Targeting antigens to sialoadhesin-expressing macrophages as a vaccination strategy

Vaccinatie berust op het opwekken van een pathogeen-specifieke immuunrespons die in staat is te beschermen tegen een toekomstige besmetting met het pathogeen. Om dit te bewerkstelligen is het noodzakelijk dat antigeen-presenterende cellen (APC) die geladen zijn met een pathogeen-specifiek antigeen kunnen in contact komen met naïve lymfocyten in secundaire lymfoïde organen. Een manier om de efficiëntie van een vaccin te verbeteren kan dan ook zijn om de efficiëntie van de manier waarop APC in contact komen met het antigeen te verbeteren. Dit inzicht heeft geleid tot onderzoek waarbij antigenen gestuurd worden richting het oppervlak van APC door het gebruik van een molecule die een receptor op het oppervlak van de APC herkent. Sialoadhesine-expresserende (Sn+) macrofagen zijn APC die omwille van hun locatie in secundaire lymfoïde organen interessante targets kunnen zijn voor dergelijke vaccinatiestrategie. Het sturen van antigenen richting deze macrofagen en de evaluatie van de resulterende immuunrespons is het onderwerp van deze doctoraatsthesis. In het eerste luik van de thesis werd een recombinant antilichaam (rec41D3) ontwikkeld dat gebruikt kan worden voor het sturen van antigenen (peptiden of eiwitten) richting Sn+ macrofagen. Het recombinante antilichaam vertoonde een gelijkaardige affiniteit voor Sn als het natieve antilichaam en induceerde, na binding met Sn, Sn endocytose in primaire macrofagen. De recombinante antilichamen vertoonden, net als het natieve antilichaam, een trage progressie door de endo/lysosomale weg en verbleven meer specifiek voor verlengde tijd aanwezig in vroege endosomen. Bijkomend werden fusieeiwitten gemaakt van rec41D3 met een V5 peptide tag of van rec41D3 met eGFP. Beide eiwitten werden geproduceerd in het supernatans van HEK293T cellen na transfectie en konden makkelijk opgezuiverd worden aan de hand van proteïne G chromatografie. Bijkomend werd aangetoond dat V5 en eGFP samen met rec41D3 geïnternaliseerd werden in primaire macrofagen. Dit toont aan dat een aanpasbare antilichaamvector gemaakt werd die gebruikt kan worden om Sn-gerichte vaccinatiestrategieën uit te testen in een porcien diermodel. In het tweede luik van de thesis werd de technologie ontwikkeld in het eerste luik toegepast om fusie-eiwitten te maken voor PRRSV vaccinatie. Een lineaire B cel epitoop aanwezig op GP4 van PRRSV werd geselecteerd en geïntroduceerd aan de Cterminus van rec41D3 en een irrelevante isotype controle. Een enkele dosis van de fusie-eiwitten werd toegediend aan varkens en vier weken later werden de dieren geïnfecteerd met het PRRSV virus. Na vaccinatie konden nog geen peptidespecifieke IgG antwoorden gedetecteerd worden. Na virale infectie werd echter duidelijk dat de peptide-specifieke immuunrespons zich sneller ontwikkelde in gevaccineerde ten opzichte van nietgevaccineerde dieren, met het meest uitgesproken effect zichtbaar bij de dieren die een eenmalige 500Gg dosis ontvangen hadden van het Sn-gerichte fusie-eiwit. Bijkomend was ook de neutralizerende antilichaamrespons verhoogd na infectie in deze groep, hoewel de correlatie met het peptide-specifieke antwoord moeilijk te trekken bleek. Tot slot werd ook een matige verbetering van de viremie na infectie vastgesteld in deze groep. Deze data tonen aan dat het sturen van een viraal peptide naar Sn+ macrofagen de anti-virale immuunrespons kan verbeteren. Deze data tonen echter ook aan dat meer onderzoek nodig zal zijn om het vaccinatiepotentieel van deze vaccinatiestrategie verder uit te bouwen

Development of a recombinant antibody to target peptides and proteins to sialoadhesin-expressing macrophages

