PADRONIZAÇÃO DE UM TESTE DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR UTILIZANDO SONDAS TAQMAN® PARA A DETECÇÃO DO GENE DO HALOTANO EM SUÍNOS

A hipertermia maligna é uma doença muscular hereditária conhecida como síndrome do estresse dos suínos (PSS), causada por vários fatores como estresse físico, calórico, castração, brigas entre animais, vacinação e, inclusive, a administração do anestésico halotano que desencadeia a morte de suínos afetados (homozigotos recessivos). Por isso, o gene responsável por essa desordem é chamado de gene do halotano (HAL). Quando portador dessa síndrome, o animal apresenta uma mutação do tipo SNP causal no gene receptor de rianodina1, ocorrendo troca de uma citosina, em animais normais, por uma timina, em animais afetados. A alteração nesse receptor produz maior liberação de cálcio, aumentando as contrações musculares e a liberação de ácido lático, desenvolvendo a carne PSE (exsudativa, pálida e mole). Essa carne não tem boa aceitação no mercado por possuir características indesejáveis como alta perda de água, além de gerar prejuízos para as indústrias alimentícias. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi padronizar um teste de diagnóstico do gene HAL em suínos utilizando sondas Taqman®, como uma alternativa ao teste de diagnóstico clássico utilizado (PCR-RFLP). Foram realizadas extrações de DNA do tecido de 36 amostras de suínos. Após, as amostras foram submetidas a um teste utilizando a metodologia convencional de PCR-RFLP; os resultados foram analisados e armazenados. Para a metodologia de discriminação alélica, foi utilizada a técnica de PCR em tempo real (qPCR), na qual foram desenhados dois primers e duas sondas Taqman® (Life Technologies), uma para o alelo C e outra para o alelo T. As reações de qPCR foram realizadas em equipamento 7500SDS (Applied Biosystems) utilizando para uma reação final de 15 µL: Mastermix TaqMan® Genotyping Master Mix na concentração final 1X; 0,75 µL de ensaio 20x do HAL (Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays), contendo sondas e primers simultaneamente); 1 µL de DNA (25 ng/µL) e água deionizada livre de DNAses e RNAses para completar a reação. Ela foi colocada no equipamento de PCR Tempo Real com a ciclagem: 50 ºC por 2 minutos; e 40 ciclos de 95 ºC por 15 segundos e 60 ºC por 1 minuto. Para verificar a especificidade do teste, as mesmas amostras genotipadas para o teste clássico de PCR-RFLP foram utilizadas nos ensaios de qPCR. Das 36 amostras genotipadas por qPCR, foram observados os 3 genótipos possíveis (animais normais, portadores e afetados), demonstrando especificidade das sondas. Além disso, quando os genótipos encontrados pelas duas metodologias foram comparados, houve uma concordância de 100% entre os dois testes. Dessa maneira, pode-se concluir que o teste utilizando a tecnologia de sondas Taqman® e de PCR em tempo real pode substituir a técnica PCR-RFLP no diagnóstico do gene do halotano em suínos, por possuir a mesma precisão e eficiência que a antiga técnica empregada e em um menor período de tempo.Palavras-chave: Halotano. Suínos. Taqman®

Uma nova matéria-prima na produção de biodiesel: sementes do pinhão-roxo

Biodiesel is an alternative fuel that is produced through oil plants or animal fat. It is a renewable energy source, with biodegradable characteristics, to emit less pollutant than diesel. Thus, this work aims to show the production of biodiesel from the purple-pinion (Jatropha gossypiifolia L.) seeds. In addition to the synthesis, the physical-chemical characterization of both the raw material and the final product was carried out. The biodiesel synthetic route was performed by the basic catalytic transesterification reaction, using potassium hydroxide (KOH) in the presence of methanol (CH3OH) in the molar ratio of 1: 3 (oil: methanol). As a result, it was observed that the mass conversion of the biodiesel was 22.05 g. The physical-chemical analyzes carried out were acid index of 0.106 mgKOH / g, according to ANP technical resolution. The peroxide index of 1.03 meqO2 / kg, the kinematic viscosity of 20 ° C to 40 ° C, obtained was 6.455 mm2/s and 3.5343 mm2/s, the values are close to the ANP technique resolutions. Stability was 0.26 hours, and the biodiesel burning test was executed for approximately 3 hours. Therefore, there is a high viability of biodiesel production through the purple pinion seeds.O biodiesel é uma alternativa de combustível que é produzido através das plantas oleaginosas ou gordura animal. É fonte de energia renovável, com características biodegradáveis, por emitir menos poluentes que o diesel. Assim, este trabalho tem como objetivo mostrar a produção de biodiesel a partir das sementes pinhão-roxo (Jatropha gossypiifolia L.). Além da síntese, foi realizado a caracterização físico-química, tanto da matéria prima, como o produto final. A rota sintética do biodiesel foi realizada pela reação de transesterificação via catalise básica, utilizando o hidróxido de potássio (KOH) na presença de metanol (CH3OH) na razão molar de 1:3 (óleo: metanol). Como resultado, observou-seque a conversão em massa do biodiesel foi 22,05 g. As análises físico-químicas realizadas foram: índice acidez de 0,106 mgKOH/g, estão de acordo com resolução técnica da ANP. O índice peróxido de 1,03 meqO2/Kg, a viscosidade cinemática de 20°C a 40°C, obtida foi de 6,455 mm2/s e 3,5343 mm2/s, os valores estão próximos das resoluções de técnica da ANP, a estabilidade oxidativa foi 0,26 horas, e o teste de queima do biodiesel durou aproximadamente 3 horas. Portanto, existe uma alta viabilidade de produção do biodiesel através das sementes de pião roxo

