Herstellung und Charakterisierung tetraetherlipidhaltiger Lipoplexe und Lipopolyplexe als neuartige Vehikel für die orale Gentherapie

Die Gentherapie bietet ein großes Potential für die Behandlung von schweren chronischen Erkrankungen wie z.B. Krebs oder Erbkrankheiten. Hierbei werden nicht nur die Symptome der Krankheiten behandelt, sondern man versucht defekte Gene zu ersetzen. Mit sogenannten Genvektoren (viral oder nicht-viral) werden dabei Gene in menschliche Zellen eingeschleust. Ein Genvektor muss nicht nur eine hohe Transfektionseffizienz besitzen, sondern auch eine geringe Toxizität und hohe Patientencompliance aufweisen. Ein Gentherapeutikum zur oralen Anwendung, das eine hohe Stabilität gegenüber dem sauren pH-Wert im Magen hat, würde diese Kriterien am besten erfüllen. Ein vielversprechender Ansatz, um Genvektoren herzustellen, die in sauren pH-Werten stabil bleiben, stellt die Nutzung von Tetraetherlipiden der Archaeen dar. Archaeen bilden neben den Bakterien und Eukaryoten eine der drei Domänen zellulärer Lebewesen. Sie sind an extreme Milieubedingungen angepasst, z.B. wachsen sie bevorzugt bei +80 °C (hyperthermophil), in stark konzentrierten Salzlösungen (halophil) oder bei niedrigen pH-Werten (acidophil). Der Grund für diese außergewöhnliche Stabilität liegt darin, dass die Zellmembran der Archaeen aus Tetraetherlipiden aufgebaut ist. Im Gegensatz zu eukaryotischen Membranlipiden besitzen Tetraetherlipide keine Ester- sondern Etherbindungen. Des Weiteren durchspannen Tetraetherlipide die Membran vollständig und ordnen sich nicht zu einer Doppelmembran an. In der vorliegenden Arbeit wurden Tetraetherlipide aus den gefriergetrockneten Biomassen von Archaeen mittels Soxhlet-Extraktion extrahiert. Eine darauffolgende Aufreinigung fand an einer Kieselgelsäule statt. Die extrahierten Lipidfraktionen beschränkten sich auf TEL (Rohlipide), PLFE (polare Lipidfraktion E), hGDNT (hydrolysiertes Glycerol-Di-Alkyl-Nonitol-Tetraetherlipid) und hGDGT (hydrolysiertes Glycerol-Di-Glycerol-Tetraetherlipid). Zudem wurde ein neuartiges Tetraetherlipid (MI-0907) mit positiv geladener Kopfgruppe synthetisiert. Alle fünf Tetraetherlipide erhielt man als dunkelbraune bzw. hellgelbe waxartige Massen mit Ausbeuten von 1,9 - 46,89 % (bezogen auf die Ausgangsmasse). Für die Herstellung von Liposomen wurden Tetraetherlipide und konventionelle Lipide wie z.B. DPPC (1,2-Di-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin), CH (Cholesterol) oder DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammoniumpropan) in verschiedenen molaren Verhältnissen in einem organischen Lösungsmittel miteinander gemischt. Durch Verdampfung des ii Lösungsmittels bildete sich ein dünner Lipidfilm, der durch Zugabe einer wässrigen Pufferlösung in eine liposomale Suspension überführt wurde. Die so hergestellten Liposomen zeigten Durchmesser von 101 - 351 nm und PDI-Werte von 0,2 - 0,4. Liposomen mit günstigen Parametern bzgl. Größe und PDI-Wert stellten die Formulierungen hGDNT/DPPC/DOTAP (20/55/25 mol/mol/mol), MI-0907/DPPC/CH (20/55/25 mol/mol/mol) und hGDNT/DPPC/CH (20/55/25 mol/mol/mol) dar. Sie wurden in weiteren Experimenten in Pufferlösungen mit pH-Werten von 2 - 9 inkubiert und bzgl. der Änderung des Durchmessers nach einem Scoring System (--- bis +++) bewertet. Die oben genannten Formulierungen zeigten minimale Veränderungen bzgl. der Durchmesser und PDI-Werte. Die Komplexierung der positiv geladenen Formulierungen mit pDNA führte zu Lipoplexen, die ebenfalls eine hohe Stabilität bei pH-Werten von 2 - 9 zeigten. Die Transfektionseffizienzen der Formulierungen lagen ca. 30 - 40 % unter den Referenzsubstanzen (25kDa-bPEI oder DOTAP). Zur Verbesserung der Transfektionseffizienzen, bildete man Komposite aus Liposomen, Polymer und pDNA, sogenannte Lipopolyplexe. Als Liposomen wurden die oben genannten Formulierungen eingesetzt. Die Transfektionseffizienz lag bei Lipopolyplexen bis zu 50 % über den Referenzsubstanzen. Zudem wiesen Lipopolyplexe in Toxizitätsversuchen wie z.B. LDH-Assay eine um ca. 75 % reduzierte Toxizität im Vergleich zu einfachen Polyplexen auf. Die besondere Stabilität der tetraetherlipidhaltigen Lipopolyplexe wurde in einem Heparin-Assay ermittelt, wobei der Stabilitätseffekt deutlich höher war als für einfache Polyplexe. Die morphologischen Besonderheiten von Lipoplexen konnte mittels Rasterkraftmikroskopie untersucht werden. Hierbei war zu erkennen, dass sich pDNA um Liposomen windet und der Aufbau multilamellar erfolgt, d.h. mehrere Lipidschichten sind übereinander angeordnet und bilden einen „zwiebelartigen“ Aufbau der Komplexe. Bei Lipopolyplexen, die Durchmesser von 138 nm bis 156 nm annehmen, ist ein Polyplexkern von einer ca. 4 nm dicken Lipidschicht ummantelt. Die erfolgreiche Extraktion und Aufreinigung von Tetraetherlipiden aus Archaeen, ist für die Herstellung von Genvektoren eine wichtige Grundlage. Qualitätsbestimmende Kriterien der gewonnenen Lipoplexe und Lipopolyplexe wie reduzierte Toxizität, Stabilität im sauren pH-Milieu und erhöhte Transfektionseffizienz legen nahe, dass sich Genvektoren auf der Basis von Tetraetherlipiden der Archaeen für die orale Gentherapie eignen sollten

