Die enzymatische und chemische Vernetzung von Thymosin β4 mit Proteinen. Charakterisierung der Vernetzung und Auswirkung auf die biologischen Funktionen von Thymosin β4

Investigations on putative intracellular and extracellular interaction partners of thymosin β4 were carried out within this thesis. While the intracellular interaction between thymosin β4 and G-actin is well established, it was possible to localize the interaction site using the cross linker 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and HPLC-ESI-MS: Thymosin β4 binds in an extended conformation to the subdomains 1 to 3 of G-actin. After the release of thymosin β4 from cells, extracellular interactions are also possible. To analyze the release mechanism in more detail, the membranes of Jurkat cells were challenged with different harmful stimuli. The concomitant release of thymosin β4 and lactate dehydrogenase indentified cell death as prerequisite for the release of thymosin β4. One extracellular interaction partner of thymosin β4 is factor XIIIa (transglutaminase), which is known to catalyze the crosslinking reaction of thymosin β4 to fibrin. To identify further candidates for the crosslinking of thymosin β4 a modified ELISA was used. Apart from the known substrates collagen, fibrin and fibrinogen another protein, fibronectin, was found to react with thymosin β4 catalyzed by transglutaminase. The crosslinking reactions were carried out using a microbial transglutaminase. HPLC-ESI-MS-analyses identified thymosin β4 both as glutaminyl and amine substrate of the microbial transglutaminase. The lysine-rich central part as well as Q39 in the C-terminal region of thymosin β4 were involved in the crosslinking reaction. The effect of the crosslinking of thymosin β4 on its biological activities was analyzed in a wound healing assay using hepatic stellate cells. The crosslinking of thymosin β4 led to the loss of its inhibitory activity on PDGF-induced migration of the cells. Based on this finding, the interaction between thymosin β4 and PDGF was further investigated. Chemical crosslinking using EDC confirmed the interaction and identified PDGF as a new putative extracellular interaction partner of thymosin β4.Im Rahmen dieser Arbeit wurden intrazelluläre und extrazelluläre Interaktionsmöglichkeiten von Thymosin β4 (Tβ4) untersucht. Die intrazelluläre Interaktion zwischen Tβ4 und Aktin ist in der Literatur bereits vielfach beschrieben wurden. Durch chemische Vernetzung mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und HPLC-ESI-MS konnte in dieser Arbeit die Interaktion lokalisiert werden: Tβ4 maskiert G-Aktin in einer gestreckten Konformation an den Subdomänen 1 bis 3. Die Untersuchungen von extrazellulären Interaktionen von Tβ4 setzten dessen Freisetzung aus Zellen voraus. Der Freisetzungsmechanismus wurde an Jurkatzellen nach Zellmembranschädigung durch verschiedene Noxen untersucht. Durch gleichzeitige Bestimmung der Freisetzung von Lactatdehydrogenase als Marker für Zelltoxizität konnte nachgewiesen werden, dass Tβ4 erst nach Verlust der Integrität der Zellmembran freigesetzt wird. Ein bekannter extrazellulärer Interaktionspartner von Tβ4 ist Faktor XIIIa (Transglutaminase), der Tβ4 im Rahmen der Blutgerinnungskaskade an Fibrin binden kann. Mittels eines modifizierten ELISAs wurde nach weiteren Substratpartnern für diese enzymatische Vernetzungsreaktion gesucht. Neben Kollagen, Fibrinogen und Fibrin konnte zusätzlich Fibronektin als neuer Substratpartner zur Vernetzung von Tβ4 mittels Transglutaminase identifiziert werden. Die Vernetzungsreaktionen wurden dabei mit einer mikrobiellen Transglutaminase (mTGA) durchgeführt. Durch HPLC-ESI-MS-Analyse der Vernetzungsprodukte konnte Tβ4 sowohl als Glutaminyl-, als auch als Lysylsubstrat der mTGA identifiziert werden. Sowohl die lysinreiche zentrale Region als auch Q39 in der C-terminalen Region von Tβ4 waren an der enzymatischen Vernetzungsreaktion beteiligt. Die Auswirkung der enzymatischen Vernetzung auf die biologischen Effekte von Tβ4 wurde in einem Wundheilungs-Assay mit hepatischen Sternzellen bestimmt. Die Vernetzung von Tβ4 führte dabei zum Verlust seiner inhibitorischen Wirkung auf die PDGF-induzierte Migration der Zellen. Aus dieser Erkenntnis heraus wurde eine mögliche extrazelluläre Interaktion zwischen Tβ4 und PDGF untersucht. Durch chemische Vernetzung mit EDC konnte diese bestätigt werden. PDGF ist damit ein potentieller extrazellulärer Interaktionspartner von Tβ4

Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition)