Training community health agents in cervical cancer prevention

Atualmente, intensificam-se as discussões a respeito da educação em saúde, principalmente em relação aos agentes comunitários de saúde (ACS), para os quais a capacitação deve ser constante. Este estudo tem como objetivo relatar a experiência de capacitação de ACSs a respeito do tema câncer cérvico-uterino. A escolha do tema abordado baseou-se em sua relevância e na necessidade concreta dos ACSs observados, que não se sentiam empoderados com relação ao assunto. Diante disso, nove acadêmicos de Medicina e Enfermagem, monitores do PET-Saúde da Universidade de Brasília (UnB), realizaram encontros com ACSs dos municípios de Ceres e Santa Isabel (GO), com o intuito de fornecer a esses profissionais mais informações e técnicas para que a abordagem das usuárias em relação ao exame colpocitologico fosse bem-sucedida. A metodologia utilizada foi a integração entre educação bancária e educação dialógica, a fim de que elas se complementassem para alcançar melhores resultados. Foi evidenciado êxito, uma vez que os ACSs demonstraram ter assimilado o conteúdo e ter organizado os conceitos e puderam aplicá-los de forma criativa, envolvendo-se com o aprendizado e acrescentando a ele as suas vivências próprias em relação ao conhecimento aprendido.Recent years have witnessed increasing discussion on health education, especially for community health workers (CHWs), who should receive continuing training. The aim of this study was to report on an experience with CHWs trained in cervical cancer prevention. The choice of the theme was based on its relevance and the observed need among CHWs, who did not feel empowered to deal with it. Thus, nine undergraduate medical and nursing students, who were monitors in the PET-Saúde project at the University of Brasília (UnB), held meetings with CHWs in the municipalities (counties) of Ceres and Santa Isabel, Goiás State, Brazil, to provide them with information and techniques in order to improve the success of Pap smears for patients. The methodology used a combination of traditional and critical dialogical learning in order to achieve the best results. The training proved successful, since the CHWs assimilated the concepts and were able to apply them creatively, interacting with the learning process and enriching it with their own personal experiences