Genetic effects on gene expression across human tissues

Characterization of the molecular function of the human genome and its variation across individuals is essential for identifying the cellular mechanisms that underlie human genetic traits and diseases. The Genotype-Tissue Expression (GTEx) project aims to characterize variation in gene expression levels across individuals and diverse tissues of the human body, many of which are not easily accessible. Here we describe genetic effects on gene expression levels across 44 human tissues. We find that local genetic variation affects gene expression levels for the majority of genes, and we further identify inter-chromosomal genetic effects for 93 genes and 112 loci. On the basis of the identified genetic effects, we characterize patterns of tissue specificity, compare local and distal effects, and evaluate the functional properties of the genetic effects. We also demonstrate that multi-tissue, multi-individual data can be used to identify genes and pathways affected by human disease-associated variation, enabling a mechanistic interpretation of gene regulation and the genetic basis of diseas

Status Update and Interim Results from the Asymptomatic Carotid Surgery Trial-2 (ACST-2)

Objectives: ACST-2 is currently the largest trial ever conducted to compare carotid artery stenting (CAS) with carotid endarterectomy (CEA) in patients with severe asymptomatic carotid stenosis requiring revascularization. Methods: Patients are entered into ACST-2 when revascularization is felt to be clearly indicated, when CEA and CAS are both possible, but where there is substantial uncertainty as to which is most appropriate. Trial surgeons and interventionalists are expected to use their usual techniques and CE-approved devices. We report baseline characteristics and blinded combined interim results for 30-day mortality and major morbidity for 986 patients in the ongoing trial up to September 2012. Results: A total of 986 patients (687 men, 299 women), mean age 68.7 years (SD ± 8.1) were randomized equally to CEA or CAS. Most (96%) had ipsilateral stenosis of 70-99% (median 80%) with contralateral stenoses of 50-99% in 30% and contralateral occlusion in 8%. Patients were on appropriate medical treatment. For 691 patients undergoing intervention with at least 1-month follow-up and Rankin scoring at 6 months for any stroke, the overall serious cardiovascular event rate of periprocedural (within 30 days) disabling stroke, fatal myocardial infarction, and death at 30 days was 1.0%. Conclusions: Early ACST-2 results suggest contemporary carotid intervention for asymptomatic stenosis has a low risk of serious morbidity and mortality, on par with other recent trials. The trial continues to recruit, to monitor periprocedural events and all types of stroke, aiming to randomize up to 5,000 patients to determine any differential outcomes between interventions. Clinical trial: ISRCTN21144362. © 2013 European Society for Vascular Surgery. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved

Second asymptomatic carotid surgery trial (ACST-2): a randomised comparison of carotid artery stenting versus carotid endarterectomy

