Die enzymatische und chemische Vernetzung von Thymosin β4 mit Proteinen. Charakterisierung der Vernetzung und Auswirkung auf die biologischen Funktionen von Thymosin β4
Investigations on putative intracellular and extracellular interaction partners of thymosin β4 were carried out within this thesis. While the intracellular interaction between thymosin β4 and G-actin is well established, it was possible to localize the interaction site using the cross linker 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and HPLC-ESI-MS: Thymosin β4 binds in an extended conformation to the subdomains 1 to 3 of G-actin. After the release of thymosin β4 from cells, extracellular interactions are also possible. To analyze the release mechanism in more detail, the membranes of Jurkat cells were challenged with different harmful stimuli. The concomitant release of thymosin β4 and lactate dehydrogenase indentified cell death as prerequisite for the release of thymosin β4. One extracellular interaction partner of thymosin β4 is factor XIIIa (transglutaminase), which is known to catalyze the crosslinking reaction of thymosin β4 to fibrin. To identify further candidates for the crosslinking of thymosin β4 a modified ELISA was used. Apart from the known substrates collagen, fibrin and fibrinogen another protein, fibronectin, was found to react with thymosin β4 catalyzed by transglutaminase. The crosslinking reactions were carried out using a microbial transglutaminase. HPLC-ESI-MS-analyses identified thymosin β4 both as glutaminyl and amine substrate of the microbial transglutaminase. The lysine-rich central part as well as Q39 in the C-terminal region of thymosin β4 were involved in the crosslinking reaction. The effect of the crosslinking of thymosin β4 on its biological activities was analyzed in a wound healing assay using hepatic stellate cells. The crosslinking of thymosin β4 led to the loss of its inhibitory activity on PDGF-induced migration of the cells. Based on this finding, the interaction between thymosin β4 and PDGF was further investigated. Chemical crosslinking using EDC confirmed the interaction and identified PDGF as a new putative extracellular interaction partner of thymosin β4.Im Rahmen dieser Arbeit wurden intrazelluläre und extrazelluläre Interaktionsmöglichkeiten von Thymosin β4 (Tβ4) untersucht. Die intrazelluläre Interaktion zwischen Tβ4 und Aktin ist in der Literatur bereits vielfach beschrieben wurden. Durch chemische Vernetzung mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und HPLC-ESI-MS konnte in dieser Arbeit die Interaktion lokalisiert werden: Tβ4 maskiert G-Aktin in einer gestreckten Konformation an den Subdomänen 1 bis 3. Die Untersuchungen von extrazellulären Interaktionen von Tβ4 setzten dessen Freisetzung aus Zellen voraus. Der Freisetzungsmechanismus wurde an Jurkatzellen nach Zellmembranschädigung durch verschiedene Noxen untersucht. Durch gleichzeitige Bestimmung der Freisetzung von Lactatdehydrogenase als Marker für Zelltoxizität konnte nachgewiesen werden, dass Tβ4 erst nach Verlust der Integrität der Zellmembran freigesetzt wird. Ein bekannter extrazellulärer Interaktionspartner von Tβ4 ist Faktor XIIIa (Transglutaminase), der Tβ4 im Rahmen der Blutgerinnungskaskade an Fibrin binden kann. Mittels eines modifizierten ELISAs wurde nach weiteren Substratpartnern für diese enzymatische Vernetzungsreaktion gesucht. Neben Kollagen, Fibrinogen und Fibrin konnte zusätzlich Fibronektin als neuer Substratpartner zur Vernetzung von Tβ4 mittels Transglutaminase identifiziert werden. Die Vernetzungsreaktionen wurden dabei mit einer mikrobiellen Transglutaminase (mTGA) durchgeführt. Durch HPLC-ESI-MS-Analyse der Vernetzungsprodukte konnte Tβ4 sowohl als Glutaminyl-, als auch als Lysylsubstrat der mTGA identifiziert werden. Sowohl die lysinreiche zentrale Region als auch Q39 in der C-terminalen Region von Tβ4 waren an der enzymatischen Vernetzungsreaktion beteiligt. Die Auswirkung der enzymatischen Vernetzung auf die biologischen Effekte von Tβ4 wurde in einem Wundheilungs-Assay mit hepatischen Sternzellen bestimmt. Die Vernetzung von Tβ4 führte dabei zum Verlust seiner inhibitorischen Wirkung auf die PDGF-induzierte Migration der Zellen. Aus dieser Erkenntnis heraus wurde eine mögliche extrazelluläre Interaktion zwischen Tβ4 und PDGF untersucht. Durch chemische Vernetzung mit EDC konnte diese bestätigt werden. PDGF ist damit ein potentieller extrazellulärer Interaktionspartner von Tβ4
