Cebadores, sondas y kits para la detección de especies bacterianas que pertenecen al género Rickettsia

Un par de cebadores que tienen un cebador que comprende SEQ ID NO: 36 y un cebador que comprende SEQ ID NO: 37, y capaces de amplificar SEQ ID NO: 55, 56, 82-93 de especies bacterianas que provocan zoonosis, que pertenecen al género Rickettsia.REIVINDICACIONES: 1. Un par de cebadores que tienen un cebador que comprende SEQ ID NO: 36 y un cebador que comprende SEQ ID NO: 37, y capaces de amplificar SEQ ID NO: 55, 56, 82-93 de especies bacterianas que provocan zoonosis, que pertenecen al género Rickettsia. 2. El par de cebadores de acuerdo con la reivindicación 1 que tienen la secuencia SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37. 3. Sonda que consiste en la secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 38-51, y capaz de hibridar con SEQ ID NO: 55, 56, 82-93 de especies bacterianas que provocan zoonosis, que pertenecen al género Rickettsia. 4. Un kit que comprende el par de cebadores de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2. 5. El kit de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende además los cebadores SEQ ID NO: 52 y SEQ ID 53. 6. Un kit que comprende la sonda de acuerdo con la reivindicación 3. 7. El kit de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende además la sonda SEQ ID NO: 54.Cuando una patente se hace internacional, se puede encontrar en el idioma de cada país en que se ha solicitado. En Espacenet se tiene acceso a los documentos en cada idioma.Instituto de Salud Carlos IIITraducción de patente europe

Método y kit de detección de especies bacterianas mediante análisis de ADN

Método y kit de detección de especies bacterianas mediante análisis de ADN. La presente invención se refiere a la detección e identificación de diferentes especies bacterianas por PCR múltiple. Más concretamente, el método proporciona los cebadores, las sondas, las regiones génicas o regiones intergénicas necesarias para llevar a cabo la detección simultánea de especies bacterias y grupos bacterianos pertenecientes a los géneros Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia y Francisella por PCR múltiple.REIVINDICACIONES: 1. Método para la detección simultanea de especies bacterianas causantes de zoonosis pertenecientes a los géneros: Anaplasma, Ehrlichia, Bartonella, Borrelia, Coxiella, Francisella y Rickettsia que comprende: a. Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción que comprenda cebadores específicos que amplifiquen las secuencias: SEQ ID 55-93. b. Amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa. c. Identificar la formación de productos del paso anterior, siendo dicha formación indicativa de la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis. 2. Método según la reivindicación 1 donde las especies bacterianas detectadas son: a. Anaplasma phagocytophilum, A. bovis, A. equi, A. marginale, A. centrale y A. ovis. b. Ehrlichia chaffeensis y E. ewingii. c. Bartonella henselae, B. quintana, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B. grahamii, B. vinsonii subespecie berkhofii, B. vinsonii subespecie vinsonii, B. vnisonii subespecie arupensis, B. bacilliformis, B. alsatica, B. bovis, B. doshiae, B. koehlerae, B. schoenbuchensis, B. taylori y B. tribocorum. d. Especies del género Borrelia. e. Coxiella burnetii. f. Francisella turalensis subesp. holarctica y F. tularensis subesp. novicida, la variante 3523 de Francisella turalensis y el grupo endosimbionte de Francisella. g. Especies causantes de las fiebres manchadas y el grupo causante del tifus, las especies Rickettsia akari, R. bellii, R. slovaca, R. conorii, R. aeschlimannii, R. ricketsii, R. sibirica, R. helvetica, R. felis, R. australis, R. prowazekii, y R. typhy. 3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los cebadores comprenden las secuencias SEQ ID 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36, 37. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la detección simultanea de los productos de amplificación se realiza mediante sondas que comprenden las secuencias SEQ ID 3-6, 9-24, 27, 30, 33-35, 38-51. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende al menos un control de amplificación interno. 6. Método según la reivindicación 5, en donde el control de amplificación interno comprende: a. La amplificación de la SEQ ID 94 con cebadores específicos. b. Detección de la formación del producto de amplificación del paso anterior. 7. Método según la reivindicación 6, en donde los cebadores específicos tienen las secuencias 52 y 53. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde la detección del producto de amplificación es llevada a cabo mediante la sonda de SEQ ID 54. 9. Cebadores de SEQ ID 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36 y 37, caracterizados porque son capaces de amplificar las secuencias definidas según la reivindicación 1. 10. Cebador de SEQ ID 52 y 53, caracterizados porque son capaces de amplificar la secuencia definida según la reivindicación 6. 11. Sondas de secuencia SEQ ID 3-6, 9-24, 27, 30, 33-35 y 38-51, caracterizadas porque son capaces de hibridar con las secuencias definidas según la reivindicación 1. 12. Sonda de SEQ ID 54, caracterizada porque es capaz de hibridar con la secuencia definida según la reivindicación 8. 13. Kit de diagnostico capaz de llevar a cabo el método según las reivindicaciones 1 a 8. 14. Kit según la reivindicación anterior que comprende cebadores según las reivindicaciones 9 y 10. 15. Kit según la reivindicación anterior que comprende sondas según las reivindicaciones 11 y 12. Cuando una patente se hace internacional, se puede encontrar en el idioma de cada país en que se ha solicitado. En Espacenet se tiene acceso a los documentos en cada idioma.Instituto de Salud Carlos IIISolicitud de patent