Background: Sialoadhesin (Sn)-expressing monocytes/macrophages have been associated with several diseases like inflammatory and autoimmune disorders as well as viral infections, and they also appear to play a role in the initiation of an adaptive immune response. This makes Sn-expressing cells not only attractive targets for cell-directed therapies, but also an appealing target for vaccination. Furthermore, since Sn was shown to be an endocytic receptor, the conjugation of effector molecules to an Sn-specific ligand should allow intracellular delivery of these conjugates. Previously, we developed functional Sn-specific immunoconjugates that were generated via chemical coupling. Although successful, the system requires significant optimization for each immunoconjugate to be made. To generate a more flexible and controlled system, we developed a recombinant antibody vector allowing the creation of genetic antibody fusion constructs. This paper reports on the characterization of the recombinant antibody and the evaluation of its use for Sn-directed targeting. Results: The variable domains of the porcine Sn-specific monoclonal antibody 41D3 were sequenced and cloned in frame with a mouse IgG1 backbone. Transfection of HEK293T cells with the resulting plasmid led to the secretion of fully assembled IgG into the culture medium. This recombinant antibody rec41D3 was shown to specifically bind to porcine Sn with a comparable affinity as the native monoclonal antibody. In addition, rec41D3 also induced Sn endocytosis in primary macrophages and resided for prolonged times in early/late endosomes. To allow the generation of antibody fusion constructs, a multiple cloning site was introduced at the C-terminus of the heavy chain. Two fusion constructs were generated, one containing a V5 peptide tag and one containing an eGFP molecule. Both constructs were shown to be efficiently produced in HEK293T cells and easily purified using standard protein G chromatography. In addition, both V5 and eGFP were shown to be co-internalized together with rec41D3 into Sn-expressing primary macrophages. Conclusions: A recombinant antibody allowing targeted delivery of peptides and proteins to Sn-expressing macrophages was developed. Production and purification of antibody fusion constructs was possible without major optimization and with batch to batch consistency, confirming the development of a versatile antibody vector to evaluate Sn-directed targeting strategies in a porcine animal model

Providing writing and language support for students who have English as a second language – a pilot study

This paper reports on a pilot project which provided writing support for registered nurses undertaking Continuing Professional Development (CPD) and for preregistration nursing students. Both groups of students have English as a second language (ESL). The aims of the project were to extend the scope of the available writing support within the faculty for ESL students through the provision of one-to- one sessions and workshops. In addition, workshops were provided for lecturers to improve their understanding of the barriers faced by ESL students. Literature indicates that communication with tutors and the need for clear feedback are important factors for ESL students. Quantitative and qualitative data were collected from questionnaires completed by participants after teaching sessions and were analysed against pre-agreed success criteria. Findings indicate that students were very positive about the effectiveness of the sessions in helping them improve their academic writing. Additionally, three themes emerged from the student data: reasons for using the ELS support service; what they liked most about the ELS service and suggestions for improvements to the service. Data from staff show that the sessions have given staff a greater insight into the problems faced by ESL students

Providing learning support to nursing students: a study of two universities

In universities where significant numbers of nursing students come from non-traditional backgrounds, and where an equally significant proportion of students have English as a second language, provision of learning support is essential to ensure success and progression, and to prevent attrition. This paper presents an evaluative study of the support services provided to undergraduate nursing students in two universities in the United Kingdom (UK). Both universities have significant numbers of students from non-traditional backgrounds and who have English as a second language, and both institutions have in place a large array of student support mechanisms. The aims of the study were to identify all existing student support mechanisms across the two universities, to illuminate the profile of students who enter pre-registration programmes at the two universities (age, gender, educational background) and to measure the perceptions of students of the use and usefulness of the support mechanisms provided by their university. Survey method evaluative research was the chosen research approach. Findings showed that the support services that appear to have the greatest impact on student success in their nursing programme are the programme leaders/module teachers, small study skills groups (known as APPL and L2L) and, for the 50% of students who required it, academic literacy and numeracy support sessions. For students who have English as a second language and with non-traditional entry qualifications, numeracy and academic literacy support is particularly valued