Background: Among asymptomatic patients with severe carotid artery stenosis but no recent stroke or transient cerebral ischaemia, either carotid artery stenting (CAS) or carotid endarterectomy (CEA) can restore patency and reduce long-term stroke risks. However, from recent national registry data, each option causes about 1% procedural risk of disabling stroke or death. Comparison of their long-term protective effects requires large-scale randomised evidence. Methods: ACST-2 is an international multicentre randomised trial of CAS versus CEA among asymptomatic patients with severe stenosis thought to require intervention, interpreted with all other relevant trials. Patients were eligible if they had severe unilateral or bilateral carotid artery stenosis and both doctor and patient agreed that a carotid procedure should be undertaken, but they were substantially uncertain which one to choose. Patients were randomly allocated to CAS or CEA and followed up at 1 month and then annually, for a mean 5 years. Procedural events were those within 30 days of the intervention. Intention-to-treat analyses are provided. Analyses including procedural hazards use tabular methods. Analyses and meta-analyses of non-procedural strokes use Kaplan-Meier and log-rank methods. The trial is registered with the ISRCTN registry, ISRCTN21144362. Findings: Between Jan 15, 2008, and Dec 31, 2020, 3625 patients in 130 centres were randomly allocated, 1811 to CAS and 1814 to CEA, with good compliance, good medical therapy and a mean 5 years of follow-up. Overall, 1% had disabling stroke or death procedurally (15 allocated to CAS and 18 to CEA) and 2% had non-disabling procedural stroke (48 allocated to CAS and 29 to CEA). Kaplan-Meier estimates of 5-year non-procedural stroke were 2·5% in each group for fatal or disabling stroke, and 5·3% with CAS versus 4·5% with CEA for any stroke (rate ratio [RR] 1·16, 95% CI 0·86–1·57; p=0·33). Combining RRs for any non-procedural stroke in all CAS versus CEA trials, the RR was similar in symptomatic and asymptomatic patients (overall RR 1·11, 95% CI 0·91–1·32; p=0·21). Interpretation: Serious complications are similarly uncommon after competent CAS and CEA, and the long-term effects of these two carotid artery procedures on fatal or disabling stroke are comparable. Funding: UK Medical Research Council and Health Technology Assessment Programme

Genetic effects on gene expression across human tissues

Characterization of the molecular function of the human genome and its variation across individuals is essential for identifying the cellular mechanisms that underlie human genetic traits and diseases. The Genotype-Tissue Expression (GTEx) project aims to characterize variation in gene expression levels across individuals and diverse tissues of the human body, many of which are not easily accessible. Here we describe genetic effects on gene expression levels across 44 human tissues. We find that local genetic variation affects gene expression levels for the majority of genes, and we further identify inter-chromosomal genetic effects for 93 genes and 112 loci. On the basis of the identified genetic effects, we characterize patterns of tissue specificity, compare local and distal effects, and evaluate the functional properties of the genetic effects. We also demonstrate that multi-tissue, multi-individual data can be used to identify genes and pathways affected by human disease-associated variation, enabling a mechanistic interpretation of gene regulation and the genetic basis of disease

Zum Monumentum Ancyranum

Konrad EngelhardtSpeyer, Gymnasium, Programm, 190

Zum Monumentum Ancyranum

von Konrad EngelhardtZugl.: München, Phil. Diss., 190

Herstellung und Charakterisierung tetraetherlipidhaltiger Lipoplexe und Lipopolyplexe als neuartige Vehikel für die orale Gentherapie