Identification and validation of expressed sequences in muscular tissue of pigs

O estudo das seqüências expressas é um passo fundamental para se conhecer e compreender a arquitetura genética que controla as características quantitativas. Dessa forma, nesse estudo geraram-se etiquetas de seqüências expressas (ESTs) no tecido muscular de suínos das raças Large White e Piau, estas foram comparadas com seqüências depositadas em bancos de dados públicos e identificaram-se ESTs diferencialmente expressas entre ambas as bibliotecas. No intuito de identificar genes expressos na musculatura, foram construídas duas bibliotecas de cDNA a partir do músculo semimembranosus de animais adultos (180 dias) das raças Large White e Piau. Um total de 4.123 ESTs foi seqüenciado a partir das extremidades 5 e 3 , em ambas as bibliotecas. Após a análise de qualidade, 1030 seqüências foram validadas segundo os parâmetros estabelecidos para análises posteriores. Desse total, 675 ESTs pertenciam à biblioteca Large White e 355 ESTs pertenciam à biblioteca Piau. As ESTs validadas apresentaram tamanho médio de 494,76 pb. As seqüências foram então submetidas à análise de agrupamento pelo programa CAP3 resultando em 130 seqüências (11,80%) que puderam ser agrupadas em contigs e 900 ESTs (88,20%) se apresentaram como seqüências únicas. As seqüências foram comparadas com bancos de dados de nucleotídeos e proteínas, resultando em 333 seqüências (31,54%) homólogas e 697 seqüências (68,46%) sem homologia. Um total de 255 ESTs (24,30%) foi submetido à anotação gênica segundo as normas do consórcio Gene Ontology. Dessa forma, as ESTs foram classificadas quanto à função molecular, ao componente celular e ao processo biológico no qual estavam envolvidas. Foram identificadas seqüências diferencialmente expressas entre as bibliotecas de cDNA analisadas. Grande parte das seqüências expressas representa genes previamente não identificados em tecido muscular de suínos.The study of expressed sequences has great importance to know and understand the genetic architecture that control quantitative traits. In this way, in this study it was produced expressed sequence tags (ESTs) in muscular tissue of pigs from Large White and Piau breeds, these ESTs were compared with public data bases and differential expressed ESTs were identified between both libraries. With this objective it was generated two cDNA libraries from semimenbranosus muscle of adult (180 days) Large White and Piau pigs. In both libraries, 4,123 ESTs have been sequenced from 5 and 3 ends. After quality analysis, 1030 sequences were considered valid for the further analysis, according to established parameters. From this total, 675 ESTs were originated from Large White library and 355 ESTs were originated from Piau library. The analyzed ESTs presented average length of 494.76 pb. Cluster analysis by CAP3 software indicates that a total of 130 sequences (11.80%) was assembled in contigs and 900 ESTs (88.20%) represented unique sequences in this collection. The sequences were compared with nucleotide and protein public data bases, resulting in 333 homologues sequences (31.54%) and 697 (68.46%) sequences that did not present homology. A total of 255 ESTs (24.30%) was submitted to genomic annotation according to Gene Ontology Consortium. In this way, the ESTs were classified according to their molecular function, process and component. Differential expressed sequences were identified between both cDNA libraries. Most of the expressed sequences represent genes not previously described in muscle tissue of pigs.Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuári

Association between leptin candidate gene polymorphisms and quantitative traits in swine

