Marine Mammal Brucella Reference Strains Are Attenuated in a BALB/c Mouse Model

Brucellosis is a zoonosis of worldwide distribution with numerous animal host species. Since the novel isolation of Brucella spp. from marine mammals in 1994 the bacteria have been isolated from various marine mammal hosts. The marine mammal reference strains Brucella pinnipedialis 12890 (harbour seal, Phoca vitulina) and Brucella ceti 12891 (harbour porpoise, Phocoena phocoena) were included in genus Brucella in 2007, however, their pathogenicity in the mouse model is pending. Herein this is evaluated in BALB/c mice with Brucella suis 1330 as a control. Both marine mammal strains were attenuated, however, B. ceti was present at higher levels than B. pinnipedialis in blood, spleen and liver throughout the infection, in addition B. suis and B. ceti were isolated from brains and faeces at times with high levels of bacteraemia. In B. suis-infected mice serum cytokines peaked at day 7. In B. pinnipedialis-infected mice, levels were similar, but peaked predominantly at day 3 and an earlier peak in spleen weight likewise implied an earlier response. The inflammatory response induced pathology in the spleen and liver. In B. ceti-infected mice, most serum cytokine levels were comparable to those in uninfected mice, consistent with a limited inflammatory response, which also was indicated by restricted spleen and liver pathology. Specific immune responses against all three strains were detected in vitro after stimulation of splenocytes from infected mice with the homologous heat-killed brucellae. Antibody responses in vivo were also induced by the three brucellae. The immunological pattern of B. ceti in combination with persistence in organs and limited pathology has heretofore not been described for other brucellae. These two marine mammal wildtype strains show an attenuated pattern in BALB/c mice only previously described for Brucella neotomea.This work was supported by the grants RTA 2013-00065-C02-01 from The National Institute for Agricultural and Food Research and Technology (INIA) and agrifood research in Spain (MPJdB) and SAF2014-54763-C2 from the European Social Fund (JP). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.Publishe

Comparación de las proteínas de fase aguda expresadas en suero de ratón por infección de referencia con Brucella suis y una nueva cepa emergente aislada de ranas

La respuesta de fase aguda (RFA) comprende una serie de procesos fisiológicos y metabólicos que se inducen ante situaciones que representan una amenaza para el organismo (infecciones…) y que alteran los mecanismos homeostáticos, con el fin de que éste vuelva a la situación normal. Un aspecto peculiar de la RFA es el papel fundamental que tiene el hígado, en el que se producen múltiples cambios que tienen como consecuencia la modificación de los niveles de proteínas plasmáticas sintetizadas por él, conocidas como proteínas de fase aguda (PFA). La brucelosis es una zoonosis de amplia distribución en nuestro país que causa grandes pérdidas económicas en nuestra ganadería y que produce más de un millar de casos humanos anualmente. La gestión sanitaria de la brucelosis humana está directamente relacionada con la eliminación de la brucelosis animal, por lo que la investigación orientada al desarrollo de una mejor profilaxis animal está plenamente justificada. En los últimos años se han aislado nuevas especies de Brucella en distintos huéspedes de las que se desconoce su virulencia y capacidad de transmisión a los animales de interés económico y al hombre. Una de estas últimas cepas ha sido descrita como patógeno de la rana (Brucella spp. BR3). La hipótesis que se ha planteado en este trabajo es que “las PFA en ratón podrían servir para monitorizar la infección por Brucella y distinguir una infección crónica (propia de B. suis) de una infección moderada (propia de BR3)”. El objetivo principal de este trabajo ha sido determinar las PFA en ratón y su posible uso como biomarcadores de infección por B. suis y BR3. En este estudio se ha visto que la infección realizada con BR3 es crónica, al igual que la de la cepa de referencia B. suis, ya que los ratones no consiguen eliminar las bacterias en el periodo de tiempo estudiado (tres meses). El peso y las unidades formadoras de colonias (UFC) en hígado/bazo evidencian que la cepa B. suis es más virulenta. En ambas infecciones se ha observado un aumento significativo en las concentraciones séricas de la haptoglobina (Hp), la hemopexina (Hx), el amiloide A sérico (SAA), la cadena pesada 4 del inhibidor de la tripsina inter-α (ITIH4) y la α1-glicoproteína ácida (GPA) durante la RFA, siendo mucho menor para la cepa BR3; por ello, los valores de la concentración de estas PFA permiten distinguir el tipo de infección. La transferrina (Tf) sólo aumenta en la infección por B. suis. La apolipoproteína A1 (ApoA1), la proteína C reactiva (CRP) y el inhibidor de la α1-cisteína proteasa (ICP) no varían en ninguna de las dos infecciones, por lo que no pueden considerarse PFA en ratón. Se ha detectado la respuesta de inmunoglobulinas (Igs) totales y de IgG3 contra el lipopolisacárido (LPS) de B. abortus, principal antígeno común de las cepas lisas de Brucella, a partir del día 28 post-infección por B. suis

Expresión diferencial de las Proteínas de fase aguda en ratón causada por infección crónica con Brucella suis e infección aguda por Brucella microti