Cebadores, sondas y kits para la detección de especies bacterianas que pertenecen al género Bartonella

Un par de cebadores que tienen un cebador que consiste en la SEQ ID NO: 7 y un cebador que consiste en la SEQ ID NO: 8, y capaces de amplificar SEQ ID NO: 61-76 de especies bacterianas que provocan zoonosis, que pertenecen al género Bartonella.REIVINDICACIONES: 1. Un par de cebadores que tienen un cebador que consiste en la SEQ ID NO: 7 y un cebador que consiste en la SEQ ID NO: 8, y capaces de amplificar SEQ ID NO: 61-76 de especies bacterianas que provocan zoonosis, que pertenecen al género Bartonella. 2. Sonda que consiste en una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 9-24, y capaz de hibridarcon SEQ ID NO: 61- 76 de especies bacterianas que provocan zoonosis, que pertenecen al género Bartonella. 3. Kit que comprende el par de cebadores de acuerdo con la reivindicación 1. 4. Kit de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además los cebadores SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 53. 5. Kit que comprende la sonda de acuerdo con la reivindicación 2. 6. Kit de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además la sonda SEQ ID NO: 54.Cuando una patente se hace internacional, se puede encontrar en el idioma de cada país en que se ha solicitado. En Espacenet se tiene acceso a los documentos en cada idioma.Instituto de Salud Carlos IIITraducción de patente europe

Método para la detección de especies bacterianas de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella

Método para la identificación simultánea y específica de bacterias causantes de zoonosis, pertenecientes a los géneros Anaplasma/ Ehrlichia y al género Bartonella, que comprende las siguientes etapas: a. Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción que contenga cebadores que amplifiquen de forma específica las secuencias SEQ ID NO: 1-7 de las especies de Anaplasma/Ehrlichia y las secuencias SEQ ID NO: 8-17 de especies de Bartonella, o sus respectivas secuencias complementarias, b. Amplificar de manera simultánea las secuencias de la etapa (a) mediante reacción en cadena de la polimerasa, c. Identificar las secuencias amplificadas de la etapa (b) usando las sondas que consisten en las SEQ ID NO: 26-42, o sus secuencias complementarias, para hibridar con las secuencias SEQ ID NO 1-17, y d. Detectar la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis asociando las secuencias identificadas de la etapa (c) con una especie bacteriana que pertenece a los géneros Anaplasma/Ehrlichia o al género Bartonella, en el que las especies bacterianas que pertenecen a los géneros Anaplasma/Ehrlichia se seleccionan de la lista que consiste en A. phagocytophilum, E. ruminantium, E, sennetsu, E. risticii, E. muris, A. platys, E. canis y E. Ovina.REIVINDICACIONES: 1. Método para la identificación simultánea y específica de bacterias causantes de zoonosis, pertenecientes a los géneros Anaplasma/ Ehrlichia y al género Bartonella, que comprende las siguientes etapas: a. Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción que contenga cebadores que amplifiquen de forma específica las secuencias SEQ ID NO: 1-7 de las especies de Anaplasma/Ehrlichia y las secuencias SEQ ID NO: 8-17 de especies de Bartonella, o sus respectivas secuencias complementarias, b. Amplificar de manera simultánea las secuencias de la etapa (a) mediante reacción en cadena de la polimerasa, c. Identificar las secuencias amplificadas de la etapa (b) usando las sondas que consisten en las SEQ ID NO: 26-42, o sus secuencias complementarias, para hibridar con las secuencias SEQ ID NO 1-17, y d. Detectar la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis asociando las secuencias identificadas de la etapa (c) con una especie bacteriana que pertenece a los géneros Anaplasma/Ehrlichia o al género Bartonella, en el que las especies bacterianas que pertenecen a los géneros Anaplasma/Ehrlichia se seleccionan de la lista que consiste en A. phagocytophilum, E. ruminantium, E, sennetsu, E. risticii, E. muris, A. platys, E. canis y E. Ovina. 2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los cebadores comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 18-25 o sus secuencias complementarias. 3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que además comprende los cebadores con secuencia SEQ ID NO: 51-52 para amplificar el control interno de amplificación del gen de THC sintasa de Cannabis sativa. 4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que las sondas de la etapa (c) comprenden adicionalmente la sonda con secuencia SEQ ID NO: 50, capaz de hibridar con la secuencia SEQ ID NO: 49 del control de amplificación interno. 5. Sondas, cuya secuencia consiste en las SEQ ID NO: 26-32 de las especies de Anaplasma/Ehrlichia A. phagocytophilum, E. ruminantium, E, sennetsu, E. risticii, E. muris, A. platys, E. canis y E. ovina, y las secuencias SEQ ID NO: 33-42 de especies de Bartonella, o sus secuencias complementarias, siendo capaces dichas sondas de hibridar con las secuencias SEQ ID NO: 1-17 y/o con sus secuencias complementarias respectivas. 6. Un kit que comprende las sondas de acuerdo con la reivindicación 5. 7. El kit de acuerdo con la reivindicación 6, que además comprende los cebadores con secuencias SEQ ID NO: 1825. 8. Un uso del kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, para la identificación simultánea y específica de bacterias causantes de zoonosis que pertenecen a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y al género Bartonella, en donde las especies bacterianas del género Anaplasma/Ehrlichia se seleccionan de la lista que consiste en A. phagocytophilum, E. ruminantium, E. sennetsu, E. risticii, E. muris, A. platys, E. canis y E. ovinaCuando una patente se hace internacional, se puede encontrar en el idioma de cada país en que se ha solicitado. En Espacenet se tiene acceso a los documentos en cada idioma.Instituto de Salud Carlos IIITraducción de patente europe

Método de identificación de especies bacterianas de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella.

Método de identificación de especies bacterianas de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella. La presente invención, referida a un método de detección e identificación de las especies bacterianas pertenecientes a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella. Junto con este método, la invención también proporciona los cebadores y sondas necesarios para llevarlo a caboReivindicaciones disponibles del expediente: 1. Método para la detección simultánea de especies bacterianas causantes de zoonosis, pertenecientes a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella, que comprende los siguientes pasos: a. Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción que comprenda cebadores específicos que amplifiquen las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO: 1-17 y 47 ó sus respectivas secuencias complementarias. b. Amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa. c. Identificar la formación de productos del paso anterior, siendo dicha formación indicativa de la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis. 2. Método para la detección simultánea de especies bacterianas según reivindicación 1, donde los cebadores consisten en las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:18-25 y sus secuencias complementarias. 3. Método para la detección simultánea de especies bacterianas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde la detección de los productos de amplificación se realiza mediante sondas que consisten en las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:26-42 y 48 y sus secuencias complementarias. 4. Cebadores cuya secuencia consiste en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:20-21 y sus secuencias complementarias, donde dichos cebadores permiten la amplificación de cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO: 2-7 y 47. 5. Cebadores cuya secuencia consiste en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:22-23 y sus secuencias complementarias, donde dichos cebadores permiten la amplificación de la secuencia que comprende la SEQ ID NO: 8. 6. Sondas cuya secuencia consiste en cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:26-42 y 48 y sus secuencias complementarias, donde dichas sondas son capaces de hibridar con las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:1-17 y 47 y su secuencias complementarias, según se indica en las tablas 2 y 3. 7. Kit de análisis capaz de llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 8. Kit según la reivindicación anterior que comprende cebadores según las reivindicaciones 4 y 5. 9. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 7-8 que comprende sondas según la reivindicaciones 6.Cuando una patente se hace internacional, se puede encontrar en el idioma de cada país en que se ha solicitado. En Espacenet se tiene acceso a los documentos en cada idioma.Instituto de Salud Carlos IIISolicitud de patent