Neste estudo investigou-se a associação entre polimorfismos no gene da Leptina e características quantitativas em suínos produzidos pelo cruzamento divergente entre machos da raça naturalizada brasileira Piau e matrizes comerciais. Foram avaliadas características de desempenho, carcaça, cortes de carcaça e qualidade da carne. Os polimorfismos detectados por seqüenciamento nos animais parentais foram reconhecidos pelas enzimas Pvu II, Dde I, Bam HI, Fok I e Hinf I, respectivamente nas posições do gene 798, 828, 2411, 3266 e 3469 pb. Apenas o polimorfismo T3469C estava localizado em região de exon; os demais polimorfismos se encontravam em regiões não- expressas do gene. Os genótipos para cada polimorfismo foram obtidos pela técnica de PCR-RFLP. Nas análises estatísticas de associação entre os polimorfismos e as características foi utilizado o modelo com efeitos fixos de genótipo, sexo, lote, interação genótipo x sexo e efeito aleatório de pai. Foram consideradas diferentes covariáveis para cada grupo de características. As médias dos genótipos foram comparadas pelo teste F ou t. Quando a interação genótipo x sexo foi significativa, realizou-se a comparação entre as médias dos genótipos dentro de sexo por meio do teste t. Os efeitos médios da substituição alélica e os desvios da dominância dos genótipos foram determinados. O polimorfismo C798T apresentou associações com as características número total de tetas (p=0,02), número de tetas esquerdas (p=0,03), espessura de toucinho UL (p=0,06), comprimento de intestino (p=0,02) e peso total de carré (p= 0,01). O sítio polimórfico C828T esteve associado a variações nas características peso da banda direita (p=0,06) e banda esquerda (p=0,06), peso da copa limpa (p= 0,07), peso total de paleta (p=0,03) e peso de bacon (p=0,03). O polimorfismo T2411C esteve associado a variações nas características espessura de toucinho P2 (p=0,06), peso de paleta limpa (p=0,06), peso de copa (p=0,08), peso do filezinho (p=0,01) e peso do rim (p=0,01). O polimorfismo T3266G apresentou associações significativas com as características idade ao abate (p=0,08), espessura de toucinho medida imediatamente após a última costela, a 6,5 cm da linha dorso-lombar (p=0,07), espessura de toucinho imediatamente após a última costela, na linha dorso- lombar (p=0,04), espessura de toucinho entre a última e a penúltima vértebra lombar, na linha dorso-lombar (p=0,07), peso de costela (p=0,09), peso de copa limpa (p= 0,08) e peso de bacon (p=0,04). O polimorfismo T3469C apresentou associação com as características peso aos 21 (p=0,03), 42 (p=0,05), 63 (p=0,02) e 77 dias de idade (p=0,04), peso ao abate (p=0,03), consumo de ração (p=0,01), ganho de peso médio diário (p< 0,01), conversão alimentar (p<0,01), comprimento de carcaça medido pelos métodos brasileiro (p=0,09) e americano (p=0,04), índice de vermelho (p=0,02) e tonalidade da carne (p=0,03). Foi observada a interação entre sexo e os genótipos para muitas características. Os efeitos médios da substituição alélica e os desvios da dominância foram determinados somente para os polimorfismos T828C e T2411C. Os resultados sugerem que os polimorfismos são potenciais marcadores para características produtivas de importância econômica como taxa de crescimento, consumo de ração e espessura de toucinho. No entanto, as associações foram detectadas em população experimental, sendo necessária a validação desses resultados em populações comerciais.The association of polymorphisms in the porcine Leptin gene and quantitative traits in pigs produced by initial mating of native Brazilian boars and commercial sows was investigated. Performance, carcass, carcass cuts and meat quality traits were analyzed. The polymorphic sites detected by sequencing parental animals DNA were recognized by the enzymes Pvu II, Dde I, Bam HI, Fok I e Hinf I, respectively observed in the positions 798, 828, 2411, 3266 e 3469 pb. Only T3469C polymorphism was observed in exonic region; the other ones were observed at a not expressed region of Leptin gene. Genotypes were identified by PCR – RFLP. Association analyses were performed using a model that included genotype, sex, group and genotype x sex interaction as fixed effects and sire as random effect. Different covariates were assumed according to different trait groups. Genotypes means were compared by F test or t test. The existence of interaction between genotype and sex was evaluated and genotypes means were compared for each sex by t test. The polymorphism C798T was associated with variation in total number (p=0.02) and left number of teats (p=0.03), backfat thickness between last and last but one lumbar vertebrae (p=0.06), intestine length (p=0.02) and total loin ix(bone-in) weight (p=0.01). The polymorphic site C828T was associated with variation on right half carcass weight (p=0.06), left half carcass weight (p=0.06), boston shoulder weight (p=0.07), picnic shoulder weight (p=0.03) and bacon weight (p=0.04). The polymorphism T2411C was associated with variation in backfat thickness after last rib, at 6.5 cm from the midline (p=0.06), skinless and fatless picnic shoulder weight (p=0.06), boston shoulder weight (p=0.08), sirloin weight (p=0.01) and kidney weight (p=0.01). The polymorphism T3266G was associated with slaughter age (p=0.08), backfat thickness after last rib, at 6.5 cm from the midline (p=0.07), backfat thickness after last rib (p=0.04), and backfat thickness between last and last but one lumbar vertebrae (p=0.07), spareribs weight (p=0.09), skinless and fatless boston shoulder weight (p=0.08) and bacon weight (p=0.04). The T3469C polymorphism was associated with weight at 21 (p=0.03), 42 (p=0.05), 63 (p=0.02) and at 77 days of age (p=0.04), slaughter weight (p=0.03), feed intake (p=0.01), average daily gain (p<0.01), feed/gain ratio (p<0.01), carcass length by the Brazilian carcass classification method (p=0.09) and by the American carcass classification method (p=0.04), redness (p=0.02) and hue (p=0.03). Association between genotype and sex was observed for many traits. Allelic substitution and dominance effects were estimated for polymorphisms T828C and T2411C. The observations suggest that these Leptin polymorphisms may be considered potential molecular markers for economically important production traits such as feed intake, growth rate and back fat in swine. However, associations need to be confirmed in commercial populations.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

PADRONIZAÇÃO DE UM TESTE DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR UTILIZANDO SONDAS TAQMAN® PARA A DETECÇÃO DO GENE DO HALOTANO EM SUÍNOS