La brucelosis es una zoonosis de amplia distribución en nuestro país, que causa unas grandes pérdidas económicas en nuestra ganadería y produce más de un millar de casos humanos anualmente. En los últimos años se han descrito nuevas especies de Brucella consideradas como patógenos emergentes. Es necesario definir su virulencia así como estudiar su posible utilización como cepa vacunal para la profilaxis de la brucelosis animal. Una de estas últimas cepas descubiertas es Brucella microti, que ha sido descrita como patógeno del topillo. En este estudio se ha mostrado como altamente virulenta en un modelo murino puesto a punto en el Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA) de Zaragoza. Se han realizado dos infecciones, comparando B. microti con la cepa de referencia B. suis. La mayor virulencia de B. microti produjo una infección aguda en ratón, a diferencia de la cepa de referencia B. suis, que provocó una infección crónica. La respuesta contra el lipopolisacárido bacteriano en la cepa de referencia (B. suis) apareció a los 28 días de infección. Con el objetivo de determinar si una infección por Brucella se puede monitorizar en suero y diferenciar entre una infección aguda (B. microti) y una infección crónica (B. suis) se han cuantificado nueve proteínas de fase aguda. Las proteínas de fase aguda aumentan o disminuyen en respuesta a un daño tisular o una infección que representan una amenaza para la integridad del organismo mediante alteraciones en los mecanismos homeostáticos, provocando una respuesta de fase aguda. Las diferencias en la virulencia se han reflejado en una respuesta diferente por parte del huésped. De las nueve proteínas cuantificadas, se han confirmado como proteínas de fase aguda cinco de ellas (haptoglobina, SAA, GPA, hemopexina e ITIH4). También se observó un aumento de la CRP e ICP en la infección por B. microti y un aumento de la transferrina en la infección por B. suis. La Apo A1 no varió en ninguna de las infecciones. Por todo ello es posible diferenciar una infección aguda (B. microti) de una infección crónica (B. suis) en estas condiciones experimentales

Experimental Challenge of Atlantic Cod (Gadus morhua) with a Brucella pinnipedialis Strain from Hooded Seal (Cystophora cristata)

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Brucellosis Vaccines: Assessment of Brucella melitensis Lipopolysaccharide Rough Mutants Defective in Core and O-Polysaccharide Synthesis and Export

Background: The brucellae are facultative intracellular bacteria that cause brucellosis, one of the major neglected zoonoses. In endemic areas, vaccination is the only effective way to control this disease. Brucella melitensis Rev 1 is a vaccine effective against the brucellosis of sheep and goat caused by B. melitensis, the commonest source of human infection. However, Rev 1 carries a smooth lipopolysaccharide with an O-polysaccharide that elicits antibodies interfering in serodiagnosis, a major problem in eradication campaigns. Because of this, rough Brucella mutants lacking the O-polysaccharide have been proposed as vaccines. Methodology/Principal Findings: To examine the possibilities of rough vaccines, we screened B. melitensis for lipopolysaccharide genes and obtained mutants representing all main rough phenotypes with regard to core oligosaccharide and O-polysaccharide synthesis and export. Using the mouse model, mutants were classified into four attenuation patterns according to their multiplication and persistence in spleens at different doses. In macrophages, mutants belonging to three of these attenuation patterns reached the Brucella characteristic intracellular niche and multiplied intracellularly, suggesting that they could be suitable vaccine candidates. Virulence patterns, intracellular behavior and lipopolysaccharide defects roughly correlated with the degree of protection afforded by the mutants upon intraperitoneal vaccination of mice. However, when vaccination was applied by the subcutaneous route, only two mutants matched the protection obtained with Rev 1 albeit at doses one thousand fold higher than this reference vaccine. These mutants, which were blocked in O-polysaccharide export and accumulated internal O-polysaccharides, stimulated weak anti-smooth lipopolysaccharide antibodies. Conclusions/Significance: The results demonstrate that no rough mutant is equal to Rev 1 in laboratory models and question the notion that rough vaccines are suitable for the control of brucellosis in endemic areas.This work was funded by the European Commission (Research Contract QLK2-CT-2002-00918) and the Ministerio de Ciencia y Tecnología of Spain (Proyecto AGL2004-01162/GAN)

In vivo characterization of B. melitensis deletion mutants with defective systems of adaptation to low oxygen tension

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In vivo characterization of B. melitensis deletion mutants with defective systems of adaptation to low oxygen tension

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Informe del proyecto Nuevas especies de brucella: nuevas estrategias para el control y el diagnóstico de la brucelosis animal. análisis de virulencia, respuesta inmune y desarrollo de vacunas y biomarcadores (RTA2013-00065-C02-01)

La consecución de este proyecto ha permitido que se haya descrito por primera vez la virulencia y patogenicidad de diversas cepas de Brucella de reciente descripción, como las cepas de origen marino y las cepas de Brucella de origen anfibio en un modelo murino. La puesta a punto de modelos de experimentación animal en brucelosis es fundamental para estudios subsecuentes de aspectos concernientes a la virulencia o patogenicidad de dichas cepas, considerándose, por tanto, una herramienta necesaria e imprescindible en el estudio de la brucelosis. El análisis de la virulencia de las cepas estudiadas en este proyecto ha servido como base científico- técnica para plantear desarrollo de nuevas vacunas para la brucelosis basadas en el uso de las nuevas cepas de Brucella.Ministerio de Economía y Competitividad y Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA

RegA, the transcriptional regulator of the two-component system RegB/RegA of Brucella suis is a controller of both oxidative respiration and denitrification, required for chronic infection in mice.

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