Investigating the Role of Micromammals in the Ecology of Coxiella burnetii in Spain

Coxiella burnetii, the causal agent of human Q fever and animal Coxiellosis, is a zoonotic infectious bacterium with a complex ecology that results from its ability to replicate in multiple (in)vertebrate host species. Spain notifies the highest number of Q fever cases to the ECDC annually and wildlife plays a relevant role in C. burnetii ecology in the country. However, the whole picture of C. burnetii hosts is incomplete, so this study seeks to better understand the role of micromammals in C. burnetii ecology in the country. Spleen samples from 816 micromammals of 10 species and 130 vaginal swabs from Microtus arvalis were analysed by qPCR to detect C. burnetii infection and shedding, respectively. The 9.7% of the spleen samples were qPCR positive. The highest infection prevalence (10.8%) was found in Microtus arvalis, in which C. burnetii DNA was also detected in 1 of the 130 vaginal swabs (0.8%) analysed. Positive samples were also found in Apodemus sylvaticus (8.7%), Crocidura russula (7.7%) and Rattus rattus (6.4%). Positive samples were genotyped by coupling PCR with reverse line blotting and a genotype II+ strain was identified for the first time in one of the positive samples from M. arvalis, whereas only partial results could be obtained for the rest of the samples. Acute Q fever was diagnosed in one of the researchers that participated in the study, and it was presumably linked to M. arvalis handling. The results of the study are consistent with previous findings suggesting that micromammals can be infected by C. burnetii. Our findings additionally suggest that micromammals may be potential sources to trace back the origin of human Q fever and animal Coxiellosis cases in Europe.This work was supported by grants CGL2011-30274 and CGL2015-71255-P of the Spanish Ministry for the Science and Innovation (MCI), and by the ‘Fundación BBVA’ Research Project TOPIGEPLA (2014 call). This is also a contribution to MCI-funded projects CGL2017-89866-R and E-RTA-2015-0002-C02-02. D.G.-B. was funded by MCI through Juan de la Cierva (FJCI-2016-27875) and ‘Sara Borrell’ (CD19CIII/00011) postdoctoral fellowships. GREFA provided partial financial support and invaluable logistic and workforce support for samplings in NW Spain, along with many students and staff from UAM.S

Monitoring Coxiella burnetii Infection in Naturally Infected Dairy Sheep Flocks Throughout Four Lambing Seasons and Investigation of Viable Bacteria.

