Membrane properties of ceramide: a fluorescence spectroscopic and microscopic study

159 p.Las membranas biológicas son complejas estructuras con una base lipídica y cruciales para lasupervivencia y función de las células. La ceramida es un lípido de membrana con unas característicasfísico-químicas singulares, capaz de alterar profundamente las propiedades biofísicas de las membranas.La ceramida es también un lípido bioactivo, con un papel importante en diversos procesos celulares como proliferación, inflamación y apoptosis.Esta tesis se ha centrado en el estudio de las propiedades biofísicas de la ceramida empleando vesículas lipídicas como membranas modelo y valiéndose de diversas técnicas biofísicas, principalmente espectroscopía y microscopía de fluorescencia. La tesis se ha centrado en tres áreas principales: laidoneidad de análogos fluorescentes de ceramida para su uso como sondas de membrana, el efecto de laincorporación de ceramida y colesterol en membranas de fosfolípidos saturados y el efecto de lasceramidas sobre la integridad de la membrana y el mecanismo de permeabilización de las membranasinducido por la ceramida. Los resultados obtenidos en esta tesis contribuyen a una mejor comprensión de las propiedades de la ceramida y de su papel en las membranas celulares en condiciones tanto normales como patológicas

Membrane properties of ceramide: a fluorescence spectroscopic and microscopic study

159 p.Las membranas biológicas son complejas estructuras con una base lipídica y cruciales para lasupervivencia y función de las células. La ceramida es un lípido de membrana con unas característicasfísico-químicas singulares, capaz de alterar profundamente las propiedades biofísicas de las membranas.La ceramida es también un lípido bioactivo, con un papel importante en diversos procesos celulares como proliferación, inflamación y apoptosis.Esta tesis se ha centrado en el estudio de las propiedades biofísicas de la ceramida empleando vesículas lipídicas como membranas modelo y valiéndose de diversas técnicas biofísicas, principalmente espectroscopía y microscopía de fluorescencia. La tesis se ha centrado en tres áreas principales: laidoneidad de análogos fluorescentes de ceramida para su uso como sondas de membrana, el efecto de laincorporación de ceramida y colesterol en membranas de fosfolípidos saturados y el efecto de lasceramidas sobre la integridad de la membrana y el mecanismo de permeabilización de las membranasinducido por la ceramida. Los resultados obtenidos en esta tesis contribuyen a una mejor comprensión de las propiedades de la ceramida y de su papel en las membranas celulares en condiciones tanto normales como patológicas

Type I phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase homo- and heterodimerization determines its membrane localization and activity

Type I phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinases (PIP5KIs; α, β, and γ) are a family of isoenzymes that produce phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2] using phosphatidylinositol 4-phosphate as substrate. Their structural homology with the class II lipid kinases [type II phosphatidylinositol 5-phosphate 4-kinase (PIP4KII)] suggests that PIP5KI dimerizes, although this has not been formally demonstrated. Neither the hypothetical structural dimerization determinants nor the functional consequences of dimerization have been studied. Here, we used Förster resonance energy transfer, coprecipitation, and ELISA to show that PIP5KIβ forms homo- and heterodimers with PIP5KIγ_i2 in vitro and in live human cells. Dimerization appears to be a general phenomenon for PIP5KI isoenzymes because PIP5KIβ/PIP5KIα heterodimers were also detected by mass spectrometry. Dimerization was independent of actin cytoskeleton remodeling and was also observed using purified proteins. Mutagenesis studies of PIP5KIβ located the dimerization motif at the N terminus, in a region homologous to that implicated in PIP4KII dimerization. PIP5KIβ mutants whose dimerization was impaired showed a severe decrease in PI(4,5)P2 production and plasma membrane delocalization, although their association to lipid monolayers was unaltered. Our results identify dimerization as an integral feature of PIP5K proteins and a central determinant of their enzyme activity.—Lacalle, R. A., de Karam, J. C., Martínez-Muñoz, L., Artetxe, I., Peregil, R. M., Sot, J., Rojas, A. M., Goñi, F. M., Mellado, M., Mañes, S. Type I phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase homo- and heterodimerization determines its membrane localization and activity.J.C.d.K. is a Ph.D. fellow of the La Caixa Foundation International Fellowship Programme. This work was supported in part by the Spanish Ministry of Science and Innovation (SAF2011-24453) and the Comunidad de Madrid (IMMUNOTHERCAN; S2010/BMD-2326).Peer reviewe

Fluorescent Polyene Ceramide Analogues as Membrane Probes

Three ceramide analogues have been synthesized, with sphingosine-like chains containing five conjugated double bonds. Pentaene I has an <i>N-</i>palmitoyl acyl chain, while the other two pentaenes contain also a doxyl radical, respectively, at C5 (Penta5dox) and at C16 (Penta16dox) positions of the <i>N</i>-acyl chain. Pentaene I maximum excitation and emission wavelengths in a phospholipid bilayer are 353 and 478 nm, respectively. Pentaene I does not segregate from the other lipids in the way natural ceramide does, but rather mixes with them in a selective way according to the lipid phases involved. Fluorescence confocal microscopy studies show that when lipid domains in different physical states coexist, Pentaene I emission is higher in gel than in fluid domains, and in liquid-ordered than in liquid-disordered areas. Electron paramagnetic resonance of the pentaene doxyl probes confirms that these molecules are sensitive to the physical state of the bilayer. Calorimetric and fluorescence quenching experiments suggest that the lipids under study orient themselves in lipid bilayers with their polar moieties located at the lipid–water interface. The doxyl radical in the <i>N</i>-acyl chain quenches the fluorescence of the pentaene group when in close proximity. Because of this property, Penta16dox can detect gel–fluid transitions in phospholipids. The availability of probes for lipids in the gel phase is important in view of novel evidence for the existence of gel microdomains in cell membranes