Die Gentherapie bietet ein großes Potential für die Behandlung von schweren chronischen Erkrankungen wie z.B. Krebs oder Erbkrankheiten. Hierbei werden nicht nur die Symptome der Krankheiten behandelt, sondern man versucht defekte Gene zu ersetzen. Mit sogenannten Genvektoren (viral oder nicht-viral) werden dabei Gene in menschliche Zellen eingeschleust. Ein Genvektor muss nicht nur eine hohe Transfektionseffizienz besitzen, sondern auch eine geringe Toxizität und hohe Patientencompliance aufweisen. Ein Gentherapeutikum zur oralen Anwendung, das eine hohe Stabilität gegenüber dem sauren pH-Wert im Magen hat, würde diese Kriterien am besten erfüllen. Ein vielversprechender Ansatz, um Genvektoren herzustellen, die in sauren pH-Werten stabil bleiben, stellt die Nutzung von Tetraetherlipiden der Archaeen dar. Archaeen bilden neben den Bakterien und Eukaryoten eine der drei Domänen zellulärer Lebewesen. Sie sind an extreme Milieubedingungen angepasst, z.B. wachsen sie bevorzugt bei +80 °C (hyperthermophil), in stark konzentrierten Salzlösungen (halophil) oder bei niedrigen pH-Werten (acidophil). Der Grund für diese außergewöhnliche Stabilität liegt darin, dass die Zellmembran der Archaeen aus Tetraetherlipiden aufgebaut ist. Im Gegensatz zu eukaryotischen Membranlipiden besitzen Tetraetherlipide keine Ester- sondern Etherbindungen. Des Weiteren durchspannen Tetraetherlipide die Membran vollständig und ordnen sich nicht zu einer Doppelmembran an. In der vorliegenden Arbeit wurden Tetraetherlipide aus den gefriergetrockneten Biomassen von Archaeen mittels Soxhlet-Extraktion extrahiert. Eine darauffolgende Aufreinigung fand an einer Kieselgelsäule statt. Die extrahierten Lipidfraktionen beschränkten sich auf TEL (Rohlipide), PLFE (polare Lipidfraktion E), hGDNT (hydrolysiertes Glycerol-Di-Alkyl-Nonitol-Tetraetherlipid) und hGDGT (hydrolysiertes Glycerol-Di-Glycerol-Tetraetherlipid). Zudem wurde ein neuartiges Tetraetherlipid (MI-0907) mit positiv geladener Kopfgruppe synthetisiert. Alle fünf Tetraetherlipide erhielt man als dunkelbraune bzw. hellgelbe waxartige Massen mit Ausbeuten von 1,9 - 46,89 % (bezogen auf die Ausgangsmasse). Für die Herstellung von Liposomen wurden Tetraetherlipide und konventionelle Lipide wie z.B. DPPC (1,2-Di-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin), CH (Cholesterol) oder DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammoniumpropan) in verschiedenen molaren Verhältnissen in einem organischen Lösungsmittel miteinander gemischt. Durch Verdampfung des ii Lösungsmittels bildete sich ein dünner Lipidfilm, der durch Zugabe einer wässrigen Pufferlösung in eine liposomale Suspension überführt wurde. Die so hergestellten Liposomen zeigten Durchmesser von 101 - 351 nm und PDI-Werte von 0,2 - 0,4. Liposomen mit günstigen Parametern bzgl. Größe und PDI-Wert stellten die Formulierungen hGDNT/DPPC/DOTAP (20/55/25 mol/mol/mol), MI-0907/DPPC/CH (20/55/25 mol/mol/mol) und hGDNT/DPPC/CH (20/55/25 mol/mol/mol) dar. Sie wurden in weiteren Experimenten in Pufferlösungen mit pH-Werten von 2 - 9 inkubiert und bzgl. der Änderung des Durchmessers nach einem Scoring System (--- bis +++) bewertet. Die oben genannten Formulierungen zeigten minimale Veränderungen bzgl. der Durchmesser und PDI-Werte. Die Komplexierung der positiv geladenen Formulierungen mit pDNA führte zu Lipoplexen, die ebenfalls eine hohe Stabilität bei pH-Werten von 2 - 9 zeigten. Die Transfektionseffizienzen der Formulierungen lagen ca. 30 - 40 % unter den Referenzsubstanzen (25kDa-bPEI oder DOTAP). Zur Verbesserung der Transfektionseffizienzen, bildete man Komposite aus Liposomen, Polymer und pDNA, sogenannte Lipopolyplexe. Als Liposomen wurden die oben genannten Formulierungen eingesetzt. Die Transfektionseffizienz lag bei Lipopolyplexen bis zu 50 % über den Referenzsubstanzen. Zudem wiesen Lipopolyplexe in Toxizitätsversuchen wie z.B. LDH-Assay eine um ca. 75 % reduzierte Toxizität im Vergleich zu einfachen Polyplexen auf. Die besondere Stabilität der tetraetherlipidhaltigen Lipopolyplexe wurde in einem Heparin-Assay ermittelt, wobei der Stabilitätseffekt deutlich höher war als für einfache Polyplexe. Die morphologischen Besonderheiten von Lipoplexen konnte mittels Rasterkraftmikroskopie untersucht werden. Hierbei war zu erkennen, dass sich pDNA um Liposomen windet und der Aufbau multilamellar erfolgt, d.h. mehrere Lipidschichten sind übereinander angeordnet und bilden einen „zwiebelartigen“ Aufbau der Komplexe. Bei Lipopolyplexen, die Durchmesser von 138 nm bis 156 nm annehmen, ist ein Polyplexkern von einer ca. 4 nm dicken Lipidschicht ummantelt. Die erfolgreiche Extraktion und Aufreinigung von Tetraetherlipiden aus Archaeen, ist für die Herstellung von Genvektoren eine wichtige Grundlage. Qualitätsbestimmende Kriterien der gewonnenen Lipoplexe und Lipopolyplexe wie reduzierte Toxizität, Stabilität im sauren pH-Milieu und erhöhte Transfektionseffizienz legen nahe, dass sich Genvektoren auf der Basis von Tetraetherlipiden der Archaeen für die orale Gentherapie eignen sollten