The third edition of Flow Cytometry Guidelines provides the key aspects to consider when performing flow cytometry experiments and includes comprehensive sections describing phenotypes and functional assays of all major human and murine immune cell subsets. Notably, the Guidelines contain helpful tables highlighting phenotypes and key differences between human and murine cells. Another useful feature of this edition is the flow cytometry analysis of clinical samples with examples of flow cytometry applications in the context of autoimmune diseases, cancers as well as acute and chronic infectious diseases. Furthermore, there are sections detailing tips, tricks and pitfalls to avoid. All sections are written and peer‐reviewed by leading flow cytometry experts and immunologists, making this edition an essential and state‐of‐the‐art handbook for basic and clinical researchers.DFG, 389687267, Kompartimentalisierung, Aufrechterhaltung und Reaktivierung humaner Gedächtnis-T-Lymphozyten aus Knochenmark und peripherem BlutDFG, 80750187, SFB 841: Leberentzündungen: Infektion, Immunregulation und KonsequenzenEC/H2020/800924/EU/International Cancer Research Fellowships - 2/iCARE-2DFG, 252623821, Die Rolle von follikulären T-Helferzellen in T-Helferzell-Differenzierung, Funktion und PlastizitätDFG, 390873048, EXC 2151: ImmunoSensation2 - the immune sensory syste

The enzymatic and chemical cross-linking of thymosin β4 with proteins. Characterisation of the cross-linking reaction and influence on the biological effects of thymosin β4

Im Rahmen dieser Arbeit wurden intrazelluläre und extrazelluläre Interaktionsmöglichkeiten von Thymosin β4 (Tβ4) untersucht. Die intrazelluläre Interaktion zwischen Tβ4 und Aktin ist in der Literatur bereits vielfach beschrieben wurden. Durch chemische Vernetzung mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und HPLC-ESI-MS konnte in dieser Arbeit die Interaktion lokalisiert werden: Tβ4 maskiert G-Aktin in einer gestreckten Konformation an den Subdomänen 1 bis 3. Die Untersuchungen von extrazellulären Interaktionen von Tβ4 setzten dessen Freisetzung aus Zellen voraus. Der Freisetzungsmechanismus wurde an Jurkatzellen nach Zellmembranschädigung durch verschiedene Noxen untersucht. Durch gleichzeitige Bestimmung der Freisetzung von Lactatdehydrogenase als Marker für Zelltoxizität konnte nachgewiesen werden, dass Tβ4 erst nach Verlust der Integrität der Zellmembran freigesetzt wird. Ein bekannter extrazellulärer Interaktionspartner von Tβ4 ist Faktor XIIIa (Transglutaminase), der Tβ4 im Rahmen der Blutgerinnungskaskade an Fibrin binden kann. Mittels eines modifizierten ELISAs wurde nach weiteren Substratpartnern für diese enzymatische Vernetzungsreaktion gesucht. Neben Kollagen, Fibrinogen und Fibrin konnte zusätzlich Fibronektin als neuer Substratpartner zur Vernetzung von Tβ4 mittels Transglutaminase identifiziert werden. Die Vernetzungsreaktionen wurden dabei mit einer mikrobiellen Transglutaminase (mTGA) durchgeführt. Durch HPLC-ESI-MS-Analyse der Vernetzungsprodukte konnte Tβ4 sowohl als Glutaminyl-, als auch als Lysylsubstrat der mTGA identifiziert werden. Sowohl die lysinreiche zentrale Region als auch Q39 in der C-terminalen Region von Tβ4 waren an der enzymatischen Vernetzungsreaktion beteiligt. Die Auswirkung der enzymatischen Vernetzung auf die biologischen Effekte von Tβ4 wurde in einem Wundheilungs-Assay mit hepatischen Sternzellen bestimmt. Die Vernetzung von Tβ4 führte dabei zum Verlust seiner inhibitorischen Wirkung auf die PDGF-induzierte Migration der Zellen. Aus dieser Erkenntnis heraus wurde eine mögliche extrazelluläre Interaktion zwischen Tβ4 und PDGF untersucht. Durch chemische Vernetzung mit EDC konnte diese bestätigt werden. PDGF ist damit ein potentieller extrazellulärer Interaktionspartner von Tβ4.Investigations on putative intracellular and extracellular interaction partners of thymosin β4 were carried out within this thesis. While the intracellular interaction between thymosin β4 and G-actin is well established, it was possible to localize the interaction site using the cross linker 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and HPLC-ESI-MS: Thymosin β4 binds in an extended conformation to the subdomains 1 to 3 of G-actin. After the release of thymosin β4 from cells, extracellular interactions are also possible. To analyze the release mechanism in more detail, the membranes of Jurkat cells were challenged with different harmful stimuli. The concomitant release of thymosin β4 and lactate dehydrogenase indentified cell death as prerequisite for the release of thymosin β4. One extracellular interaction partner of thymosin β4 is factor XIIIa (transglutaminase), which is known to catalyze the crosslinking reaction of thymosin β4 to fibrin. To identify further candidates for the crosslinking of thymosin β4 a modified ELISA was used. Apart from the known substrates collagen, fibrin and fibrinogen another protein, fibronectin, was found to react with thymosin β4 catalyzed by transglutaminase. The crosslinking reactions were carried out using a microbial transglutaminase. HPLC-ESI-MS-analyses identified thymosin β4 both as glutaminyl and amine substrate of the microbial transglutaminase. The lysine-rich central part as well as Q39 in the C-terminal region of thymosin β4 were involved in the crosslinking reaction. The effect of the crosslinking of thymosin β4 on its biological activities was analyzed in a wound healing assay using hepatic stellate cells. The crosslinking of thymosin β4 led to the loss of its inhibitory activity on PDGF-induced migration of the cells. Based on this finding, the interaction between thymosin β4 and PDGF was further investigated. Chemical crosslinking using EDC confirmed the interaction and identified PDGF as a new putative extracellular interaction partner of thymosin β4