Progression of Coxiella burnetii infection in four naturally infected sheep flocks, and in their farm environment, was monitored throughout four lambing seasons. Flocks with an active infection were selected based on the presence of C. burnetii DNA in bulk-tank milk (BTM) and a high seroprevalence in yearlings during the previous milking period (Spring 2015). During four consecutive lambing seasons (2015/16-2018/19), samples were collected within 1 week after each lambing period from animals (vaginal swabs, milk and feces from ewes, and yearlings) and the environment (dust indoor sheep premises). BTM samples and aerosols (outdoors and indoors) were monthly collected between lambing and the end of milking. Real-time PCR analyses showed different trends in C. burnetii shedding in the flocks, with a general progressive decrease in bacterial shedding throughout the years, interrupted in three flocks by peaks of reinfection associated with specific management practices. A significant relationship was found between C. burnetii fecal shedding and the bacterial burden detected in dust, whereas shedding by vaginal route affected the detection of C. burnetii in indoor aerosols. Three genotypes were identified: SNP8 (three flocks, 52.9% of the samples), SNP1 (two flocks, 44.8% samples), and SNP5 (one flock, two environmental samples). Coxiella burnetii viability in dust measured by culture in Vero cells was demonstrated in two of the flocks, even during the fourth lambing season. The results showed that infection can remain active for over 5 years if effective control and biosafety measures are not correctly implemented.This work was funded by INIA—Spanish National Institute for Agricultural and Food Research and Technology (RTA2017-00055-C02-00), the European Regional Development Funds (ERDF), and the Basque Government. RÁ-A is beneficiary of a Ph.D. contract funded by INIA (FPI-2015-014). The funders had no role in the study design, data collection and interpretation, or the decision to submit the work for publication.S

Rickettsia monacensis and Human Disease, Spain

We identified Rickettsia monacensis as a cause of acute tickborne rickettsiosis in 2 humans. Its pathogenic role was assessed by culture and detection of the organism in patients’ blood samples. This finding increases the number of recognized human rickettsial pathogens and expands the known geographic distribution of Mediterranean spotted fever–like cases

Zoonotic pathogens in fluctuating common vole (Microtus arvalis) populations : occurrence and dynamics

Supplementary material. The supplementary material for this article can be found at https://doi.org/10.1017/S0031182018001543 Acknowledgements. We thank José Luis Guzman for helping with fieldwork and Fabio Flechoso for helping with ectoparasite counts and flea identification. Financial support. R.R.P. was supported by a Ph.D.-studentship from the University of Valladolid (co-funded by Banco Santander, RR 30/04/2014). This work was supported by ECOCYCLES (Partner 5 –EUI2008-03658), ECOVOLE (CGL2012-35348), ECOTULA (CGL2015-66962-C2-1-R) and RESERTULA (CLG2015-66962-C2-2-R) projects funded by Ministerio de Economía y Competitividad, Government of Spain.Peer reviewedPostprin

A Q fever outbreak associated to courier transport of pets

On August 3rd, 2017, a Q fever outbreak alert was issued at a courier company that in addition to urgent freight transport offered pet delivery services. The epidemiological investigation set the exposition period between June 1 and August 8. In this period, 180 workers from two operational platforms for parcel distribution located in two provinces of the Basque Country (Bizkaia and Araba) were exposed; 64 filled a questionnaire and provided blood samples for serological testing, resulting in 10 confirmed cases (15.6%) and six (9.4%) probable cases. Nine workers (8 confirmed and 1 probable) showed Q fever symptoms, including pneumonia (five cases), and required medical care services, including one hospital admission. The attack rate was 25% (16/64), being higher among workers that visited the Bizkaia platform. This suggested that the origin of the outbreak was in the Bizkaia platform, where animals in transit waited at a pet holding site until being moved to their destination. Environmental samples consisting on 19 surface dust and two aerosol samples were collected at the Bizkaia platform to investigate the presence of C. burnetti DNA. All dust samples were positive by real time PCR, the lowest Ct values being found in dust collected at the pet holding facilities, and therefore suggesting that contamination originated at the pet holding site. The genotype identified in dust was SNP1/MST13, one of the most commonly identified genotypes in goats and sheep in the Basque Country. During the exposure period, two deliveries of miniature goats were made, of which only one could be investigated and tested negative. Although the contamination source could not be unequivocally identified, transport of ruminants was banned at the company, and Q fever was included among the occupational-associated health risks.This work was funded by the Spanish National Institute for Agricultural and Food Research and Technology (INIA) (RTA2017-00055-C02-00), the European Regional Development Funds (ERDF) and the Basque Government. RAA is beneficiary of a PhD contract funded by INIA (FPI-2015-014). The funders had no role in study design, data collection and interpretation, or the decision to submit the work for publication.S