Experimental verification and functional exploration of intrasplicing

Seitdem die Introns unerwarteter weise entdeckt worden sind, ist unser Verständnis über den Spleißgprozess ständig gewachsen. Das jetzige Model suggeriert dass das Spleißeosom den sogenannten branch point, die 5‘ und 3‘ Spleißstelle erkennt und das Intron in einem Stück rausschneidet. Wir versuchen dieses Model zu hinterfragen und behaupten dass Introns, zumindest einige, eine viel dynamischere Spleißstellen Selektion zeigen, zahllose Transkripte produzieren, wobei nicht alle für den Export und die Translation bestimmt sind. Zurzeit gibt es zwei unkonventionelle Spleißmodele, nämlich das genestete und rekursive Spleißen, die wir beide als Intrasplicing bezeichnen. Jüngste Publikationen fokussieren sich an das Intrasplicing in langen Introns, doch unsere Daten suggerieren dass kurze Introns auch auf diese Weise gespleißt werden können. Die Analyse identifizierte mehr als 12 000 einzelne Intrasplicing Vorkommnisse im Menschen und diese Arbeit befasst sich mit der experimentellen Verifizierung solcher Vorkommnisse in unterschiedlichen Zelllinien, dass sich wegen der geringen Stabilität und der Abundanz der Lariate als herausfordernd rausstellte. Wir haben das Debranching Enzym dbr1 runterreguliert um die Stabilität und damit die Detektion der Lariate mittels der lariat PCR zu erhöhen. Wir haben auch die potentiale Funktionalität des Intrasplicing in einem Luziferase Reportersystem untersucht. Wir haben herausgefunden das Intrasplicing das rausschneiden des ganzen Introns beeinflussen kann und somit auch einen Einfluss auf die Transkriptmenge hat. Intrasplicing erhöht die Transkriptmenge als Teil einer rekursiver Spleißreaktion, kann aber auch den gegenteiligen Effekt haben und Transkripte produzieren die vom NMD aufgesucht werden wenn die Spleißstellen nach dem Intrasplicing nicht wieder hergestellt werden.Ever since the unexpected discovery of introns, our understanding of the splicing process has been constantly growing. The current model suggests that the spliceosome recognizes the branch point, 5' and 3' splice sites and removes the intron in one piece. We are trying to challenge this model by saying that introns, at least some of them, show a much more dynamic splice site selection, resulting in a number of transcripts, not all of which are intended for export and translation. Currently there are two unconventional splicing models, namely nested and recursive splicing, which we summarized as intrasplicing. Recent publications focused on intrasplicing in long introns, but our data suggests that short introns might be spliced in this way as well. Our analysis identified more than 12.000 distinct intrasplicing events happening in human and this thesis aims to verify them experimentally in different cell lines which can be challenging due the low stability and abundance of lariats. We performed a knock down of the lariat debranching enzyme dbr1 to increase the stability and thus detectability of lariats via lariat PCR. We also explored the potential functionality of intrasplicing in a luciferase reporter system. We found that nested splicing can stimulate or inhibit the removal of the whole intron, thus influencing the transcript abundance. Intrasplicing events increase the transcript abundance as a part of a potentially recursive splicing scheme but can have the opposite effect and generate NMD targeted transcripts, if the splice sites are not reconstituted after the removal of the nested intron

The Bicarbonate Transporter SLC4A7 Plays a Key Role in Macrophage Phagosome Acidification

Macrophages represent the first line of immune defense against pathogens, and phagosome acidification is a necessary step in pathogen clearance. Here, we identified the bicarbonate transporter SLC4A7, which is strongly induced upon macrophage differentiation, as critical for phagosome acidification. Loss of SLC4A7 reduced acidification of phagocytosed beads or bacteria and impaired the intracellular microbicidal capacity in human macrophage cell lines. The phenotype was rescued by wild-type SLC4A7, but not by SLC4A7 mutants, affecting transport capacity or cell surface localization. Loss of SLC4A7 resulted in increased cytoplasmic acidification during phagocytosis, suggesting that SLC4A7-mediated, bicarbonate-driven maintenance of cytoplasmic pH is necessary for phagosome acidification. Altogether, we identify SLC4A7 and bicarbonate-driven cytoplasmic pH homeostasis as an important element of phagocytosis and the associated microbicidal functions in macrophages