A hipertermia maligna é uma doença muscular hereditária conhecida como síndrome do estresse dos suínos (PSS), causada por vários fatores como estresse físico, calórico, castração, brigas entre animais, vacinação e, inclusive, a administração do anestésico halotano que desencadeia a morte de suínos afetados (homozigotos recessivos). Por isso, o gene responsável por essa desordem é chamado de gene do halotano (HAL). Quando portador dessa síndrome, o animal apresenta uma mutação do tipo SNP causal no gene receptor de rianodina1, ocorrendo troca de uma citosina, em animais normais, por uma timina, em animais afetados. A alteração nesse receptor produz maior liberação de cálcio, aumentando as contrações musculares e a liberação de ácido lático, desenvolvendo a carne PSE (exsudativa, pálida e mole). Essa carne não tem boa aceitação no mercado por possuir características indesejáveis como alta perda de água, além de gerar prejuízos para as indústrias alimentícias. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi padronizar um teste de diagnóstico do gene HAL em suínos utilizando sondas Taqman®, como uma alternativa ao teste de diagnóstico clássico utilizado (PCR-RFLP). Foram realizadas extrações de DNA do tecido de 36 amostras de suínos. Após, as amostras foram submetidas a um teste utilizando a metodologia convencional de PCR-RFLP; os resultados foram analisados e armazenados. Para a metodologia de discriminação alélica, foi utilizada a técnica de PCR em tempo real (qPCR), na qual foram desenhados dois primers e duas sondas Taqman® (Life Technologies), uma para o alelo C e outra para o alelo T. As reações de qPCR foram realizadas em equipamento 7500SDS (Applied Biosystems) utilizando para uma reação final de 15 µL: Mastermix TaqMan® Genotyping Master Mix na concentração final 1X; 0,75 µL de ensaio 20x do HAL (Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays), contendo sondas e primers simultaneamente); 1 µL de DNA (25 ng/µL) e água deionizada livre de DNAses e RNAses para completar a reação. Ela foi colocada no equipamento de PCR Tempo Real com a ciclagem: 50 ºC por 2 minutos; e 40 ciclos de 95 ºC por 15 segundos e 60 ºC por 1 minuto. Para verificar a especificidade do teste, as mesmas amostras genotipadas para o teste clássico de PCR-RFLP foram utilizadas nos ensaios de qPCR. Das 36 amostras genotipadas por qPCR, foram observados os 3 genótipos possíveis (animais normais, portadores e afetados), demonstrando especificidade das sondas. Além disso, quando os genótipos encontrados pelas duas metodologias foram comparados, houve uma concordância de 100% entre os dois testes. Dessa maneira, pode-se concluir que o teste utilizando a tecnologia de sondas Taqman® e de PCR em tempo real pode substituir a técnica PCR-RFLP no diagnóstico do gene do halotano em suínos, por possuir a mesma precisão e eficiência que a antiga técnica empregada e em um menor período de tempo.Palavras-chave: Halotano. Suínos. Taqman®

Association between insulin-like growth factor I (IGF-I) microsatellite polymorphisms and important economic traits in pigs

This study investigated the association between IGF-I microsatellite marker in an F2 population (N=459) generated by mating of native boars to Brazilian commercial sows with performance, carcass cut, and meat quality traits. Association analyses were carried out using a statistical model that included genotype, sex, and group as fixed effects and sire as random effect. The IGF-I genotypes were significantly associated with different quantitative traits and these results corroborate with previous QTL analyses obtained for this chromosome region in swine. Additive and dominance effects, as well as a genotype-sex interaction, were estimated and discussed in the text. According to the results obtained, this marker is suitable for QTL search in the genotyped population

Identification of endogenous normalizing genes for expression studies in inguinal ring tissue for scrotal hernias in pigs.

The use of reference genes is required for relative quantification in gene expression analysis and since the stability of these genes could be variable depending on the experimental design, it has become indispensable to test the reliability of endogenous genes. Therefore, this study evaluated 10 reference candidate genes in two different experimental conditions in order to obtain stable genes to be used as reference in expression studies related to scrotal hernias in pigs. Two independent experiments were performed: one with 30 days-old MS115 pigs and the other with 60 days-old Landrace pigs. The inguinal ring/canal was collected, frozen and further submitted to real-time PCR analysis (qPCR). For the reference genes stability evaluation, four tools were used: GeNorm in the SLqPCR, BestKeeper, NormFinder and Comparative CT. A general ranking was generated using the BruteAggreg function of R environment. In this study, the RPL19 was one of the most reliable endogenous genes for both experiments. The breed/age effects influenced the expression stability of candidate reference genes evaluated in the inguinal ring of pigs. Therefore, this study reinforces the importance of evaluating the stability of several endogenous genes previous their use, since a consensual set of reference genes is not easily obtained. Here, two sets of genes are recommended: RPL19, RPL32 and H3F3A for 30-days MS115 and PPIA and RPL19 for the 60 days-old Landrace pigs. This is the first study using the inguinal ring tissue and the results can be useful as an indicative for other studies working with gene expression in this tissue