass FV einen pH-abhängigen Aufnahmemechanismus verwenden, lässt eine endozytotische Aufnahme vermuten. Dennoch sind die frühen Replikationsschritte, die zur Fusion der viralen und Wirtszellmembran führen, nur unzureichend charakterisiert. Deswegen wurden in der vorliegenden Arbeit funktionelle autofluoreszierende FV hergestellt, um die Bindung und Aufnahmemechanismen foamyviraler Partikel in Wirtszellen mit fluoreszenzmikroskopischen Analysen zu untersuchen. Mit diesen Methoden konnten erstmalig vier Zelllinien identifiziert werden, die nicht mit FV infizierbar sind, und damit mögliche Kandidaten für die Identifizierung des unbekannten FV Rezeptors darstellen. Des Weiteren wurden die fluoreszierenden FV erfolgreich eingesetzt, um die Fusionsereignisse zwischen viraler und zellulärer Membran in Echtzeit in lebenden Zellen zu untersuchen. Die durchgeführte „Single Virus Tracking“-Analyse zeigte, dass PFV (Prototype FV) Env-tragende Partikel sowohl an der Plasmamembran als auch in vermeintlichen Endosomen fusionieren können, wohingegen SFV (Simian FV) Env-tragende Partikel die Fusion wahrscheinlich nur in Endosomen auslösen können. Hinweis zur Nutzung der Filmdateien: Öffnen mit QuickTimePlayer bzw. Image

Herstellung autofluoreszierender retroviraler Partikel zur Analyse der zellulären Aufnahmemechanismen von Foamyviren

Foamyviren (FV) gehören zur Familie der Retroviridae, werden aber aufgrund besonderer Eigenschaften in eine eigene Unterfamilie, die Spumaretrovirinae, eingeordnet. FV besitzen vor allem in vitro einen sehr breiten Tropismus, so dass bisher keine Zelllinie bekannt war, die nicht durch FV infiziert werden konnte. Obwohl diese Besonderheit darauf schließen lässt, dass ein sehr ubiquitäres Molekül auf der Wirtszelloberfläche für die FV-Bindung verwendet wird, ist der Rezeptor für die Virus-Aufnahme noch nicht bekannt. Dass FV einen pH-abhängigen Aufnahmemechanismus verwenden, lässt eine endozytotische Aufnahme vermuten. Dennoch sind die frühen Replikationsschritte, die zur Fusion der viralen und Wirtszellmembran führen, nur unzureichend charakterisiert. Deswegen wurden in der vorliegenden Arbeit funktionelle autofluoreszierende FV hergestellt, um die Bindung und Aufnahmemechanismen foamyviraler Partikel in Wirtszellen mit fluoreszenzmikroskopischen Analysen zu untersuchen. Mit diesen Methoden konnten erstmalig vier Zelllinien identifiziert werden, die nicht mit FV infizierbar sind, und damit mögliche Kandidaten für die Identifizierung des unbekannten FV Rezeptors darstellen. Des Weiteren wurden die fluoreszierenden FV erfolgreich eingesetzt, um die Fusionsereignisse zwischen viraler und zellulärer Membran in Echtzeit in lebenden Zellen zu untersuchen. Die durchgeführte „Single Virus Tracking“-Analyse zeigte, dass PFV (Prototype FV) Env-tragende Partikel sowohl an der Plasmamembran als auch in vermeintlichen Endosomen fusionieren können, wohingegen SFV (Simian FV) Env-tragende Partikel die Fusion wahrscheinlich nur in Endosomen auslösen können. Hinweis zur Nutzung der Filmdateien: Öffnen mit QuickTimePlayer bzw. Image

Novel Functions of Prototype Foamy Virus Gag Glycine- Arginine-Rich Boxes in Reverse Transcription and Particle Morphogenesis▿

Prototype foamy virus (PFV) Gag lacks the characteristic orthoretroviral Cys-His motifs that are essential for various steps of the orthoretroviral replication cycle, such as RNA packaging, reverse transcription, infectivity, integration, and viral assembly. Instead, it contains three glycine-arginine-rich boxes (GR boxes) in its C terminus that putatively represent a functional equivalent. We used a four-plasmid replication-deficient PFV vector system, with uncoupled RNA genome packaging and structural protein translation, to analyze the effects of deletion and various substitution mutations within each GR box on particle release, particle-associated protein composition, RNA packaging, DNA content, infectivity, particle morphology, and intracellular localization. The degree of viral particle release by all mutants was similar to that of the wild type. Only minimal effects on Pol encapsidation, exogenous reverse transcriptase (RT) activity, and genomic viral RNA packaging were observed. In contrast, particle-associated DNA content and infectivity were drastically reduced for all deletion mutants and were undetectable for all alanine substitution mutants. Furthermore, GR box I mutants had significant changes in particle morphology, and GR box II mutants lacked the typical nuclear localization pattern of PFV Gag. Finally, it could be shown that GR boxes I and III, but not GR box II, can functionally complement each other. It therefore appears that, similar to the orthoretroviral Cys-His motifs, the PFV Gag GR boxes are important for RNA encapsidation, genome reverse transcription, and virion infectivity as well as for particle morphogenesis

Identification of an Intermediate Step in Foamy Virus Fusion

International audienceViral glycoprotein-mediated membrane fusion is an essential step for productive infection of host cells by enveloped viruses; however, due to its rarity and challenges in detection, little is known about the details of fusion events at the single particle level. Here, we have developed dual-color foamy viruses (FVs) composed of eGFP-tagged prototype FV (PFV) Gag and mCherry-tagged Env of either PFV or macaque simian FV (SFVmac) origin that have been optimized for detection of the fusion process. Using our recently developed tracking imaging correlation (TrIC) analysis, we were able to detect the fusion process for both PFV and SFVmac Env containing virions. PFV Env-mediated fusion was observed both at the plasma membrane as well as from endosomes, whereas SFVmac Env-mediated fusion was only observed from endosomes. PFV Env-mediated fusion was observed to happen more often and more rapidly than as for SFVmac Env. Strikingly, using the TrIC method, we detected a novel intermediate state where the envelope and capsids are still tethered but separated by up to 400 nm before final separation of Env and Gag occurre