Inhibitory Effects of Green Tea and (-)-Epigallocatechin Gallate on Transport by OATP1B1, OATP1B3, OCT1, OCT2, MATE1, MATE2-K and P-Glycoprotein.

Green tea catechins inhibit the function of organic anion transporting polypeptides (OATPs) that mediate the uptake of a diverse group of drugs and endogenous compounds into cells. The present study was aimed at investigating the effect of green tea and its most abundant catechin epigallocatechin gallate (EGCG) on the transport activity of several drug transporters expressed in enterocytes, hepatocytes and renal proximal tubular cells such as OATPs, organic cation transporters (OCTs), multidrug and toxin extrusion proteins (MATEs), and P-glycoprotein (P-gp). Uptake of the typical substrates metformin for OCTs and MATEs and bromosulphophthalein (BSP) and atorvastatin for OATPs was measured in the absence and presence of a commercially available green tea and EGCG. Transcellular transport of digoxin, a typical substrate of P-gp, was measured over 4 hours in the absence and presence of green tea or EGCG in Caco-2 cell monolayers. OCT1-, OCT2-, MATE1- and MATE2-K-mediated metformin uptake was significantly reduced in the presence of green tea and EGCG (P < 0.05). BSP net uptake by OATP1B1 and OATP1B3 was inhibited by green tea [IC50 2.6% (v/v) and 0.39% (v/v), respectively]. Green tea also inhibited OATP1B1- and OATP1B3-mediated atorvastatin net uptake with IC50 values of 1.9% (v/v) and 1.0% (v/v), respectively. Basolateral to apical transport of digoxin was significantly decreased in the presence of green tea and EGCG. These findings indicate that green tea and EGCG inhibit multiple drug transporters in vitro. Further studies are necessary to investigate the effects of green tea on prototoypical substrates of these transporters in humans, in particular on substrates of hepatic uptake transporters (e.g. statins) as well as on P-glycoprotein substrates

Offline time is quality time: comparing within-group self-disclosure in mobile messaging applications and face-to-face interactions

In contrast to the prominent individualistic view on self-disclosure, this study focuses on self-disclosure in groups of prior acquaintances that both meet offline and communicate online. It compares within-group self-disclosure between offline face-to-face (FtF) interactions and online communication via mobile messaging applications (MMAs). An online-survey (N = 357) was conducted to test for differences between within-group self-disclosure online and offline across four dimensions (amount, depth, breadth, valence). The results show that there is more amount, more breadth and more depth for offline within-group self-disclosure, but it is less positively valenced than online within-group self-disclosure. Interestingly, the mere frequency of communication is higher in an MMA environment. In spite of the permanent availability of the online communication sphere, group members do not permanently disclose personal information to each other online. Thus, for within-group self-disclosure, offline time seems quality time

Effect of green tea and EGCG on transepithelial transport of digoxin across Caco-2 monolayers.

<p>Digoxin (5 μM) was applied to the basal or apical compartment, and percentage of digoxin transported in the opposite compartment at defined time points was measured. Experiments were conducted in the absence of an inhibitor (top) or in the presence of green tea (1% (v/v) and 10%), EGCG (1 μM) or the P-glycoprotein inhibitor zosuquidar (1 μM). Data are expressed as mean ± S.E.M. A-B apical to basal translocation, B-A basal to apical translocation; **/⁺⁺ p<0.01, ***/⁺⁺⁺ p<0.001 vs. corresponding control without inhibitor.</p

Effect of EGCG on OATP1B1- and OATP1B3-mediated BSP and atorvastatin transport.

<p>Data are shown as mean ± S.E.M. *** p< 0.001, ** p<0.01, * p<0.05 vs. VC, + p<0.05, +++ p<0.001 vs. corresponding transport without inhibitor.</p

Effect of green tea on OATP1B1- and OATP1B3-mediated BSP and atorvastatin net transport.

<p>Data are shown as mean net uptake ± S.E.M. VC vector control.</p